胡志平,馬 俊,陳彥蓉,周珍貴

(湖北省公安縣人民醫(yī)院 神經(jīng)外科，湖北 公安434300)

腦外傷具有很高的發(fā)病率和死亡率，是一種嚴重威脅人類健康和社會經(jīng)濟問題的疾病[1]。腦外傷可誘發(fā)腦組織缺血缺氧，觸發(fā)瀑布式神經(jīng)生化降解過程的損傷級聯(lián)反應(yīng)，與氧化應(yīng)激損傷密切相關(guān)[2-3]。而腦水腫、行為障礙等是腦外傷患者早期重要病理變化及嚴重并發(fā)癥，也是導(dǎo)致病情進展甚至惡化死亡的重要因素[4]。刺芒柄花素(formononetin，F(xiàn)OR)是一種異黃酮類物質(zhì)，近來研究報道其可能通過抗氧化應(yīng)激和抗細胞凋亡作用對腦缺血再灌注損傷大鼠具有一定保護作用[5]，但其對腦外傷小鼠腦水腫及行為障礙是否亦具有保護作用及其作用機制尚鮮有研究。核因子e2相關(guān)因子2(nuclear factor e2-related factor 2，Nrf2)/血紅素加氧酶-1(heme oxygenase-1，HO-1)通路是一種內(nèi)源性抗氧化系統(tǒng)核心調(diào)控樞紐，對大鼠液壓式腦損傷、創(chuàng)傷性腦損傷中神經(jīng)細胞修復(fù)均具有保護作用[6-8]?；诖耍狙芯繑M通過探究FOR對腦外傷小鼠腦水腫及行為障礙的影響，以期揭示其作用機制，為臨床腦外傷患者早期治療提供一定參考。現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

8周齡SPF級雄性C57BL/6小鼠，體質(zhì)量20 g-22 g(貨號：jlc0008)，購自上海萊克實驗動物有限責(zé)任公司/上海靈暢生物科技有限公司。飼養(yǎng)條件：均于溫度為(23±2)℃、濕度為(50±10)%，12 h/12 h光照/黑暗，自由飲水飲食環(huán)境下飼養(yǎng)。本研究動物實驗經(jīng)本院動物實驗倫理委員會批準。

1.2 主要試劑及儀器

FOR(純度≥98%，貨號：485-72-3)、依達拉奉注射液(edaravone，EDA，批準文號：國藥準字H20080056)購自國藥集團國瑞藥業(yè)有限公司；亞細胞結(jié)構(gòu)胞核與胞漿蛋白抽提試劑盒(貨號：AR0106)購自武漢博士德生物工程有限公司；BCA蛋白定量試劑盒(批號：P0010S)購自上海碧云天有限公司；兔源一抗anti-Nrf2抗體(貨號：ab62352)、anti-HO-1抗體(貨號：ab137749)、anti-GAPDH抗體(貨號：ab181602)、二抗山羊抗兔IgG(貨號：ab6721)均購自英國Abcam公司；超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)測定試劑盒(貨號：k335-100)購自艾美捷科技生物有限公司；丙二醛(malondialdehyde，MDA)測定試劑盒(貨號：A003-1-2)購自南京建成生物工程研究所；MODEL550型酶標(biāo)儀購自美國Bio-Rad公司等。

1.3 方法

1.3.1建模與分組

采用改良Feeney自由落體撞擊法制備腦外傷小鼠模型，隨機選取80只C57BL/6小鼠，用2%戊巴比妥鈉麻醉后，沿其顱頂正中線切開頭皮，以冠狀縫旁1.5 mm及矢狀縫旁2.5 mm處為原點，電動磨鉆鉆約5 mm×5 mm骨窗，并于骨窗正中安置撞墊，將40 g砝碼從25 cm高處沿落體引導(dǎo)管墜落至顱腦損傷，止血沖洗后，骨蠟封閉，縫合頭皮。其中死亡5只，造模成功75只。隨機分為模型組(Model組)、陽性藥物依達拉奉組(EDA組)、FOR低劑量組(25 mg/kg)、FOR中劑量組(50 mg/kg)、FOR高劑量組(100 mg/kg)，假手術(shù)組(Sham組)操作步驟同造模但不予以顱腦打擊，每組5只，每組3個平行亞組。傷后30 min，EDA組、FOR低、中、高劑量組分別5 mg/kg EDA[9]、25 mg/kg、50 mg/kg、100 mg/kg FOR進行腹腔注射給藥，Sham組和Model組給予等量生理鹽水腹腔注射，均每天1次，連續(xù)3天。

1.3.2神經(jīng)損傷評分(neurologic severity score，NSS)測定[10]

分別于傷后2 h、1 d、3 d處死小鼠前，通過運動實驗、感覺實驗、平衡能力測試、反射實驗對大鼠進行NSS評分，最高18分，得分越高，說明神經(jīng)系統(tǒng)損傷越嚴重。

1.3.3腦組織水含量測定

分別于傷后2 h、1 d、3 d給藥結(jié)束后，10%水合氯醛腹腔麻醉處死，斷頭取腦，并分成左右兩半，取左腦標(biāo)本先用濾紙吸除表面水分后，稱取濕重(wet weight，W)，再經(jīng)110℃烤箱烘烤24 h后稱取干重(dry weight，D)。其中腦組織水含量=(W-D)/W×100%。

1.3.4腦組織SOD、MDA水平檢測

采用定量檢測試劑盒測定各組小鼠腦組織勻漿標(biāo)本中氧化應(yīng)激指標(biāo)SOD、MDA水平，具體操作嚴格按照試劑盒說明書進行。

1.3.5腦組織組織中N-Nrf2、C-Nrf2、HO-1蛋白表達情況檢測

取各組傷后2 h、1 d、3 d小鼠腦組織部分標(biāo)本，迅速置于液氮中保存。嚴格按照蛋白提取試劑盒說明提取各組小鼠腦組織胞核、胞漿總蛋白，并采用BCA試劑盒檢測蛋白濃度，置于-80℃保存?zhèn)溆?。蛋白樣品?0 mV電壓下6% SDS-PAGE電泳，PVDF膜轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，添加anti-Nrf2(稀釋比1∶1 000)、anti-HO-1(稀釋比1∶500)、anti-GAPDH(稀釋比1∶500)抗體4℃孵育過夜，TBST緩沖液洗膜，添加二抗IgG(稀釋比1∶5 000)室溫孵育1 h，按上述方法洗膜，顯色，曝片，觀察結(jié)果并拍照分析各蛋白條帶灰度值，分別以靶蛋白灰度值與內(nèi)參GAPDH條帶比值為目標(biāo)蛋白相對表達量。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠NSS評分比較

傷后1 d，與Model組比較，F(xiàn)OR低、中、高劑量組小鼠NSS評分依次降低(P<0.05)；FOR高劑量組NSS評分高于EDA組(P<0.05)。傷后3 d各組小鼠NSS評分變化趨勢與傷后1 d一致。隨時間延長，各組小鼠NSS評分呈先升高后降低趨勢。見圖1。

2.2 各組小鼠腦組織水含量變化

傷后1 d，與Sham組比較，Model組小鼠腦組織水含量增加(P<0.05)；與Model組比較，F(xiàn)OR低、中、高劑量組小鼠腦組織水含量依次降低(P<0.05)；FOR中、高劑量組小鼠腦組織水含量高于EDA組(P<0.05)。傷后3 d各組小鼠腦組織水含量變化趨勢與傷后1 d一致。除Sham組，其余各組隨時間延長小鼠腦組織水含量呈先升高后降低趨勢。見圖2。

圖2 各組小鼠腦組織水含量變化(n=5)

2.3 各組小鼠腦組織中SOD、MDA水平比較

傷后1 d，與Sham組比較，Model組小鼠腦組織SOD水平降低、MDA水平增加(P<0.05)；與Model組比較，F(xiàn)OR低、中、高劑量組小鼠腦組織SOD水平依次升高、MDA水平依次降低(P<0.05)；與EDA組比較，F(xiàn)OR中、高劑量組小鼠腦組織SOD水平升高、MDA水平降低(P<0.05)。傷后3 d各組小鼠腦組織SOD、MDA水平變化趨勢與傷后1 d一致。隨時間延長，除Sham組，其余各組小鼠腦組織SOD水平呈先降低后升高趨勢，MDA則反之。見圖3。

圖3 各組小鼠腦組織SOD、MDA水平比較

2.4 各組小鼠腦組織中C-Nrf2、N-Nrf2、HO-1蛋白表達變化

傷后1 d，與Sham組比較，Model組小鼠腦組織中C-Nrf2、N-Nrf2、HO-1蛋白表達水平顯著增加(P<0.05)；與Model組比較，F(xiàn)OR低、中、高劑量組小鼠腦組織中C-Nrf2蛋白水平依次降低(P<0.05)，N-Nrf2、HO-1蛋白表達水平依次升高(P均<0.05)；與EDA組比較，F(xiàn)OR高劑量小鼠腦組織N-Nrf2、HO-1蛋白表達水平增加，C-Nrf2蛋白表達降低(P>0.05)。隨時間延長，除Sham組，其余各組小鼠腦組織C-Nrf2水平呈先升高后降低趨勢，N-Nrf2、HO-1蛋白表達水平呈持續(xù)升高趨勢。見圖4及圖5、圖6、圖7。

圖4 免疫印跡檢測各組小鼠腦組織中C-Nrf2蛋白表達

圖5 免疫印跡檢測各組小鼠腦組織中N-Nrf2蛋白表達

圖6 免疫印跡檢測各組小鼠腦組織中HO-1蛋白表達

圖7 各組小鼠腦組織C-Nrf2、N-Nrf2、HO-1蛋白表達情況比較(n=5)

3 討論

本研究首先采用改良Feeney法重物自由落體瞬間機械沖擊造成小鼠原發(fā)性顱腦外傷，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與Sham組比較，Model組小鼠傷后2 h腦組織水含量、NSS評分差異無統(tǒng)計學(xué)意義，傷后1 d腦組織水含量、NSS評分均顯著增加，傷后3 d腦組織水含量、NSS評分呈降低趨勢。腦外傷包括原發(fā)性損傷和繼發(fā)性損傷，腦外傷后可啟動一系列生化過程引起繼發(fā)性、進行性損傷，其過程主要包括氧化應(yīng)激反應(yīng)導(dǎo)致的大量活性氧和自由基觸發(fā)蛋白質(zhì)氧化水解、核酸鏈斷裂等一系列瀑布式級聯(lián)反應(yīng)，加重腦組織細胞損傷，引發(fā)腦組織水腫、行為障礙等早期臨床癥狀。以上結(jié)果提示本研究腦外傷小鼠模型制備成功，可用于后續(xù)試驗；另隨腦外傷時間延長，小鼠機體本身可能存在損傷修復(fù)作用。

FOR是紅車軸草的主要有效成分，研究顯示，其在抗炎、抗氧化應(yīng)激、神經(jīng)組織修復(fù)等過程中起重要作用。田心等[11]研究報道，F(xiàn)OR可抑制高糖誘導(dǎo)的小鼠系膜細胞NF-κB信號通路激活及系膜細胞增殖。Li等[12]研究報道，F(xiàn)OR可通過抑制大鼠皮層神經(jīng)元IL-10表達抑制神經(jīng)炎癥反應(yīng)，對腦外傷大鼠具有神經(jīng)保護作用。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與Model組比較，F(xiàn)OR低、中、高劑量組可依次降低腦外傷小鼠NSS評分、腦組織水含量，且FOR高劑量組效果優(yōu)于EDA組；與傷后1 d比較，傷后3 d Model組小鼠腦組織水含量、NSS評分降低，提示FOR可能對腦外傷小鼠腦水腫癥狀具有減輕作用，并改善其行為障礙可能，且顯著優(yōu)于機體本身抗氧化應(yīng)激、抗損傷修復(fù)功能。腦損傷繼發(fā)腦水腫可破壞周圍腦組織及微血管，使局部腦血流量下降，產(chǎn)生大量炎癥因子及氧自由基，加重腦損傷。氧化應(yīng)激損傷在腦組織繼發(fā)性損傷機制中發(fā)揮重要作用，其中一氧化氮(NO)、SOD、MDA等是重要氧化或抗氧化應(yīng)激標(biāo)志性物質(zhì)[13]。汪剛等[14]研究報道，川穹提取物可通過提高血清SOD活性、降低MDA含量抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)減輕心肌缺血損傷，可能與激活Nrf2信號通路有關(guān)。鄒小蓉等[5]研究報道，F(xiàn)OR可降低缺血再灌注損傷大鼠NSS評分、提高大鼠學(xué)習(xí)記憶能力，改善腦組織形態(tài)、降低血清NO水平，發(fā)揮神經(jīng)保護、抗氧化應(yīng)激作用。本研究結(jié)果提示FOR具有抗氧化應(yīng)激作用，F(xiàn)OR可能通過抑制氧化應(yīng)激進而減輕腦外傷小鼠腦水腫及行為障礙。

Nrf2屬于亮氨酸拉鏈家族，是一種具有抗氧化應(yīng)激反應(yīng)的重要轉(zhuǎn)錄因子。正常情況下，細胞漿內(nèi)Kelch樣ECH相關(guān)蛋白1(Kelch-like ECH-associated protein 1，Keap1)與Nrf2形成復(fù)合物抑制Nrf2激活，發(fā)生氧化應(yīng)激時，Nrf2脫離Keap1發(fā)生核轉(zhuǎn)位，進入細胞核，進一步與抗氧化反應(yīng)元件(antioxidant response elements，ARE)結(jié)合，發(fā)揮抗氧化應(yīng)激作用。HO-1是Nrf2下游分子，是血紅素分解代謝的限速酶，在腦內(nèi)廣泛表達，其水平升高亦可增強腦組織抗氧化損傷能力，抑制腦損傷[15-16]。韓遵華等[17]研究報道，依達拉奉可能通過促進HO-1信號通路活化減輕缺氧缺血性腦損傷新生大鼠腦水腫、腦梗死程度。Li等[18]研究報道，對腦外傷大鼠進行FOR預(yù)處理可通過激活Nrf2信號通路，上調(diào)miR-155和HO-1表達抑制氧化應(yīng)激，對大鼠外傷性腦損傷具有神經(jīng)保護作用。本研究發(fā)現(xiàn)，與Model組比較，F(xiàn)OR可呈劑量依賴性增加小鼠腦組織N-Nrf2、HO-1蛋白表達，降低C-Nrf2蛋白表達，且FOR中、高劑量效果顯著優(yōu)于EDA組，提示FOR可能通過促進Nrf2蛋白核移位，進而上調(diào)HO-1蛋白表達，抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)，減輕腦外傷小鼠腦水腫，改善其行為障礙。

綜上所述，F(xiàn)OR可通過促進Nrf2/HO-1通路激活，抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)，減輕腦外傷小鼠腦水腫并改善其行為障礙。本研究雖然對腦外傷小鼠模型2 h、1 d、3 d分別設(shè)置亞組對照進行了研究，但每組只選擇5只小鼠進行試驗，可能數(shù)量較少，結(jié)果存在具有一定局限性，存在不足。后期需增加實驗小鼠數(shù)量進一步深入探究。