王瑞敏，劉毅，李菲，賈躍進

1 山西中醫(yī)藥大學 山西太原 030024 2 山西中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院 山西太原 030024

抑郁癥（Depressive Disorder，DD）是一種多發(fā)的精神障礙，是中風，癡呆，偏頭痛，帕金森病等神經(jīng)科疾病的常見合并癥，也是心血管疾病、癌癥的常見伴發(fā)病，對人們的生活質(zhì)量有較大的危害。[1，2，3]而當下作為一線療法的西醫(yī)藥物療法療效卻不令人滿意，只有不到一半的人得到了有益的治療。[4]相比之下，中醫(yī)藥可從整體宏觀調(diào)節(jié)，并兼具多靶點、多途徑發(fā)揮作用的特點，臨床應(yīng)用有較高的安全性、有效性，因此挖掘中醫(yī)藥可為DD的藥物治療提供思路與參考。

賈躍進老中醫(yī)是第六批全國名老中醫(yī)工作室指導老師，臨床40余年，對中醫(yī)藥治療抑郁癥、失眠癥等多種精神障礙有豐富的治療經(jīng)驗。本文通過網(wǎng)絡(luò)藥理學方法分析其常用藥對合歡皮-遠志的抗抑郁的作用機制，一定程度揭示其治郁之法，希望為臨床使用及藥物研究提供一定思路。

資料與方法

1 藥物活性成分與靶點搜集

查閱中國知網(wǎng)（https://www.cnki.net/）相關(guān)文獻獲得兩藥物活性成分，并將所得活性成分在SwissADME（http://www.swissadme.ch/）平臺中限定胃腸道吸收；血腦屏障滲透；類藥性等進行篩選，并將篩選出的活性成分在SwissTargetPrediction（http://www.swisstargetprediction.ch/）中預(yù)測靶點。

2 疾病靶點與藥物-疾病交集靶點獲取

在GEO（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）、Genecards（https://www.genecards.org/）、OMIM（https://omim.org/#）、TTD（http://db.idrblab.net/ttd/）數(shù) 據(jù)庫中分別檢索“Depression”，然后運用R語言對GEO數(shù)據(jù)庫所選數(shù)據(jù)集進行差異分析，得出DD相關(guān)靶點，并與其余三個數(shù)據(jù)庫所得DD相關(guān)靶點合并、去重。將以上疾病與藥物靶點利用微生信（http://www.bioinformatics.com.cn/）平臺取交集，獲得藥對活性成分中直接與疾病相關(guān)的靶點。

3 疾病-藥物-成分-靶點網(wǎng)絡(luò)及蛋白相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

以疾病、藥物、活性成分和相關(guān)靶點為節(jié)點，相互關(guān)系為邊，在CytoscapeV3.8.0中構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)，并利用Bisogenet和CytoNCA插件對藥物-疾病交集靶點進行PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建和拓撲分析。

4 GO（Gene Ontology）富 集 分 析 和KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）通路富集分析

將交集靶點導入Cytoscape的BInGO、ClueGO插件分別進行GO和KEGG通路富集分析，然后將其可視化。

5 分子對接驗證

選取疾病-藥物-成分-靶點網(wǎng)絡(luò)中節(jié)點度較大的關(guān)鍵成分與PPI網(wǎng)絡(luò)中節(jié)點度較大的關(guān)鍵靶點分別在Zinc（https://zinc.docking.org/）、PDB（http://www.rcsb.org/）數(shù)據(jù)庫中獲得其3D結(jié)構(gòu)，并使用Vina分子對接，將其中對接較好的組合可視化。

結(jié)果

1 藥物活性成分與靶點搜集結(jié)果

通過檢索CNKI數(shù)據(jù)庫并限定藥物ADME值篩選活性成分，經(jīng)去重排除后，合歡皮-遠志藥對共搜集到54種活性成分，708個關(guān)聯(lián)靶點。見表1。

表1 合歡皮-遠志活性成分基本信息

2 疾病靶點及藥物-疾病交集靶點獲取結(jié)果

GEO、GeneCards、OMIM和TTD數(shù)據(jù)庫中分別得到808、7170、267和57個疾病靶點。將以上所得靶點處理后，共計獲得DD疾病靶點6754個。藥物-疾病交集靶點495個。見圖1。

圖1 DD-藥對交集靶點Venn圖

3 疾病-藥物-成分-靶點網(wǎng)絡(luò)及PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 結(jié)果

使用Cytoscape構(gòu)建疾病-方劑-藥物-成分-靶點網(wǎng)絡(luò)，圖中有761個節(jié)點，2404條邊。計算其節(jié)點度，獲得關(guān)鍵活性成分有7種。利用Bisogenet插件獲取PPI網(wǎng)絡(luò)，其中節(jié)點表示靶點，邊為蛋白互作關(guān)系，再通過CytoNCA插件的網(wǎng)絡(luò)拓撲分析功能，篩選出核心靶點，最終根據(jù)節(jié)點度選擇出核心的靶點7個，見圖2，表2，圖3。

圖2 疾病-方劑-藥物-成分-靶點網(wǎng)絡(luò)

圖3 蛋白相互作用（PPI）篩選網(wǎng)絡(luò)

4 GO和KEGG通路富集分析結(jié)果

利用Cytoscape內(nèi)置的BInGO和ClueGO插件將交集靶點進行GO、KEGG通路富集分析。將BInGO置信水平設(shè)置為0.05，得出GO生物過程主要有:細胞過程、信號過程、對刺激的反應(yīng)、代謝過程、免疫系統(tǒng)過程等；分子功能主要有:結(jié)合、分子傳導活性、催化活性等；細胞成分主要有:細胞外域、突觸部分、細胞器部分、細胞器腔等。將ClueGO按照p值≤0.01，最小聚類為25，κ值為0.55進行KEGG通路富集分析，得到主要通路為:TNF信號通路、神經(jīng)營養(yǎng)素信號通路、NF-κB信號通路、Th17細胞分化等。見圖4，圖5。

圖4 GO富集分析圖

圖5 KEGG通路富集分析圖

5 分子對接結(jié)果

當分子對接分數(shù)≤-5.0 kcal·mol-1時，可認為兩分子可形成穩(wěn)定結(jié)構(gòu)，[5]因此從分子對接結(jié)果可得本方7個關(guān)鍵活性成分多可與關(guān)鍵靶點形成穩(wěn)定結(jié)構(gòu)，取其中對接最好的3組展示，見表2，圖6。

圖6 分子對接構(gòu)象

表2 分子對接結(jié)果

討論

DD屬于中醫(yī)“郁證”范疇，早在《黃帝內(nèi)經(jīng)》中就有:“郁之甚者，治之奈何？…木郁達之，火郁發(fā)之，土郁奪之，金郁泄之，水郁折之?！盵6]的記載，論述了“五郁”的觀點；其后張仲景《傷寒雜病論》則理法方藥悉具地詳細闡述了“百合病”“臟躁證”等分屬DD的雜??；而朱丹溪則繼承《內(nèi)經(jīng)》“百病生于氣”[6]的思想，提出了“六郁”的學術(shù)觀點。賈師勤求古訓，發(fā)掘前人余緒，根據(jù)臨床所見認為:現(xiàn)代人生活節(jié)奏較快，思想壓力較大，情志容易不調(diào)，而情志不暢，肝氣郁滯，臟腑陰陽氣血失調(diào)可導致郁證，因此提出了“調(diào)氣”為先，兼顧氣血，肝脾同治的治“郁”之法，在臨床上取得了很好的效果?！昂蠚g皮-遠志”是賈老常用的治“郁”藥對，兩藥相配解郁祛痰安神，在緩解DD的同時可對其失眠的并發(fā)癥進行調(diào)治，而現(xiàn)代醫(yī)學亦證明DD患者易并見失眠，失眠的癥狀好轉(zhuǎn)，抑郁也會改善，現(xiàn)代藥理學則認為該兩藥有抗抑郁和神經(jīng)保護等作用，[7-9]因此看來該藥對確可抗抑郁。

根據(jù)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建，得出藥對發(fā)揮作用的7個關(guān)鍵活性成分，其中M為廣泛存在于植物中的生物類黃酮，具有抗抑郁潛力，而動物實驗認為其抗抑郁機制可能與其抗氧化、抗炎以及調(diào)節(jié)5-羥色胺（5-HT）的作用有關(guān)；[10-11]YZ14、YZ15、YZ16為遠志中的呫噸酮類，此類物質(zhì)被認為普遍具有單胺氧化酶（MAO）抑制及免疫方面的作用，[11]YZ18被研究發(fā)現(xiàn)具有鎮(zhèn)靜、催眠等活性，[12]YZ12則被證實可調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)并具有抗氧化活性，[13]而這些皆與DD的發(fā)病機制相關(guān)；HHP9為合歡皮中的一種木脂素，而該物質(zhì)在橫斷面研究中顯示比異黃酮更與女性圍絕經(jīng)期DD相關(guān)。[14]PPI網(wǎng)絡(luò)所得的核心靶點中RELA，即核因子κB（NF-κB）對包括焦慮癥和DD在內(nèi)的精神疾病具有重要意義；[15]ESR1、AR為雌激素、雄激素受體，雌二醇的水平與DD易感性有關(guān)，而前列腺癌的去勢患者則容易發(fā)生DD；[16-17]AKT1編碼的激酶被認為可能與包括DD的情感障礙的發(fā)病機理有關(guān)；[18]NTRK1編碼神經(jīng)營養(yǎng)性酪氨酸激酶受體，可與DD的關(guān)鍵因子神經(jīng)營養(yǎng)因子結(jié)合，并參與AKT1、NF-kB的激活。[19-20]

目前雖然對DD的具體病理機制尚不清楚，但大體上主要在:神經(jīng)遞質(zhì)障礙、神經(jīng)系統(tǒng)異常、信號傳導障礙、代謝障礙、免疫應(yīng)答異常、遺傳等方面，[21]由GO和KEGG通路富集分析得到的主要生物過程和主要通路對以上機制幾乎都有涉及，可見合歡皮-遠志藥對通過多種機制，多個途徑對DD發(fā)揮治療作用。分子對接結(jié)果顯示，關(guān)鍵活性成分和關(guān)鍵靶點大多都可穩(wěn)定結(jié)合，尤其是靶點AKT1、ESR1和NTRK1，及成分M（槲皮素）和YZ16（1，7-二甲氧基-2，3-亞甲二氧基呫噸酮），故可認為藥對主要通過AKT1激酶、雌激素及神經(jīng)營養(yǎng)因子等三個方面發(fā)揮對DD的治療作用。

綜上所述，通過網(wǎng)絡(luò)藥理學和分子對接研究，可以得到賈躍進老中醫(yī)常用藥對合歡皮-遠志，主要通過槲皮素和1，7-二甲氧基-2，3-亞甲二氧基呫噸酮結(jié)合AKT1、ESR1和NTRK1涉及AKT1激酶、雌激素及神經(jīng)營養(yǎng)因子方面，藉由TNF信號通路、神經(jīng)營養(yǎng)素信號通路、NF-κB信號通路等實現(xiàn)抗抑郁作用的作用機制，為臨床應(yīng)用、進一步研究提供參考。