包君麗 韓宇博 張可 高欣元 彭坤明 劉莉

摘要 目的：基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接方法探討黃連溫膽湯治療Z綜合征的可能作用機(jī)制。方法：在中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺(tái)（TCMSP）及中藥成分?jǐn)?shù)據(jù)庫（TCMID）篩選并收集黃連溫膽湯的活性成分及其對(duì)應(yīng)靶標(biāo)。利用Uniprot數(shù)據(jù)庫獲取藥物活性成分對(duì)應(yīng)靶標(biāo)的基因，并與通過人類基因組注釋數(shù)據(jù)庫（GeneCards）和《人類孟德爾遺傳》數(shù)據(jù)庫（OMIM）所獲得的人Z綜合征（OSAS合并MS）相關(guān)基因進(jìn)行比較，獲得黃連溫膽湯與Z綜合征重合的潛在作用靶標(biāo)基因。使用Cytoscape3.7.2軟件繪制黃連溫膽湯的“疾病-藥物-成分-靶標(biāo)-通路”網(wǎng)絡(luò)圖。通過String數(shù)據(jù)庫獲取潛在作用靶標(biāo)之間的相互作用數(shù)據(jù)表，然后導(dǎo)入Cytoscape3.7.2軟件構(gòu)建靶蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)圖。然后基于bioconductor提供的人類基因注釋數(shù)據(jù)庫org.Hs.eg.db，利用R語言的clusterfiler程序包對(duì)黃連溫膽湯治療Z綜合征的潛在作用靶標(biāo)進(jìn)行GO分類富集分析和KEGG通路富集分析。結(jié)果：得到黃連溫膽湯治療Z綜合征有134個(gè)候選活性成分，包括木犀草素、槲皮素、黃芩素、小檗堿、黃芩苷等;65個(gè)潛在作用靶標(biāo)，包括AKT1、IL6、VEGFA和MMP-9等;116條通路，包括MAPK，核因子-κB，PI3K-Akt，Toll樣受體等信號(hào)通路。分子對(duì)接表明，木犀草素、槲皮素、黃芩素可與3個(gè)關(guān)鍵候選靶蛋白（IL-6、AKT1、MMP-9）有較好的結(jié)合性。結(jié)論：黃連溫膽湯可能通過作用于IL6、VEGFA和MMP-9等靶標(biāo)及MAPK，核因子-κB，PI3K-Akt，Toll樣受體等信號(hào)通路干預(yù)Z綜合征的發(fā)生發(fā)展。

關(guān)鍵詞 黃連溫膽湯;Z綜合征;異病同治;網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué);分子對(duì)接

Research on the Mechanism of Huanglian Wendan Decoction in the Treatment of Z Syndrome Based on Network Pharmacology and Molecular Docking

BAO Junli1，HAN Yubo2，ZHANG Ke1，GAO Xinyuan3，PENG Kunming3，LIU Li2

（1 Heilongjiang University of Traditional Chinese Medicine，Harbin 150036，China; 2 First Affiliated Hospital，Heilongjiang University of Traditional Chinese Medicine，Harbin 150036，China; 3 University of Chinese Academy of Sciences Shenzhen Hospital，Shenzhen 518106，China）

Abstract Objective：To explore the possible mechanism of Huanglian Wendan Decoction in the treatment of Z syndrome based on network pharmacology and molecular docking.Methods：The active components and their corresponding targets of Huanglian Wendan Decoction were screened and collected on TCMSP and TCMID.Using UniProt database to obtain the target genes of the active components of drugs.Compared with the genes of human Z syndrome （OSAS combined with MS） obtained from the Genecards and OMIM databases，the potential target genes of Huanglian Wendan Decoction overlapped with Z syndrome were obtained.The network diagram of “disease-drug-component-target-pathway” of Huanglian Wendan Decoction was drawn by using the software of Cytoscape 3.7.2.The interaction data table between potential targets was obtained through string database，and then the interaction network diagram of target proteins was constructed by importing the software of Cytoscape 3.7.2.Then，based on the human gene annotation database org.Hs.eg.db provided by Bioconductor，the cluster filer package of R language was used to analyze the potential target of Huanglian Wendan Decoction in the treatment of Z syndrome by going classification enrichment analysis and KEGG pathway enrichment analysis.Results：There were 134 candidate active components，including luteolin，quercetin，scutellarin，baicalin，etc.; 65 potential targets，including AKT1，IL6，VEGFA and MMP-9; 116 pathways，including MAPK，NF kappa B，PI3K Akt，toll-like receptor and other signal pathways.Molecular docking showed that luteolin，quercetin and baicalein could bind to 3 key candidate target proteins （IL-6，AKT1 and MMP-9）.Conclusion：Based on the network pharmacology method and molecular docking，the therapeutic target and signal pathway of Huanglian Wendan Decoction in the treatment of Z syndrome are excavated，which provides a new research method for the study of the mechanism of Huanglian Wendan Decoction in the treatment of OSAS，and also provides a new idea for the further study of the mechanism of treating different diseases with the same therapeutic principle in traditional Chinese medicine.

Keywords Huanglian Wendan Decoction; Z syndrome; Treatment of different diseases with the same therapeutic principle; Network pharmacology; Molecular docking

中圖分類號(hào)：R285.5;R284文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2021.03.009

阻塞性睡眠呼吸暫停綜合征（Obstructive Sleep Apnea Syndrome，OSAS）與代謝綜合征（Metabolic Syndrome，MS）常合并出現(xiàn)。OSAS合并MS被命名為Z綜合征[1]。目前對(duì)Z綜合征的研究還處于初始階段，尚沒有單獨(dú)針對(duì)Z綜合征的有效治療方案，而且OSAS和MS的單獨(dú)西醫(yī)治療方案也并不理想。持續(xù)氣道正壓（Continuous Positive Airway Pressure，CPAP）治療是OSAS最常見和最有效的治療方法。然而CPAP治療的并發(fā)癥可能包括充血、流鼻涕、口干或流鼻血[2]，而且依從性差限制了臨床應(yīng)用和療效[3]。目前對(duì)MS還沒有公認(rèn)的方法和藥物可以全面改善和治療。近些年來，中醫(yī)藥治療OSAS和MS的研究取得了不錯(cuò)的進(jìn)展[4]。臨床研究已證實(shí)了黃連溫膽湯對(duì)OSAS和MS的療效顯著[5-9]。OSAS和MS在病機(jī)證候相似度甚高，符合中醫(yī)的異病同治原則?！爱惒⊥巍笔侵嗅t(yī)臨床的重要治則，即在不同疾病的發(fā)展過程中，出現(xiàn)了一樣或者類似的證候，運(yùn)用同樣的治法治療疾病。

我們臨證時(shí)用黃連溫膽湯治療MS時(shí)，患者的睡眠質(zhì)量得到改善;再加上前期網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究黃連溫膽湯治療OSAS和MS的機(jī)制時(shí)，發(fā)現(xiàn)很多基因和通路相同，我們希望通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)去探究黃連溫膽湯對(duì)Z綜合征的作用機(jī)制，為黃連溫膽湯對(duì)Z綜合征的治療提供新的思路。

目前，將網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法運(yùn)用到異病同治的研究還較少。本研究首先篩選黃連溫膽湯的有效活性成分，預(yù)測(cè)其治療Z綜合征的相關(guān)靶基因，構(gòu)建“疾病-藥物-成分-靶標(biāo)-通路”網(wǎng)絡(luò)圖，全面分析探討黃連溫膽湯治療Z綜合征的可能作用機(jī)制。再將黃連溫膽湯中的活性成分與Z綜合征關(guān)鍵靶標(biāo)蛋白進(jìn)行模擬結(jié)合研究。

1 資料與方法

1.1 資料來源

1.1.1 藥物活性成分的收集

為收集黃連溫膽湯中8種藥材的化合物成分，我們利用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫（TCMSP，http：//lsp.nwu.edu.cn/TCMSP.php）[10]以黃連溫膽湯全方藥物“黃連”“枳實(shí)”“茯苓”“竹茹”“半夏”“甘草”“生姜”為關(guān)鍵詞進(jìn)行檢索，再將藥物篩選閾值設(shè)定為口服生物利用度（OB）≥30%，成藥相似性（DL）≥0.18，獲得黃連溫膽湯的有效化合物成分信息。此外，還利用中醫(yī)藥綜合數(shù)據(jù)庫（TCMID，http：//183.129.215.33/TCMID/search/）[11]檢索了TCMSP數(shù)據(jù)庫中未收錄的中藥的化合物成分。

1.1.2 活性成分候選靶標(biāo)對(duì)應(yīng)基因的收集

為了收集黃連溫膽湯主要化合物的相應(yīng)靶點(diǎn)，采用了幾種方法。首先，在TCMSP數(shù)據(jù)庫中找到的化合物，我們選擇TCMSP數(shù)據(jù)庫來獲取靶標(biāo)蛋白的名稱;在TCMID數(shù)據(jù)庫找到的化合物，則通過Stitch數(shù)據(jù)庫（Stitch，http：//Stitch.embl.de/，ver）[12]尋找相應(yīng)的靶標(biāo)蛋白。然后，登錄Uniprot數(shù)據(jù)庫（https：//www.un iprot.org/）[13]將生物物種限定為“human（人）”，數(shù)據(jù)類型設(shè)定為Reviewed，以候選靶標(biāo)全稱分別檢索，獲取靶標(biāo)對(duì)應(yīng)基因名稱及UniprotKB。

1.1.3 Z綜合征相關(guān)靶標(biāo)基因的收集

通過人類基因組注釋（Genome Annotation）數(shù)據(jù)庫（https：//www.genecards.org/）[14]以關(guān)鍵詞“Obstructive sleep apnea”O(jiān)R“Obstructive sleep apnea syndrome”O(jiān)R“Obstructive sleep apnea hypopnea syndrome”檢索OSAS相關(guān)靶標(biāo)基因，并設(shè)定相關(guān)性分?jǐn)?shù)>20，獲得OSAS相關(guān)基因;通過在線《人類孟德爾遺傳》數(shù)據(jù)庫（https：//omim.org/）[15]以同樣的關(guān)鍵詞檢索OSAS相關(guān)靶標(biāo)基因。將這2個(gè)數(shù)據(jù)庫搜索獲得的靶標(biāo)基因匯總?cè)ブ孬@得OSAS靶標(biāo)基因。在GeneCards數(shù)據(jù)庫以關(guān)鍵詞“metabolic syndrome”檢索MS相關(guān)靶標(biāo)基因，并設(shè)定相關(guān)性分?jǐn)?shù)>20，獲得MS相關(guān)基因。將MS和OSAS的靶標(biāo)基因匯總?cè)ブ?，再利用“R語言”的VennDiagram函數(shù)與黃連溫膽湯主要活性成分所對(duì)應(yīng)的候選靶標(biāo)基因取交集，獲取共有基因作為黃連溫膽湯治療Z綜合征的潛在作用靶標(biāo)。

1.2 方法

1.2.1 活性成分-作用靶標(biāo)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析

首先剔除重復(fù)及與疾病沒有相關(guān)性的靶點(diǎn)，再將剩余的藥物活性成分與治療Z綜合征的潛在作用靶標(biāo)及相關(guān)通路輸入Excel，再導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2軟件，構(gòu)建活性成分-作用靶標(biāo)網(wǎng)絡(luò)圖，展現(xiàn)藥物活性成分與作用Z綜合征靶標(biāo)間的相互關(guān)系。

1.2.2 靶蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)互相作用網(wǎng)絡(luò)圖構(gòu)建

將黃連溫膽湯治療Z綜合征的潛在作用靶標(biāo)導(dǎo)入String數(shù)據(jù)庫（https：//string-db.org/）[16]。將所得數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape3.7.2軟件進(jìn)行可視化處理，通過cytoNCA插件計(jì)算度中心度（DC），中介中心度（BC）。這些參數(shù)可以衡量拓?fù)渚W(wǎng)絡(luò)的重要性。

1.2.3 GO富集及KEGG通路分析

將黃連溫膽湯治療Z綜合征的潛在作用靶標(biāo)基因利用R語言的Clusterprofiler程序包P_Value≤0.05進(jìn)行GO基因富集分析和KEGG通路富集分析，設(shè)定得到相應(yīng)的分子功能（MF）、生物學(xué)過程（BP）、細(xì)胞組成（CC）及KEGG通路相關(guān)數(shù)據(jù)，然后為提高相關(guān)通路的置信度，篩選富集到通路的基因比例大于13.85%，然后將所得KEGG數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape3.7.2進(jìn)行可視化圖形繪制。

1.2.4 分子對(duì)接

從PDB蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫（http：//www.pdb.org/）[17]下載黃連溫膽湯重要化合物結(jié)合的候選蛋白質(zhì)的晶體結(jié)構(gòu)，并用MOE軟件進(jìn)行修飾，以去除配體、添加氫、去除水、優(yōu)化和修補(bǔ)氨基酸，并使所有候選靶點(diǎn)的能量最小化。使用MOE來測(cè)試黃連溫膽湯化合物與候選靶蛋白之間的對(duì)接精度，因?yàn)樗哂休^高的準(zhǔn)確性和一致性。最佳對(duì)接狀態(tài)為預(yù)測(cè)構(gòu)象與觀測(cè)X射線晶體構(gòu)象的均方根偏差（RMSD）最小。RMSD≤4的模型被認(rèn)為是可靠的，RMSD≤2的模型被認(rèn)為是準(zhǔn)確的。整體評(píng)估的最終得分是E_score2，對(duì)應(yīng)的數(shù)值越小，分子之間的結(jié)合能越小，這意味著兩者之間有較好的結(jié)合性（一般小于-5）。同時(shí)，用不同的顏色標(biāo)記小分子的結(jié)構(gòu)，可以觀察到兩者之間的結(jié)構(gòu)空間有較大的重復(fù)區(qū)域，這證明了小分子構(gòu)象與配體之間有很大的相似性。

2 結(jié)果

2.1 黃連溫膽湯候選活性成分及候選靶標(biāo)

TCMSP數(shù)據(jù)庫中檢索得到活性成分：黃連48，枳實(shí)65個(gè)，茯苓34個(gè)，半夏116個(gè)，生姜265個(gè)，甘草280個(gè)，再根據(jù)藥物動(dòng)力學(xué)特點(diǎn)設(shè)定閾值OB≥30%，DL≥0.18后，篩選出黃連候選成分14個(gè)，枳實(shí)候選成分22個(gè)，茯苓候選成分15個(gè)，半夏候選成分13個(gè)，生姜候選成分5個(gè)，甘草候選成分92個(gè)，同時(shí)在平臺(tái)檢索這些候選活性成分的靶標(biāo)。通過TCMID數(shù)據(jù)庫檢索到竹茹活性成分3個(gè)—organic acids，glucides，amino acids，再去stitch數(shù)據(jù)庫（http：//stitch.embl.de/）中檢索活性成分的靶標(biāo)。剔除重復(fù)的和沒有靶基因的活性成分，共計(jì)134個(gè)。

2.2 藥物活性成分治療Z綜合征候選靶標(biāo)預(yù)測(cè)

通過Uniprot數(shù)據(jù)庫，獲得黃連溫膽湯244個(gè)候選靶標(biāo)的相應(yīng)基因。GeneCards數(shù)據(jù)庫中所得OSAS相關(guān)基因665個(gè)（相關(guān)性分?jǐn)?shù)>20），OMIM數(shù)據(jù)庫所得OSAS相關(guān)基因623個(gè)，去重后共得OSAS相關(guān)基因1 251個(gè);GeneCards數(shù)據(jù)庫中所得MS相關(guān)基因1 107個(gè)（相關(guān)性分?jǐn)?shù)>20）。將OSAS相關(guān)基因和MS相關(guān)基因匯總?cè)〗患?，得到共有基因，也就是Z綜合征相關(guān)基因508個(gè)。將黃連溫膽湯候選靶標(biāo)與Z綜合征候選靶標(biāo)做比較篩選出可能與Z綜合征有關(guān)作用靶標(biāo)65個(gè)。篩選過程見圖1。具體靶標(biāo)信息見表1。

2.3 疾病-藥物-成分-靶標(biāo)-通路網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將黃連溫膽湯藥物活性成分和與Z綜合征相關(guān)的作用靶標(biāo)導(dǎo)入Cytoscape3.7.2軟件，構(gòu)建疾病-藥物-成分-靶標(biāo)網(wǎng)絡(luò)。所構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)共包括298個(gè)節(jié)點(diǎn)，其中134個(gè)活性成分節(jié)點(diǎn)，65個(gè)作用靶標(biāo)節(jié)點(diǎn)，1 379條邊線。黃連溫膽湯主要通過多成分對(duì)應(yīng)多靶標(biāo)來發(fā)揮對(duì)Z綜合征的治療作用。見圖2。

2.4 靶蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)圖

將黃連溫膽湯治療Z綜合征潛在作用靶標(biāo)基因?qū)隨tring蛋白互作網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫（https：//string-db.org/cgi/）獲取靶蛋白質(zhì)相互作用關(guān)系圖，將其導(dǎo)入Cytoscape3.7.2軟件，利用cytoNCA插件計(jì)算網(wǎng)絡(luò)的DC，BC等值，共計(jì)有65個(gè)節(jié)點(diǎn)，911條邊，DC值介于1～54，BC值介于0～224，CC值介于0.35～0.84，DC平均值為28（圖3A）。再選擇DC大于28的節(jié)點(diǎn)，共計(jì)34個(gè)（圖3B綠色節(jié)點(diǎn)），生成子網(wǎng)絡(luò)（圖3C）。再選擇DC大于35，BC大于8.13的節(jié)點(diǎn)，共計(jì)7個(gè)（圖3C綠色節(jié)點(diǎn)），提示這7個(gè)靶標(biāo)基因是黃連溫膽湯治療Z綜合征的重點(diǎn)基因。

2.5 黃連溫膽湯中化合物對(duì)應(yīng)潛在靶標(biāo)基因生物功能及通路分析

GO富集分析結(jié)果顯示，生物過程（Biological Process，BP）分析富集基因數(shù)量排在前幾位的有氧化應(yīng)激反應(yīng)（Response to Oxidative Stress）、對(duì)脂多糖的反應(yīng)（Response to Lipopolysaccharide）、對(duì)活性氧的反應(yīng)（Response to Reactive Oxygen Species）、對(duì)細(xì)菌來源分子的反應(yīng)（Response to Molecule of Bacterial Origin）、小分子代謝過程的正調(diào)控（Positive Regulation of Small Molecule Metabolic Process）等（圖4）;細(xì)胞分組（Cellular Component，CC）分析中富集基因數(shù)量排在前幾位的有膜筏（Membrane Raft）、膜微區(qū)（Membrane Microdomain）、膜區(qū)（Membrane Region）、囊腔（Vesicle Lumen）、細(xì)胞質(zhì)囊腔（Cytoplasmic Vesicle Lumen）等（圖5）;分子功能（Molecular Function，MF）分析富集基因數(shù)量排在前幾位的有細(xì)胞因子受體結(jié)合（Cytokine Receptor Binding）、細(xì)胞因子活性（Cytokine Activity）、受體配體活性（Receptor Ligand Activity）、生長(zhǎng)因子受體結(jié)合（Growth Factor Receptor Binding）、蛋白磷酸酶結(jié)合（Protein Phosphatase Binding）等（圖6）。

KEGG通路富集分析結(jié)果顯示，共116條通絡(luò)（P_Value<0.05），為了更準(zhǔn)確了解黃連溫膽湯治療OSAS的作用機(jī)制，設(shè)置富集到相應(yīng)的通路基因比例大于等于13.85%，然后將所得數(shù)據(jù)P_Value值取對(duì)數(shù)再導(dǎo)入Cytoscape3.7.2進(jìn)行可視化圖形繪制。見圖7。再結(jié)合文獻(xiàn)找出可能與治療Z綜合征相關(guān)的通路，并將其與Z綜合征靶標(biāo)二者結(jié)合，繪制靶標(biāo)-通路表。見表2。

2.6 分子對(duì)接 為了進(jìn)一步驗(yàn)證Z綜合征中黃連溫膽湯靶點(diǎn)的候選化合物，測(cè)試了木犀草素（Luteolin）、槲皮素（Quercetin）、黃芩素（Baicalein）和以下潛在靶蛋白（圖8～10）：IL6（PDB：6NCO），AKT（PDB：5KCV）和MMP9（PDB：6ESM）之間的對(duì)接精度。選擇研究這些靶蛋白是因?yàn)樵赑PI網(wǎng)絡(luò)圖中處于關(guān)鍵位置，同時(shí)它們參與了關(guān)鍵通路。它們?cè)赯綜合征對(duì)化合物的反應(yīng)中可能起關(guān)鍵作用。對(duì)接分析結(jié)果表明，靶蛋白和對(duì)應(yīng)的化合物分子的得分小于-5，靶蛋白和化合物分子之間有較好的結(jié)合性。見表3。對(duì)接分析成功地預(yù)測(cè)了木犀草素、槲皮素、黃芩素與3個(gè)被測(cè)靶蛋白活性點(diǎn)位很好的結(jié)合?？偟膩碚f，這些結(jié)果提供了進(jìn)一步的證據(jù)，證明這3種蛋白在Z綜合征中作為木犀草素、槲皮素、黃芩素的治療靶點(diǎn)。

3 討論

Z綜合征是指OSAS與MS合并出現(xiàn)。OSAS是由于睡眠時(shí)反復(fù)上氣道塌陷，造成上氣道阻塞，引起呼吸暫停和通氣不足，伴有打鼾、睡眠結(jié)構(gòu)紊亂、睡眠缺陷、低氧血癥、日間嗜睡、晨起頭痛等癥狀[18]。MS是蛋白質(zhì)、脂肪、碳水化合物等多種代謝成分異常聚集的病理狀態(tài)[19]。臨床上OSAS和MS常合并出現(xiàn)。西班牙的一項(xiàng)小型臨床研究發(fā)現(xiàn)，在OSAS患者中MS比例高達(dá)43%～81%（輕中度患者43%，重度81%）[20]。一項(xiàng)印度研究表明，MS中合并OSAS的發(fā)病率為77%[21]。Wilson等[22]的研究結(jié)果表明，95.8%代謝綜合征患者合并OSAS，其中62.5%為重度OSAS，符合MS條件越多的患者，其患OSAS的風(fēng)險(xiǎn)越大，且OSAS的嚴(yán)重程度越高。既往研究結(jié)果提示OSAS慢性間歇性低氧、高碳酸血癥和睡眠碎片伴睡眠喪失是MS的引發(fā)或促進(jìn)的因素，MS各組分也反作用于OSAS，二者互為因果，互相促進(jìn)，形成惡性循環(huán)[23]。OSAS和MS皆是心血管病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素[24]。OSAS亦可加重MS組分來增加心血管事件的發(fā)生率[25]。Z綜合征對(duì)患者靶器官的損害較單純MS或OSAS更為嚴(yán)重[26]。Z綜合征對(duì)心血管的危害并非OSAS和MS的簡(jiǎn)單疊加而是協(xié)同加劇[27]。Z綜合征已經(jīng)是全球公共衛(wèi)生問題，研究其病理機(jī)制和治療方法是非常具有臨床意義的。

本研究運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接技術(shù)對(duì)黃連溫膽湯治療Z綜合征的作用機(jī)制進(jìn)行探討分析。根據(jù)研究結(jié)果顯示，黃連溫膽湯作用于Z綜合征的相關(guān)化合物134個(gè)，作用靶基因65個(gè)，通過對(duì)作用靶基因進(jìn)行GO富集分析和KEGG分析來探討黃連溫膽湯治療Z綜合征的分子機(jī)制。

本研究所獲取的黃連溫膽湯治療Z綜合征的主要活性成分包括木犀草素（Luteolin）、槲皮素（Quercetin）、黃芩素（Baicalein）、小檗堿（Berberine）、黃芩苷（Baicalin）等。張慧娜等[28]細(xì)胞實(shí)驗(yàn)表明小檗堿能有效抑制間歇性缺氧對(duì)THP1分化及環(huán)氧合酶2表達(dá)的促進(jìn)作用，提示小檗堿能通過抑制THP1分化及環(huán)氧合酶2表達(dá)來有效治療OSAS。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明小檗堿有顯著的胰島素增敏和降低血清游離脂肪酸的作用，降低血糖，亦能促進(jìn)胰島B細(xì)胞修復(fù)和再生[29-33]。鄭慶等[34]研究表明黃芩苷可減輕慢性間歇性低氧兔內(nèi)皮細(xì)胞核因子-κB活性，下調(diào)TNF-α表達(dá)，從而減輕血管內(nèi)皮炎性反應(yīng)、動(dòng)脈粥樣硬化。郗有麗[35]動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究表明黃芩苷能夠改善MS模型大鼠的胰島素抵抗。

通過文獻(xiàn)檢索及“靶蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖”可知，黃連溫膽湯治療Z綜合征可能通過作用白細(xì)胞介素-6（IL-6）、蛋白激酶B1（AKT1）、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子A（VEGFA）、基質(zhì)金屬蛋白酶-9（MMP-9）等4個(gè)靶標(biāo)來發(fā)揮作用。OSAS患者的間歇性低氧狀態(tài)促使IL-6釋放，此是OSAS介導(dǎo)氣道局部炎性發(fā)生的重要原因，而氣道局部炎性反應(yīng)又會(huì)加重OSAS[36-39]。研究表明IL-6在胰島素抵抗、脂代謝紊亂、腹型肥胖、高血壓發(fā)生發(fā)展中起了重要作用，而代謝綜合征病情的進(jìn)展又可逐步加重慢性炎性反應(yīng)，促進(jìn)IL-6的釋放[40-43]。杜娟等[44]利用慢性間歇低氧模擬OSAS，結(jié)果顯示間歇低氧小鼠肝細(xì)胞p-AKT蛋白表達(dá)減少。莊向華等[45]利用慢性間歇低氧模擬OSAS，結(jié)果發(fā)現(xiàn)OSAS大鼠脂肪組織p-Akt蛋白水平較對(duì)照組降低。研究發(fā)現(xiàn)AKT被活化后可通過抑制下游糖原合成酶的活性、加速糖原合成和葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)來降低血糖水平[46]。顧晨鵑等[47]小鼠實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，慢性間歇性低氧小鼠胰島VEGFA表達(dá)增高。實(shí)驗(yàn)證明了代謝綜合征的高血糖和高血脂可上調(diào)VEGF表達(dá)，導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷，增加其患心血管疾病的風(fēng)險(xiǎn)[48-49]。研究發(fā)現(xiàn)在OSAS患者血漿和血清中MMP-9表達(dá)增加，且與患者病情的嚴(yán)重程度有關(guān)[50-53]。宋愛玲和曾奕明[54]的慢性間斷性缺氧可引起實(shí)驗(yàn)小鼠的腎小管上皮細(xì)胞MMP-9表達(dá)升高這可能參與了OSAS腎損害的發(fā)生發(fā)展。柴湘平等[55]臨床研究發(fā)現(xiàn)單用非諾貝特或吡格列酮干預(yù)均可降低MS患者基質(zhì)金屬蛋白酶-9水平。

KEGG通路富集分析發(fā)現(xiàn)，黃連溫膽湯治療Z綜合征主要涉及P38絲裂原活化蛋白激酶（P38MAPK），核因子-κB，磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B（PI3K-Akt），Toll樣受體4（TLR4）等信號(hào)通路。張超等[56]研究結(jié)果顯示，間歇性低氧大鼠p38MAPKmRNA及蛋白表達(dá)顯著升高，其下游因子NO濃度明顯降低，ET-1及ECE水平升高，提示OSAS大鼠p38MAPK通路被激活。葛麗蕎等[57]的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明p38抑制劑SB203580通過減輕軟腭組織中p-p38的表達(dá)，從而減輕慢性間歇性缺氧大鼠軟腭的損傷。姜秋芳[58]的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)慢性間歇低氧可以通過激活核因子-κB通路導(dǎo)致大鼠肝臟炎性損傷。鄭慶等[34]的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)慢性間歇性缺氧兔主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞中核因子-κB表達(dá)明顯升高，提示慢性間歇性缺氧可通過激活核因子-κB導(dǎo)致兔早期動(dòng)脈粥樣硬化改變，核因子-κB通路激活是OSAS導(dǎo)致冠心病的機(jī)制之一。王甜甜[59]的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明核因子-κB信號(hào)通路與MS的發(fā)病機(jī)制密切相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，OSAS的間歇性低氧會(huì)抑制PI3K/Akt通路從而加重氧化應(yīng)激、炎性反應(yīng)、細(xì)胞凋亡造成神經(jīng)細(xì)胞損傷，導(dǎo)致認(rèn)知功能障礙的發(fā)生[60]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，加味黃連溫膽湯可通過激活PI3K-Akt通路來提高M(jìn)S大鼠骨骼肌對(duì)葡萄糖的吸收與利用水平，改善胰島素抵抗[61]。龍冠晗等[62]的研究表明慢性間歇性低氧大鼠脂肪組織TLR4 mRNA水平顯著升高，提示TLR4通路參與了OSAS的炎性反應(yīng)。黃瑞歐等[63]的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明梔子苷和TLR4抑制劑TAK-242皆可通過抑制TLR4通路來改善MS大鼠高尿酸血癥、脂質(zhì)堆積和腎炎。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)黃連溫膽湯治療Z綜合征的主要活性成分可能為木犀草素、槲皮素、黃芩素、小檗堿、黃芩苷等，這些活性成分通過作用于AKT1、IL6、VEGFA、MMP-9等靶標(biāo)以及調(diào)節(jié)PI3K-Akt、P38MAPK、核因子-κB、TLR4等信號(hào)通路發(fā)揮對(duì)Z綜合征的治療作用。然而本研究未能對(duì)其治療Z綜合征的可能的分子機(jī)制進(jìn)行體內(nèi)或體外的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，存在一定的不足，但可以為有關(guān)實(shí)驗(yàn)的深一步進(jìn)行提供思路與方向。同時(shí)本研究也為中醫(yī)理論異病同治作用機(jī)制的深入研究提供了新的方法和思路。

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（2020-05-08收稿 責(zé)任編輯：楊覺雄）