趙悅辰,楊小玉,杜昊睿,王鐵君*,王嘉鵬,夏雪怡
(1.吉林大學第二醫(yī)院 放療科,吉林 長春130041;2.吉林大學第二醫(yī)院 骨科,吉林 長春130041;3.吉林省一汽總醫(yī)院 骨科,吉林 長春130011;4.吉林大學第二醫(yī)院 眼科手術(shù)室,吉林 長春130041)
皮膚是人體最大的器官,具有免疫監(jiān)視、損傷防御及調(diào)節(jié)體液平衡等多種生理功能,是人體與外界環(huán)境之間天然保護屏障。在外傷、手術(shù)等因素作用下,皮膚及其深部組織受到機械性損傷會導致皮膚缺損及功能喪失,從而引起外界細菌、真菌、病毒等微生物通過創(chuàng)傷部位進入機體,造成創(chuàng)傷感染,甚至敗血癥等全身感染[1-2]。正常情況下,在皮膚屏障被破壞后,機體會調(diào)動免疫細胞、干細胞、成纖維細胞等對皮膚缺損處進行修復,但在修復程中,如果各種因素不能得到有效協(xié)調(diào),則會發(fā)生遷延不愈等情況。因此,如何采取有效措施促進創(chuàng)傷修復、減少疤痕形成一直是皮膚損傷治療中的重中之重。維生素B12是一種重要的生物活性物質(zhì),是細胞合成核酸過程中的重要輔酶,能夠催化分子重排、核苷酸生成脫氧核苷酸、轉(zhuǎn)甲基等反應。同時,維生素B12又是RNA合成不可缺少的物質(zhì),能夠加快肉芽組織增生及上皮細胞增殖,對受損皮膚黏膜上皮細胞及血管內(nèi)皮細胞具有較強的修復再生功能,對受損的神經(jīng)鞘具有營養(yǎng)和促進修復作用[3-4]。目前維生素B12主要應用于治療惡性貧血、神經(jīng)炎、神經(jīng)萎縮等疾病。近年來研究發(fā)現(xiàn),維生素B12對創(chuàng)傷、放射性皮膚損傷等也具有一定作用,但其具體治療效果未深入研究。因此本研究利用小型香豬全皮層損傷作為動物模型,通過維生素B12軟膏對創(chuàng)傷進行治療,研究維生素B12軟膏對皮膚創(chuàng)傷的修復作用。
1.1 實驗動物
小型香豬3只,6-7月齡,體重15±2 kg,雌雄不限。飼養(yǎng)于吉林大學基礎醫(yī)學院動物實驗中心標準動物室(22℃)。自然照明條件下,實驗動物自由攝食、飲水。
1.2 皮膚創(chuàng)傷模型建立及干預方法
在實驗前1天,剔除香豬背部位毛發(fā)。以3%戊巴比妥鈉靜脈注射進行麻醉,隨后利用75%乙醇對背部位皮膚進行消毒,采用直徑25 mm的取皮器并排在實驗動物背部制備3個直徑為25 mm的圓形創(chuàng)面,深達皮下組織全層,勿傷及皮下筋膜層。實驗動物背部單側(cè)從頭至尾3個創(chuàng)面依次設為Control組,三乙醇胺組,維生素B12組。維生素B12軟膏組每日涂抹復方維生素B12軟膏Ⅱ號(主要成為維生素B12,硫酸慶大霉素)進行藥物干預,三乙醇胺組每日在創(chuàng)口涂抹比亞芬燙傷膏(法國Biafine Act)進行藥物干預,Control組不作任何涂抹。
1.3 創(chuàng)口觀察及愈合率計算
在皮膚創(chuàng)傷模型建立后,于0、5、9、13、21、25及29天,用數(shù)碼相機拍攝皮膚傷口照片,同時利用Image-pro plus 6.0軟件對圖片進行處理,測量創(chuàng)口面積及創(chuàng)口愈合率,創(chuàng)口愈合率按如下公式計算:創(chuàng)口愈合率=[(A0-At)/A0]×100%,其中A0表示創(chuàng)面初始面積(t=0),At表示不同時間點實驗動物的背部創(chuàng)口面積。
1.4 標本取材及組織學分析
術(shù)后29天,處死實驗動物并取下創(chuàng)口皮膚樣本,用切割器仔細修剪。新鮮組織塊樣本在4%多聚甲醛固定24 h以上,對組織進行依次梯度酒精脫水及石蠟包埋處理。利用石蠟切片機將組織切成厚度為4 μm的薄片。隨后對組織切片進行HE染色、Masson染色,并在正置光學顯微鏡下觀察組織樣本結(jié)構(gòu)變化。
1.5 透射電子顯微鏡分析
在4℃條件下,利用4%戊二醛0.1 M磷酸鹽緩沖液對皮膚組織樣本固定2-4 h,隨后組織標本在1%四氧化鋨溶液中繼續(xù)固定2-4 h。通過醋酸鈾酰水溶液對組織樣本染色1 h,隨后醇類逐級脫水并將組織樣本用包埋劑包埋。將處理后組織塊切割成0.5-1.0 μm厚的薄片,依次通過甲苯胺藍、醋酸鈾和枸櫞酸鉛對組織片進行染色,染色時間為15 min,室溫干燥過夜。最后在透射電子顯微鏡下觀察組織標本的超微結(jié)構(gòu)。
1.6 統(tǒng)計學方法
2.1 皮膚創(chuàng)口外相及創(chuàng)口愈合率
為了對不同實驗組小型香豬表皮創(chuàng)口愈合情況進行分析,我們分別于不同時間點對皮膚創(chuàng)口進行觀察并使用Image-pro plus 6.0軟件對愈合率進行測量。如圖1、2所示,術(shù)后第13天之前,各組實驗動物造模處均可見明顯缺損,皮膚愈合較為緩慢。從第17天開始,與Control組相比,三乙醇胺組和維生素B12組表皮創(chuàng)口明顯減小,愈合率顯著提升。隨著時間的推移,三乙醇胺組和維生素B12組繼續(xù)保持這種良好的修復效果。術(shù)后29天后,在所有組中,Control組創(chuàng)口愈合情況最差,創(chuàng)口表面存在大面積缺損,創(chuàng)面愈合僅約50%。與Control相比,維生素B12組、三乙醇胺組創(chuàng)口愈合率顯著提高(P<0.05)。維生素B12組創(chuàng)口已接近完全愈合,愈合率高達93.5%,創(chuàng)面基本完全被新生皮膚組織所取代。相比于維生素B12組,三乙醇胺組創(chuàng)口治療效果略差,創(chuàng)口愈合率為87%,創(chuàng)口部位仍有少許瘢痕存在。最后我們應用Image-pro plus 6.0軟件測量術(shù)后29天各組實驗動物的相對創(chuàng)口寬度。結(jié)果顯示(圖3),與Control組相比,三乙醇胺組相對創(chuàng)口寬度無顯著差異(P>0.05),維生素B12組相對創(chuàng)口寬度顯著減小(P<0.05)。
圖1 不同時間點各組實驗動物表皮創(chuàng)傷外相
圖2 各實驗組表皮愈合曲線
圖3 各組實驗動物表皮創(chuàng)口相對寬度
2.2 皮膚創(chuàng)傷模型中各組的組織學改變
皮膚創(chuàng)傷的愈合涉及多種細胞、組織及體液因子參與,這一過程主要包括肉芽組織增生、上皮化生及皮膚附屬器官的再生。這些組織學的變化可通過HE染色進行觀察。如圖4所示,在所有實驗組中,新生表皮組織均缺少腺體、毛囊等皮膚附屬器官。在Control組中可見大量結(jié)痂形成,新生組織結(jié)構(gòu)較為疏松。與Control組相比,維生素B12組及三乙醇胺組皮下組織更為致密,證明創(chuàng)傷修復效果更佳。特別是在維生素B12組,細胞外基質(zhì)有序程度明顯優(yōu)于其他各組,且與原有組織之間并無明顯的分界線,證明新生組織融合度更高。在創(chuàng)傷愈合過程中,缺損部位會產(chǎn)生大量膠原纖維以填補缺損部位,Masson染色是評估組織膠原纖維含量的常用手段,如圖5所示,新生皮膚組織中膠原纖維被染為藍色,在Control組及三乙醇胺組中膠原纖維排列較為混亂無序,且含量較少。相比之下,在維生素B12組可見更多膠原纖維形成,并且排列較為有序。因此,通過HE及Masson染色可推測維生素B12軟膏能顯著促進皮膚組織再生及膠原沉積。
圖4 HE染色對創(chuàng)面再生進行組織形態(tài)學分析
圖5 Masson染色對創(chuàng)面膠原沉積情況進行分析
2.3 透射電鏡觀察組織的超微結(jié)構(gòu)
為了一進步評測復方維生素B12軟膏對皮膚創(chuàng)口愈合的影響,我們通過透射電子顯微鏡觀察各組皮膚組織的超微結(jié)構(gòu)變化。由圖6可見各組膠原纖維呈管狀結(jié)構(gòu)排列,排列規(guī)則程度和膠原纖維間隙大小具有一定差異性。維生素B12組中,可見橫向截面膠原纖維間隙較小、排列致密,縱向截面膠原纖維排列較規(guī)則。在Control組、三乙醇胺組中,橫向截面膠原纖維間隙較大、排列較稀疏,縱向截面膠原纖維排列規(guī)則程度也略低于維生素B12組。通過透射電鏡結(jié)果證明維生素B12軟膏表皮修復效果最好,新生皮膚中膠原纖維排列分布更為有序,接近于正常皮膚組織。
圖6 各組實驗動物表皮組織的透射電鏡照片
皮膚作為人體最大的器官,在維持體液平衡和保護內(nèi)臟免受外界損傷方面有重要作用。燒傷、燙傷、撕裂和手術(shù)造成的皮膚創(chuàng)傷是全世界最重要的健康問題之一,可發(fā)生在身體的各個部位。嚴重的皮膚創(chuàng)傷往往伴有創(chuàng)面部位的感染,會阻礙創(chuàng)面的正常愈合并導致更嚴重的循環(huán)癥狀,嚴重者甚至可能死亡[5-7]。因此,如何有效緩解皮膚創(chuàng)傷患者癥狀并提高創(chuàng)傷修復率成為目前亟待解決的重要問題。在皮膚創(chuàng)傷治療中,局部藥物治療應用最為廣泛,對機體副作用較小,并且創(chuàng)口部位藥物濃度高[8]。目前應用于皮膚創(chuàng)傷局部治療的藥物種類很多,如維生素、三乙醇胺、類固醇乳膏等,這些藥物在療效上存在一定的差異,目前尚無標準的治療方案。
本研究中應用復方維生素B12軟膏Ⅱ號對皮膚創(chuàng)傷進行治療并評測其臨床應用價值。這種維生素B12軟膏的作用為止癢鎮(zhèn)痛、抗菌及修復血管內(nèi)皮細胞損傷,是當前治療皮膚、粘膜損傷的有效藥物之一。在維生素B12軟膏中的慶大霉素成分是氨基糖苷類抗菌藥物的一種,具有廣譜的抗菌效果,能夠有效抑制綠膿桿菌、金黃色葡萄球菌及大腸桿菌等致病菌的生長,尤其對于革蘭氏陰性菌具有極強的殺傷效果,可防止皮膚創(chuàng)口感染的發(fā)生,提高皮膚創(chuàng)口愈合率[9]。此外,相對于其他抗菌藥物,慶大霉素不會使致病菌產(chǎn)生較強的耐藥性。而維生素B12又稱為氰鈷胺,其對機體組織蛋白及脂類的合成及代謝具有重要作用[10]。體內(nèi)維生素B12代謝水平的改變可能會導致白癜風、口腔炎、特應性皮炎、痤瘡等皮膚疾病的發(fā)生[11-12]。在皮膚吸收維生素B12后,皮膚中RNA合成速率有效增強,加速損傷部位皮膚粘膜及血管的再生。此外,維生素B12可降低皮膚敏感性,抑制組織增生反應,還具有止癢鎮(zhèn)痛及預防血管痙攣的作用[13]。本研究成功建立了小型香豬皮膚創(chuàng)傷模型,利用復方維生素B12軟膏對皮膚創(chuàng)口進行治療,同時與一種臨床常用的皮膚創(chuàng)傷治療藥物三乙醇胺進行療效對比。表皮創(chuàng)傷外相及愈合率評分顯示利用維生素B12軟膏對皮膚創(chuàng)口進行治療后,創(chuàng)口表皮愈合率明顯高于三乙醇胺治療組,維生素B12軟膏有效促進了表皮損傷后組織再生的愈合速率。通過組織學觀察,維生素B12組創(chuàng)面新生部位較為平整,組織排列有序,并且有大量膠原沉積。相比于其他各組,維生素B12組新生組織表面結(jié)構(gòu)接近于正常皮膚,愈合程度明顯優(yōu)于三乙醇胺組。
綜上所述,維生素B12軟膏能夠加速皮膚創(chuàng)傷的愈合速率,有效促進皮膚組織的再生及膠原沉積,在皮膚創(chuàng)傷臨床治療中具有有巨大的應用前景。