劉 沖，郜趙偉，王會平，和 婷，劉 麗，董 軻

(空軍軍醫(yī)大學 第二附屬醫(yī)院 檢驗科, 西安 710038)

B淋巴細胞刺激因子(BLyS，又稱BAFF、TALL-1)是腫瘤壞死因子配體家族中的成員[1-2]，主要表達于單核細胞、巨噬細胞和活化的T細胞[3]。人BLyS全長285個氨基酸，為Ⅱ型跨膜蛋白，有膜結(jié)合型和可溶性兩種形式存在，二者生物學活性基本一致。膜結(jié)合型BLyS在蛋白酶作用下水解第132或133位氨基酸，產(chǎn)生由152個氨基酸組成的可溶性活性多肽，釋放入血即為可溶性BLyS—sBLyS[4]。作為B淋巴細胞的共刺激因子，BLyS通過與B淋巴細胞表面受體結(jié)合而誘導(dǎo)其增殖、分化和免疫球蛋白產(chǎn)生，在體液免疫中發(fā)揮重要作用[5-6]。研究顯示，BLyS可能在自身免疫病的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要的作用[7-11]。研究通過構(gòu)建sBLyS-pRSETC原核表達載體，誘導(dǎo)純化獲得人sBLyS重組蛋白，并通過重組抗原免疫得到sBLyS的單克隆抗體，為后續(xù)sBLyS檢測和臨床研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料及方法

1.1 材料

pRSETC質(zhì)粒、大腸桿菌JM109、BL21(DE3)為本實驗室保存。外周血單個核細胞分離液購自天津市灝洋生物制品科技有限責任公司；RNAiso Plus，cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒，2×Taq酶、限制性內(nèi)切酶(BamH I，EcoR I)、T4DNA連接酶，異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)均購自TaKaRa公司；質(zhì)粒提取試劑盒，DNA膠回收試劑盒購自O(shè)MEGA公司；弗式完全佐劑和弗式不完全佐劑，HAT選擇性培養(yǎng)基購自Sigma公司；PEG1500購自Roche公司；BALB/c小鼠購自空軍軍醫(yī)大學實驗動物中心。

1.2 方法

1.2.1 原核表達質(zhì)粒pRSETC-sBLyS的構(gòu)建

取2 mL抗凝血與2 mL生理鹽水混勻，將稀釋后的血液加至分離液液面，800 r/min離心30 min，取第二層乳白色細胞層，10 mL PBS洗2次。加入1 mL RNAiso Plus混勻，提取總RNA，利用TakaRa逆轉(zhuǎn)錄試劑盒制備cDNA。設(shè)計sBLyS引物，引物序列上游5′-CAGGATCCGAGCCGTTCAGGGTCCAGAAG-3′，下游5′-GCGAATTCTTACAGCAG TTTCAATGCACC-3′，PCR擴增獲得sBLyS片段。將擴增片段與pRSETC載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109感受態(tài)細胞，挑取陽性克隆，提取質(zhì)粒。酶切鑒定并送測序，將測序正確的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入BL21(DE3)感受態(tài)，篩選陽性克隆。

1.2.2 重組人sBLyS蛋白表達

挑取BL21(pRSETC-sBLyS)菌落接種到5 mL LB中培養(yǎng)過夜，按1∶ 50接種到新鮮LB培養(yǎng)液中。培養(yǎng)至OD600為0.6，0.2 mmol/L IPTG誘導(dǎo)表達。5 000 r/min離心10 min收集菌體，加入2 mL PBS，冰浴條件下超聲破碎，14 000 r/min離心10 min分別收集上清液和沉淀。SDS-PAGE檢測蛋白表達。

1.2.3 重組人sBLyS蛋白純化及鑒定

將獲得菌液沉淀用8 mol/L尿素溶解并與鎳柱結(jié)合，PBS洗滌3次，利用不同濃度(50、100和200 mmol/L咪唑)的Elution buffer分別洗脫收集目的蛋白，進行SDS-PAGE鑒定。將含目的蛋白的洗脫組分對去離子水透析過夜。收集蛋白進行SDS-PAGE，通過半干轉(zhuǎn)將蛋白轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，5%的脫脂奶粉室溫封閉2 h，與商品化的BLyS抗體(1∶ 600稀釋)雜交，4 ℃孵育過夜。TBST洗滌3次，每次15 min。取出纖維素膜，加入辣根過氧化物酶標記的山羊抗鼠IgG(1∶ 5 000稀釋)，室溫孵育2 h，TBST洗滌后使用ECL發(fā)光液進行顯色。

1.2.4 sBLyS單克隆抗體制備

純化的目的蛋白與弗式完全佐劑按照等體積混合后充分乳化。BALB/c小鼠(6～8周)皮下多點注射重組蛋白50 μg/只。4周后取小鼠血清進行抗體效價檢測，選擇抗體效價高的個體繼續(xù)進行加強免疫，每4周免疫1次，連續(xù)進行3次免疫，第3次加強免疫不加佐劑腹腔注射抗原50 μg/只。3 d后取脾細胞與SP2/0細胞融合，培養(yǎng)10～14 d后選擇體積較大的克隆進行ELISA篩選，將分泌sBLyS抗體的雜交瘤通過有限稀釋法進行3～4次克隆化培養(yǎng)，直至所有單克隆均為陽性。BALB/c小鼠腹腔注射滅菌石蠟油500 μL/只，兩周后腹腔注射sBLyS陽性雜交瘤細胞1×106細胞/只，一周后抽取腹水。3 000 r/min離心5 min，收集上清液。

1.2.5 抗sBLyS單克隆抗體純化及鑒定

腹水上清液15 000 r/min離心30 min，收集上清液，緩慢加入3倍體積的醋酸鹽緩沖液，向上述溶液中逐滴加入1/40腹水體積的正辛酸，攪拌混勻10 min,10 000 r/min離心20 min,棄沉淀，測量上清液體積并加入等體積的飽和硫酸銨，將溶液輕輕混合2 h，10 000 r/min離心30 min，收集沉淀并溶于10 mL PBS中，對PBS透析24 h(4 ℃)，10 000 r/min離心10 min，收集上清液，SDS-PAGE檢測抗體純度，Western Blot檢測抗體特異性。

1.2.6 單克隆抗體效價檢測

將重組抗原sBLyS以25 ng/孔包被于酶標板中，以實驗室保存原核表達B7H4蛋白作為陰性對照，純化抗體倍比稀釋后[分別為1 000.0、500.0、250.0、125.0、62.5、31.2、15.6、7.8和0.0 ng/mL(空白對照)]間接ELISA法檢測抗體效價，酶標儀檢測A450值，[(純化抗體A450-空白對照A450)/陰性對照A450]≥2.1為陽性，陽性抗體最低濃度即為效價。

1.2.7 HRP標記單克隆抗體及雙抗夾心配對實驗

取10 mg待標記抗體對pH 9.4碳酸鹽緩沖液透析(Na2CO31.59 g/L，NaHCO32.93 g/L)4 h，取0.8 mL的高碘酸鈉(25.6 mg/mL)與1 mL HRP(20 mg/mL)混勻放置30 min，加入160 μL的10%乙二醇，室溫避光放置30 min，加入待標記抗體，透析過夜，加入320 μL硼氫化鈉(5 mg/mL)混勻，避光放置2 h，加入等體積飽和硫酸銨，避光放置2 h，5 000 r/min離心30 min，棄上清液，加入2 mL的PBS溶解沉淀，對PBS透析過夜。將標記抗體作為檢測抗體與未標記抗體兩兩配對組合進行ELISA雙抗體夾心實驗，篩選包被抗體與檢測抗體的最佳組合。

2 結(jié)果與分析

2.1 原核表達質(zhì)粒鑒定

利用特異性引物PCR擴增獲得sBLyS基因片段[圖1(a)]，雙酶切鑒定表達質(zhì)粒pRSETC-sBLyS后電泳得到456 bp目的片段和2 895 bp的載體片段[(圖1(b)]，確定將測序正確的sBLyS插入pRSETC載體，說明表達質(zhì)粒構(gòu)建成功。

(a)The amplified sBLyS gene;(b)Enzyme digestion identification of sBLyS gene and pRSETC vector expression plasmid

2.2 重組人sBLyS蛋白表達、純化及鑒定

誘導(dǎo)表達的菌體經(jīng)超聲破碎后離心分離上清液和沉淀，SDS-PAGE結(jié)果顯示[圖2(a)]sBLyS蛋白以包涵體形式表達，大小為20 ku，利用鎳柱純化蛋白，Image lab(Bio-rad)軟件分析顯示[圖2(b)]純化后蛋白純度達到90%。將純化后蛋白進行電泳，轉(zhuǎn)印到硝酸纖維素膜上，與商業(yè)化的BLyS抗體雜交，結(jié)果顯示[圖2(c)]在20 ku處出現(xiàn)特異性條帶，表明純化后的sBLyS蛋白具有免疫活性。

(a)Expression of sBLyS[1: BL21 supernatant; 2: BL21 bacterial solution precipitation; 3: BL21(pRSETC)bacterial solution supernatant; 4: BL21(pRSETC)bacterial solution precipitation; 5: BL21(pRSETC+sBLyS)bacterial solution supernatant; 6: BL21(pRSETC+sBLyS)bacterial solution precipitation];(b)Purified sBLyS protein;(c)Western Blot detection recombinant sBLyS protein[1: BL21(pRSETC)bacterial protein; 2: sBLyS purified protein]

2.3 重組人sBLyS單克隆抗體的鑒定

獲得4株sBLyS單克隆抗體(2E4、2H8、4C5和4C12)，將純化后的抗體進行SDS-PAGE，考馬斯亮藍染色結(jié)果顯示純度較高(圖3)。Western Blot檢測結(jié)果顯示(圖4)，單克隆抗體2E4、2H8、4C5和4C12具有sBLyS蛋白結(jié)合活性。

圖3 sBLyS單克隆抗體純化

圖4 sBLyS單克隆抗體蛋白免疫印跡檢測

2.4 單克隆抗體效價測定

間接ELISA法檢測純化抗體2H8、4C5、4C12和2E4的效價分別為10.8、20.4、26.6和9.6 ng/mL，抗體與B7H4蛋白不發(fā)生交叉反應(yīng)，具有較好的特異性(圖5)。

圖5 4株抗人sBLyS單克隆抗體的效價測定

2.5 單克隆抗體配對篩選

4株抗體兩兩配對的雙抗夾心ELISA檢測顯示，使用2H8作為捕獲抗體包被酶標板，HRP-4C5作為檢測抗體，具有較高的檢測靈敏度，檢測抗原的線性度范圍為0.4～1.6 ng/mL(R2=0.995)，見圖6。

圖6 sBLyS/2H8和sBLyS/4C5-HRP檢測sBLyS標準曲線

3 討論與結(jié)論

BLyS是腫瘤壞死因子(TNF)家族成員，對B細胞的增殖、分化和存活具有重要調(diào)節(jié)作用[12]。sBLyS是BLyS的可溶性形式，具有BLyS的生物學功能[13]。研究顯示，sBLyS在臨床上具有兩方面的作用：sBLyS檢測可用于SLE的診斷和病情監(jiān)測；sBLyS是SLE的治療靶點。2011年，BLyS單克隆抗體藥物(belimumab，貝利木單抗)獲FDA批準，成為過去50多年來治療SLE的首個抗體類新藥。因此，制備抗sBLyS抗體對sBLyS診斷試劑和治療藥物開發(fā)均具有重要價值。

目前已有多個研究采用不同形式的制備方法篩選了靶向sBLyS的抗體，如徐海燕等[14]以穩(wěn)定高表達BLyS的基因轉(zhuǎn)染細胞L-BLyS為免疫原,常規(guī)免疫BALB/c小鼠，獲得1株持續(xù)、穩(wěn)定分泌鼠抗人BLyS單克隆抗體的雜交瘤細胞株；魯戰(zhàn)平[15]運用計算機模擬技術(shù)設(shè)計抗BLyS單鏈抗體的基因序列(VHL和MHL)，利用重疊PCR等方法構(gòu)建重組質(zhì)粒，借助原核表達系統(tǒng)獲得一株可以BLyS特異性結(jié)合的VHL蛋白序列。錢尼良等[16]利用抗原抗體特異性結(jié)合，通過依次降低抗原濃度從人源單鏈抗體庫中篩選抗B細胞刺激因子的單鏈抗體基因、構(gòu)建表達載體并表達獲得一株BLyS單鏈抗體。然而目前仍無可應(yīng)用于臨床診斷的sBLyS檢測試劑盒。

本研究利用原核表達方式獲得高純度的sBLyS蛋白，通過蛋白免疫和細胞融合技術(shù)獲得4株高特異性的單克隆抗體，經(jīng)雙抗體夾心法ELISA實驗，篩選出可用于sBLyS檢測的抗體組合：2H8和HRP-4C5，為sBLyS檢測試劑盒開發(fā)奠定了基礎(chǔ)，同時為后續(xù)用于臨床治療試驗的人源化抗體藥物開發(fā)提供基礎(chǔ)。