劉夢培，李 佳，靳學(xué)遠(yuǎn)，王 霞，王維靜，縱 偉,

(1.鄭州輕工業(yè)大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，河南鄭州 450002；2.海南科技職業(yè)大學(xué)臨床醫(yī)藥學(xué)院，海南?？?571126)

杜仲(Eucommia ulmoidesOliv.)為杜仲科杜仲屬多年生落葉喬木，中國傳統(tǒng)中草藥，具有藥食同源性[1]。傳統(tǒng)多以皮入藥，造成數(shù)萬噸的杜仲葉腐爛損失[2]?，F(xiàn)代藥理研究表明，杜仲葉提取物具有抗炎、抑菌、降血壓及免疫調(diào)節(jié)等功效[3-5]，且通過對杜仲葉毒理學(xué)安全性實驗，驗證了其食用安全性[6]。所以，利用杜仲葉的保健功能來開發(fā)功能性食品成為目前研究的熱點。杜仲葉主要化學(xué)成分有木脂素類、環(huán)烯醚萜類、苯丙素類、黃酮類、多糖等化合物，包含多種單體化合物，在乳酸菌發(fā)酵杜仲提取液過程中伴隨著大分子降解、代謝合成和生物轉(zhuǎn)化等一系列生化反應(yīng)，產(chǎn)生有益人體健康的新產(chǎn)物，使乳酸菌數(shù)量升高的同時，發(fā)揮其補益功效[7-8]。向敏等[9]也研究發(fā)現(xiàn)乳酸菌發(fā)酵可以改善桑葉的青草、腥味等，產(chǎn)生令人愉悅的花果香。因此，本文通過乳酸菌發(fā)酵杜仲葉水提物改善其風(fēng)味，更易被人們接受。目前，對杜仲葉產(chǎn)品的研究較多集中在工藝、營養(yǎng)成分及理化性質(zhì)等方面，如張麗華等[2]研究了添加不同益生元對植物乳桿菌發(fā)酵杜仲鮮葉飲料的影響，王翔等[10]研究了杜仲葉干品的營養(yǎng)價值和抗氧化能力，但對香氣成分研究鮮為少見。

隨著檢測技術(shù)的發(fā)展，食品揮發(fā)性成分常用電子鼻技術(shù)(E-nose)和氣相色譜-質(zhì)譜(GC-MS)等分析方法進(jìn)行評價。電子鼻是利用氣體傳感器陣列的響應(yīng)圖案來識別氣味的電子系統(tǒng)，能快速識別簡單和復(fù)雜的揮發(fā)性成分[11]，與氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析食品的揮發(fā)性組分，從而對其總體信息氣味進(jìn)行全面評估。而同時蒸餾萃取(simultaneous distillationextraction，SDE)法提取揮發(fā)性成分具有良好的重復(fù)性和較高的萃取量，對微量成分提取效率高，便于定量分析[12]。目前針對杜仲葉揮發(fā)性成分分析多采用GC-MS方法分析，研究方向多集中在杜仲皮、葉在有機溶劑中提取的揮發(fā)油的成分差異[13-14]，而對杜仲葉提取液發(fā)酵后香氣物質(zhì)的差異性研究尚不深入。因此，本實驗選取4種乳酸菌菌種(植物乳桿菌、德式乳桿菌、嗜熱鏈球菌、嗜酸乳桿菌)，分別對杜仲葉水提液進(jìn)行發(fā)酵，采用SDE-GC-MS與電子鼻技術(shù)相結(jié)合的方式進(jìn)行測試分析，探索不同乳酸菌發(fā)酵的杜仲葉水提液香氣成分及發(fā)酵前后杜仲葉水提液香氣成分的差異性，旨在為杜仲葉發(fā)酵食品開發(fā)、風(fēng)味評價及工藝改進(jìn)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

杜仲葉 中國林科院杜仲研究基地；植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)GIM1.191 中國微生物菌種保藏中心；嗜熱鏈球菌(Streptococcus thermophilus)GIM1.540、德氏乳桿菌(Lactobacillus bulgaricus)GIM1.155、嗜酸乳桿菌(Lactobacillius acidophilus)GIM1.412 廣東省微生物菌種保藏中心；MRS瓊脂培養(yǎng)基、MRS肉湯培養(yǎng)基 北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；無水硫酸鈉(分析純) 國藥集團化學(xué)試劑有限公司；二氯甲烷(色譜純) 天津市富宇精細(xì)化工有限公司。

PAL-1數(shù)顯折光糖度儀 日本ATAGO公司；BPH-9272型精密恒溫培養(yǎng)箱 上海一恒科學(xué)儀器有限公司；JY92-2D型超聲波儀 寧波新芝生物科技有限公司；LDZX-50KBS型立式壓力蒸汽滅菌器 上海申安醫(yī)療器械廠；HC-3618R高速冷凍離心機 安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司；PEN3型便攜式電子鼻傳感器 德國Airsense公司；7890B-5977A氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀 美國安捷倫公司；JY92-2D同時蒸餾萃取裝置 鄭州華峰試劑有限公司；RE-52 AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海亞榮生化儀器廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 杜仲葉水提液制備 杜仲鮮葉50 ℃烘箱烘干，杜仲干葉與蒸餾水按1∶20的比例50 ℃超聲提取30 min，雙層紗布過濾[10,15]，加入6%蔗糖(碳源)和1%的菊粉(益生元)，121 ℃滅菌20 min，冷卻至37 ℃左右，涂布平板法檢查無菌后使用。

1.2.2 杜仲葉水提液發(fā)酵 將甘油保藏的4種乳酸菌分別按接種量1%(v/v)接種到滅菌后的MRS液體培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)48 h，活化2代后菌液離心(4 ℃，6000 r/min，15 min)，傾去培養(yǎng)基，用無菌水洗滌沉淀2～3次后得到菌泥，再將其轉(zhuǎn)入無菌水中振蕩均勻，活菌數(shù)可達(dá)到106CFU/mL，接種量4%(v/v)接種到杜仲葉水提液發(fā)酵(37 ℃，48 h)。

乳酸菌檢驗參照GB 4789.35-2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗 乳酸菌檢驗》[16]；杜仲葉發(fā)酵液的大腸桿菌檢驗參考GB 4789.3-2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)，食品微生物學(xué)檢驗，大腸菌群計數(shù)》[17]。

1.2.3 電子鼻傳感器檢測 PEN3型電子鼻傳感器由10種金屬氧化物半導(dǎo)體型化學(xué)傳感元件組成，不同傳感器的性能描述如表1所示。準(zhǔn)確量取5 mL不同樣品，放入樣品瓶，50 ℃水浴10 min后，插入電子鼻探頭吸取頂端空氣，測定揮發(fā)性物質(zhì)。電子鼻的設(shè)置參數(shù)為：樣品間隔時間1 s，清洗時間100 s，歸零時間5 s，樣品準(zhǔn)備時間5 s，測定時間80 s，載氣流速400 mL/min，進(jìn)樣流量400 mL/min。傳感信號在65 s后基本穩(wěn)定，選定采集信號時間為70 s，連續(xù)測定10次，利用電子鼻自帶的Win Muster軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行PCA及LoA。

表1 電子鼻傳感器名稱與其響應(yīng)物質(zhì)Table 1 Electronic nose sensors and their response to odorant compounds

1.2.4 SDE法萃取揮發(fā)性成分 取250 g杜仲發(fā)酵液，放入500 mL單口圓底燒瓶中，加入沸石，置于同時蒸餾裝置重相端，采用電熱套加熱，溫度控制在(100±1)℃范圍內(nèi)。另取50 mL色譜級二氯甲烷和適量沸石加入到100 mL圓底燒瓶中，置于同時蒸餾裝置輕相端，采用水浴加熱，溫度控制在(55±1)℃范圍內(nèi)，左側(cè)物料開始回流時計時，蒸餾萃取3 h。萃取結(jié)束后，收集有機溶劑萃取液，無水硫酸鈉對萃取液進(jìn)行干燥，冷藏過夜，過濾，將濾液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至約2 mL，進(jìn)行GC-MS檢測。

1.2.5 GC-MS分析條件 GC條件：HP-5MS型石英毛細(xì)柱(30 m×0.25 mm，0.25 μm)，進(jìn)樣口溫度250 ℃，載氣為He，載氣流量為1.0 mL/min；升溫程序：起始溫度40 ℃(保持2 min)，然后以3 ℃/min 的速度升到150 ℃(保持2 min)，再以6 ℃/min 的速率升到220 ℃(保持2 min)。進(jìn)樣方式：不分流，進(jìn)樣量0.5 μL。

MS條件：電子離子源，電子能量70 eV，離子源溫度230 ℃，四極桿溫度150 ℃，全掃描模式，掃描質(zhì)量范圍為50～550 amu，溶劑延遲3 min。檢索圖庫為NIST 2011。GC-MS測定結(jié)果通過NIST 2011圖庫檢索，并用峰面積歸一法測算各化學(xué)成分的相對含量。

1.2.6 氣味活度值(ROAV)的計算方法 參考姚遠(yuǎn)等[18]的方法，利用相對氣味活度值(ROAV)來描述發(fā)酵杜仲葉水提液香氣物質(zhì)對提取液主體風(fēng)味的貢獻(xiàn)，ROAV的計算公式如下:

式中，ROAVi代表各香氣組分相對氣味活度值；Ci和Ti分別為各香氣組分的相對含量(%)和香氣閾值(μg/kg)；Cmax和Tmax分別為對樣品風(fēng)味貢獻(xiàn)最大的香氣成分的相對含量(%)和香氣閾值(μg/kg)。

一般認(rèn)為，ROAV值越大的組分對樣品總體香氣的貢獻(xiàn)也越大。且ROAV≥1的物質(zhì)為所分析樣品的關(guān)鍵香氣成分。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Origin 9.5和SPSS Statistics 32軟件進(jìn)行處理并制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同乳酸菌發(fā)酵杜仲葉水提液的香氣風(fēng)味區(qū)分度分析

2.1.1 主成分分析(PCA) 主成分分析(Principal component analysis，PCA)是一種多元統(tǒng)計方法，用于解釋樣本之間的差異，通過電子鼻傳感器對樣品提取信息，降低數(shù)據(jù)矩陣的維數(shù)，建立了傳感器與風(fēng)味特征之間的相關(guān)性，得出貢獻(xiàn)率最大和最主要的因子[19-20]。一般來說，貢獻(xiàn)率越高，主成分反映原始多指標(biāo)信息越好，總貢獻(xiàn)率超過85%表明了方法的可行性[21]。從圖1可以看出，第1主成分貢獻(xiàn)率為89.43%，第2主成分貢獻(xiàn)率為10.18%，累積貢獻(xiàn)率為99.61%，大于95%，表明2個主成分已經(jīng)能夠反映樣品的整體信息，可以代表樣品揮發(fā)性風(fēng)味的主要特征。同時每組樣品測定數(shù)據(jù)在橫、縱坐標(biāo)上聚集度較高，說明同組樣品的穩(wěn)定性和重復(fù)性較好[22]。因此，PCA方法適用于不同乳酸菌發(fā)酵杜仲葉水提液后樣品揮發(fā)性成分分析。

圖1 不同乳酸菌發(fā)酵杜仲水提液后揮發(fā)性成分PCA圖Fig.1 Linear discriminant analysis of volatile components of water extract of Eucommia ulmoides leaf fermented by different Lactobacillus species

通過比較各組圖形的的橫縱坐標(biāo)發(fā)現(xiàn)，德式乳桿菌和嗜酸乳桿菌發(fā)酵后的杜仲葉水提液第1、2主成分差異不大，說明這兩種菌發(fā)酵后的風(fēng)味較為接近，而未發(fā)酵的杜仲葉水提液與其他4種乳酸菌發(fā)酵的杜仲葉水提液第1、2主成分差異較為明顯，說明乳酸菌發(fā)酵后的風(fēng)味與其未發(fā)酵風(fēng)味差別較明顯。結(jié)合表2所示，區(qū)分指數(shù)越接近1說明區(qū)分度越大，區(qū)分越明顯。結(jié)合主成分分析圖可以清晰地看出植物乳桿菌發(fā)酵組、德式乳桿菌發(fā)酵組、嗜酸乳桿菌發(fā)酵組、嗜熱鏈球菌發(fā)酵組有明顯的區(qū)分，且與未發(fā)酵組有明顯區(qū)別。因此，利用電子鼻來區(qū)分不同乳酸菌發(fā)酵杜仲葉水提液的風(fēng)味是非常有效的方法。

表2 不同乳酸菌發(fā)酵杜仲水提液電子鼻風(fēng)味檢測的判別指數(shù)Table 2 Discriminant index of e-nose flavor of water extract of Eucommia ulmoides leaf fermented by different Lactobacillus species

2.1.2 載荷分析(LoA) LoA(Loading Analysis)分析法，主要是對傳感器進(jìn)行研究，利用該分析法可以確定該實驗條件下傳感器的相對重要性，即樣品區(qū)分過程中哪一類氣味起主要區(qū)分作用[23]。如圖2所示，若單個傳感器的響應(yīng)值越偏離于零，說明該傳感器在識別中作用較大，從而確認(rèn)為識別傳感器[24]，結(jié)合圖2可得7號(對硫化物靈敏)和9號(芳香成分，對有機硫化物靈敏)傳感器對第一主成分區(qū)分貢獻(xiàn)率最大，6號(對甲基類靈敏)和8號(對醇類、醛酮類靈敏)傳感器對第二主成分區(qū)分貢獻(xiàn)率最大；若單個傳感器橫、縱坐標(biāo)的響應(yīng)值趨近于零，則此傳感器的識別作用較小可以忽略，即傳感器1、2、3、4、5、10響應(yīng)較小，對區(qū)分所起作用不明顯；總體來說傳感器6、7、8、9號發(fā)揮了較大的作用，即未發(fā)酵組與4組不同菌種發(fā)酵杜仲水提液的風(fēng)味差異主要體現(xiàn)在硫化物、醇類、醛酮類、芳香類物質(zhì)等。這表明在進(jìn)行更深一步分析時，可以著重對響應(yīng)大的6、7、8、9號傳感器對應(yīng)的風(fēng)味化合物種類進(jìn)行分析。因此，可以通過電子鼻分析來輔助區(qū)分不同乳酸菌發(fā)酵杜仲葉水提液的風(fēng)味，與氣相色譜分析法相互驗證。

圖2 不同乳酸菌發(fā)酵杜仲水提液后揮發(fā)性成分LoA分析圖Fig.2 Loading analysis of volatile components of water extract of Eucommia ulmoides leaf fermented by different Lactobacillus species

2.2 不同乳酸菌發(fā)酵杜仲葉水提液的香氣成分差異性比較

圖3是主要香氣化合物的類別分析。經(jīng)SDEGC-MS分離和鑒定，未發(fā)酵揮發(fā)性成分共鑒定出31種，以醛類相對含量最高，為14.36%。4種乳酸菌發(fā)酵的杜仲葉水提液揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)差異明顯，其中植物乳桿菌發(fā)酵后鑒定出的揮發(fā)性成分為45種，以酮類相對含量最高，為18.83%；德式乳桿菌發(fā)酵后鑒定出的揮發(fā)性成分為38種，以雜環(huán)類相對含量最高，為24.84%；嗜熱鏈球菌和嗜酸乳桿菌發(fā)酵后鑒定出的揮發(fā)性成分分別為43、51種，均以醇類相對含量最高，分別為14.15%和19.03%。乳酸菌發(fā)酵對杜仲葉水提液的揮發(fā)性物質(zhì)具有一定的影響，且四種菌種發(fā)酵有明顯的區(qū)分，主要集中在醇類、醛類、酮類、雜環(huán)類物質(zhì)，這與電子鼻PCA和LoA結(jié)果相一致。經(jīng)乳桿菌發(fā)酵后的杜仲提取液，不僅揮發(fā)性成分?jǐn)?shù)量較多，且主要香氣成分含量增加顯著，更有利于杜仲葉香氣提升。

圖3 不同乳酸菌發(fā)酵杜仲水提液后揮發(fā)性成分類別分析Fig.3 Loading analysis of volatile components of water extract of Eucommia ulmoides leaf fermented by different Lactobacillus species

2.3 不同乳酸菌種發(fā)酵杜仲葉水提液的香氣特征分析

不同菌種發(fā)酵的杜仲葉水提液在相同條件下用G C-MS檢測的定性和定量結(jié)果見表3。

表3 不同乳酸菌發(fā)酵杜仲葉水提液后揮發(fā)性成分的種類及相對含量Table 3 Species and relative contents of volatile components in Eucommia ulmoides leaf fermented by different Lactobacillus

續(xù)表3

2.3.1 醇類物質(zhì) 醇類物質(zhì)是乳酸菌發(fā)酵過程中一類重要的揮發(fā)性香氣成分，大部分醇類物質(zhì)的感知閾值較高，只有少量的高級醇能夠賦予淡雅的花果香氣[30]。4種乳酸菌發(fā)酵杜仲葉水提液揮發(fā)性成分中醇類物質(zhì)均含有反-3-己烯醇、3-呋喃甲醇、苯甲醇、芳樟醇、苯乙醇、alpha-松油醇等。與未發(fā)酵液相比，苯甲醇、芳樟醇、苯乙醇、alpha-松油醇等香氣成分含量明顯提高。具有青草香氣[29]的反-3-己烯醇，在嗜熱鏈球菌發(fā)酵液中相對含量最高為4.9911%；3-呋喃甲醇在植物乳桿菌發(fā)酵后相對含量最高，為4.1968%；具有甜果香的苯甲醇和玫瑰香[26]的苯乙醇，在嗜酸乳桿菌發(fā)酵液中相對含量較高，分別為5.4991%、2.3751%；具有木青[31]和紫羅蘭香氣[32]的芳樟醇、alpha-松油醇，在德式乳桿菌發(fā)酵液中相對含量最高，分別為1.9920%、0.6162%。

2.3.2 醛類物質(zhì) 醛類物質(zhì)多為花香及果香，為杜仲葉復(fù)雜的清香氣味提供了積極貢獻(xiàn)。4種乳酸菌發(fā)酵樣品揮發(fā)性成分中醛類物質(zhì)均有3-糠醛、反式-2-己烯醛、反,反-2,4-庚二烯醛、桂皮醛。具有青香、蔬菜香[32]的反,反-2,4-庚二烯醛在未發(fā)酵液中相對含量最高為5.7457%；具有芳香氣[33]的桂皮醛和3-糠醛在植物乳桿菌發(fā)酵后相對含量最高，分別為4.5180%、5.0227%；具有綠葉清香[34]的反式-2-己烯醛在德式乳桿菌發(fā)酵后相對含量最高，為3.4281%；具有杏仁味及花香[26]的苯甲醛、苯乙醛在嗜熱鏈球菌、嗜酸乳桿菌發(fā)酵后檢測出，而在其它3組中未測出。且嗜熱鏈球菌發(fā)酵液中苯甲醛、苯乙醛相對含量較高，分別為2.2924%、1.1134%。

2.3.3 酮類物質(zhì) 酮類物質(zhì)性質(zhì)穩(wěn)定，并且香氣持久，一般具有花香氣味。4種發(fā)酵杜仲葉水提液揮發(fā)性成分中共有的酮類物質(zhì)有大馬士酮、Alpha-大馬酮、二氫-α-紫羅蘭酮、α-異甲基紫羅蘭酮等(前兩者都具有類似玫瑰的芳香，后兩者具有紫羅蘭香氣[35])，但含量差距較大。大馬士酮和二氫-α-紫羅蘭酮在德式乳桿菌發(fā)酵液中相對含量最高分別為6.9427%和3.4499%；Alpha-大馬酮在未發(fā)酵液中相對含量最高為1.4008%；在所有甲基紫羅蘭酮中香氣最佳[36]的α-異甲基紫羅蘭酮在植物乳桿菌發(fā)酵后相對含量最高為0.7623%。

2.3.4 其他類化合物 其他類化合物中雜環(huán)類物質(zhì)在發(fā)酵前后的杜仲提取液中相對含量較高，可能是由于SDE法在加熱過程中促使美拉德反應(yīng)加劇生成一些許多含氮雜環(huán)化合物，如呋喃、吡喃、吡咯衍生物等[37]。酯類、酚類、酸類、烴類物質(zhì)在發(fā)酵前后的杜仲提取液所占比例雖然較低，但是因其閾值不同，對杜仲液發(fā)酵后的風(fēng)味同樣起到重要作用。酯類物質(zhì)多為花、果香。德氏乳桿菌發(fā)酵液中酯類物質(zhì)相對含量較高，占總揮發(fā)性成分的2.4596%。具有果香氣[38]的2,4-二叔丁基苯酚在嗜熱鏈球菌發(fā)酵液中的相對含量是所有酚類物質(zhì)里最高(3.5945%)。具有奶酪、酯香味[26]的己酸是植物乳桿菌發(fā)酵液特有的物質(zhì)(相對含量0.5020%)。嗜熱鏈球菌發(fā)酵液中檢測到的苯乙烯是烴類物質(zhì)中相對含量最高的為2.2924%。

2.4 不同乳酸菌種發(fā)酵杜仲葉水提液的關(guān)鍵香氣成分分析

采用ROAV分析發(fā)酵杜仲葉水提液中主要香氣物質(zhì)對發(fā)酵液總體風(fēng)味的貢獻(xiàn)程度。根據(jù)表3中部分發(fā)酵液風(fēng)味物質(zhì)的香氣閾值和相對含量，以德式乳桿菌發(fā)酵液中的大馬士酮為ROAVmax=100，并計算樣品中其它風(fēng)味物質(zhì)的ROAV，計算結(jié)果見表4。

未發(fā)酵的提取液有6種關(guān)鍵香氣成分，對其風(fēng)味貢獻(xiàn)率大小依次為苯乙醛、大馬士酮、芳樟醇、反,反-2,4-庚二烯醛、3-糠醛、反式-2-己烯醛；植物乳桿菌發(fā)酵液有7種關(guān)鍵香氣成分，對其風(fēng)味貢獻(xiàn)率大小依次為大馬士酮、3-糠醛、芳樟醇、二氫-α-紫羅蘭酮、桂皮醛、反,反-2,4-庚二烯醛、反式-2-己烯醛；德式乳桿菌發(fā)酵液有7種關(guān)鍵香氣成分，對其風(fēng)味貢獻(xiàn)率大小依次為大馬士酮、芳樟醇、二氫-α-紫羅蘭酮、反式-2-己烯醛、3-糠醛、反,反-2,4-庚二烯醛、桂皮醛；嗜熱鏈球菌發(fā)酵液有8種關(guān)鍵香氣成分，對其風(fēng)味貢獻(xiàn)率大小依次為大馬士酮、苯乙醛、芳樟醇、二氫-α-紫羅蘭酮、3-糠醛、反,反-2,4-庚二烯醛、反式-2-己烯醛、2,4-二叔丁基苯酚；嗜酸乳桿菌發(fā)酵液有9種關(guān)鍵香氣成分，對其風(fēng)味貢獻(xiàn)率大小依次為大馬士酮、芳樟醇、3-糠醛、苯乙醛、二氫-α-紫羅蘭酮、對乙烯基愈瘡木酚、反,反-2,4-庚二烯醛、桂皮醛、反式-2-己烯醛，其中對乙烯基愈瘡木酚是嗜酸乳桿菌發(fā)酵液所特有的關(guān)鍵香氣成分。

大馬士酮、反,反-2,4-庚二烯醛、芳樟醇、3-糠醛、反式-2-己烯醛為5種樣品共有關(guān)鍵香氣成分，提供了主體的花香、果香和青葉香。具有綠葉青香的反,反-2,4-庚二烯醛、反式-2-己烯醛在未發(fā)酵提取液中貢獻(xiàn)率較高，在發(fā)酵后的樣品中明顯下降。另外，發(fā)酵后產(chǎn)生獨特花香氣的二氫-α-紫羅蘭酮，說明發(fā)酵過程不僅可以增加主體香氣，還可以降低原本杜仲葉的青葉味，產(chǎn)生更濃郁的花香。

3 結(jié)論與討論

通過SDE-GC-MS聯(lián)用技術(shù)對乳酸菌發(fā)酵杜仲葉水提液的揮發(fā)性成分進(jìn)行分析，研究結(jié)果表明，未發(fā)酵杜仲葉提取液的揮發(fā)性成分共鑒定出31種，以醛類相對含量最高(14.3591%)；植物乳桿菌發(fā)酵后鑒定出的揮發(fā)性成分為45種，以酮類相對含量最高(18.8255%)；德式乳桿菌發(fā)酵后鑒定出的揮發(fā)性成分為38種，以雜環(huán)類相對含量最高(25.7828%)；嗜熱鏈球菌和嗜酸乳桿菌發(fā)酵后鑒定出的揮發(fā)性成分分別為43和51種，均以醇類相對含量最高(14.1481%和18.3376%)。與未發(fā)酵杜仲葉提取液相比，嗜酸乳桿菌、植物乳桿菌、德氏乳桿菌、嗜熱鏈球菌發(fā)酵后揮發(fā)性成分分別增加20、14、7、12種；4類主要揮發(fā)性物質(zhì)相對含量分別增加了2、2、2.4、1.2倍。因此，經(jīng)乳酸菌發(fā)酵后的杜仲葉提取液，不僅揮發(fā)性成分?jǐn)?shù)量較多，且主要香氣成分含量增加顯著，更有利于杜仲葉提取液香氣提升。通過電子鼻分析，PCA和LoA主成分貢獻(xiàn)率均大于95%，香氣成分差異與SDE-GC-MS檢測結(jié)果相一致。

由ROAV分析可知，未發(fā)酵的杜仲葉提取液關(guān)鍵香氣成分有6種，植物乳桿菌、德式乳桿菌、嗜熱鏈球菌和嗜酸乳桿菌發(fā)酵的杜仲葉提取液關(guān)鍵香氣成分依次為7、7、8和9種，其中大馬士酮、反,反-2,4-庚二烯醛、芳樟醇、3-糠醛、反式-2-己烯醛為它們共有的香氣成分。具有綠葉青香的反,反-2,4-庚二烯醛，反式-2-己烯醛在未發(fā)酵杜仲葉提取液中含量較高，發(fā)酵后顯著下降。另外，發(fā)酵后產(chǎn)生獨特花香氣的二氫-α-紫羅蘭酮，不僅可以增加主體香氣，還可以降低原本杜仲葉的青葉味，產(chǎn)生更濃郁的花香。研究結(jié)果為杜仲葉相關(guān)產(chǎn)品的研發(fā)提供了參考依據(jù)。

表4 不同乳酸菌發(fā)酵杜仲葉水提液后關(guān)鍵香氣成分分析Table 4 Analysis of key odor compounds in water extract of Eucommia ulmoides leaf fermented by different Lactobacillus