王俊美 潘慧卿 李婧銥 賈迪 趙煒明 呂昌蓮

肺癌是臨床常見的惡性腫瘤之一[1]，其中腺癌是臨床中常見的肺癌亞型[2]。研究影響腫瘤進(jìn)展的分子表達(dá)對早期患者的診斷和治療有重要意義。基質(zhì)金屬蛋白酶家族(Matrix metalloproteinases，MMPs)與腫瘤進(jìn)展相關(guān)[3-4]。其功能是水解細(xì)胞外基質(zhì)、細(xì)胞表面結(jié)合的生長因子以及粘附蛋白等[5]，參與人體多種生理及病理過程，如炎癥、胚胎發(fā)育、血管形成、腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移等[6-7]。MMPs共有28個(gè)亞型，分為分泌型和細(xì)胞膜錨定型兩大類，其中分泌型MMPs研究已較為清楚，而細(xì)胞膜錨定型(如MT1-MMP、MT2-MMP等)研究起步較晚，目前主要集中于MT1-MMP的研究，而MT2-MMP的研究相對較少。

MT2-MMP在多種癌組織和細(xì)胞系呈高表達(dá)，發(fā)揮不同的病理生理作用。在宮頸癌細(xì)胞系HeLa S3細(xì)胞高表達(dá)，發(fā)揮抗凋亡作用[8]。在胃癌促進(jìn)胃癌惡性進(jìn)展并影響預(yù)后[9]。在食管癌表達(dá)水平與腫瘤大小和瘤內(nèi)血管生成呈正相關(guān)[10]。在非小細(xì)胞肺癌中表達(dá)增加，與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤分期、血管生呈正相關(guān)[11]，但是該研究樣本量過小，其中肺腺癌10例，肺鱗癌11例，TNM各分期的樣本量也很少，肺腺癌與肺鱗癌Ⅱ期與Ⅲ期總共10例。針對非小細(xì)胞肺癌研究的不足，結(jié)合TNM Ⅱ期在臨床上發(fā)病率比I期發(fā)病率高，且MT2-MMP可能影響腫瘤進(jìn)展和預(yù)后，因此需要對II期進(jìn)行更充分的研究，以明確MT2-MMP在肺腺癌中的表達(dá)情況及其臨床意義。

1 材料和方法

1.1 樣本收集

收集2006年1月—2007年12月哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院收治的TNM病理分期Ⅱ期肺腺癌40例，所有樣本均經(jīng)兩名病理科醫(yī)生診斷，癌旁正常組織作為對照組，進(jìn)行HE染色和免疫組化半定量分析。標(biāo)本均經(jīng)4%多聚甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋，4 μm厚連續(xù)切片。

1.2 HE染色

將石蠟切片放入浸泡用的玻璃缸，經(jīng)二甲苯(Ⅰ、Ⅱ，分別15 min)浸泡脫去切片中的石蠟，再經(jīng)由高濃度至低濃度(100%、95%、90%、80%、70%、50%，分別1 min)的梯度乙醇浸泡水化，最后轉(zhuǎn)移至自來水沖洗2 min。浸泡蘇木素5 min染色，再自來水洗1 min，分化液10 s，自來水清洗10 min。浸泡伊紅染色液2 min后將切片浸于梯度乙醇脫水，二甲苯(Ⅰ、Ⅱ)透明。封片干燥后即于光學(xué)顯微鏡下觀察癌組織及癌旁正常組織的形態(tài)。

1.3 免疫組化檢測MT2-MMP表達(dá)

所收取的肺腺癌組織標(biāo)本經(jīng)HE染色證實(shí)符合癌組織形態(tài)結(jié)構(gòu)特征后，將石蠟切片放置在60℃烘箱中烘片至少60 min，二甲苯(Ⅰ、Ⅱ)多次脫蠟，再經(jīng)由高濃度至低濃度的梯度乙醇浸泡水化，最后轉(zhuǎn)移至自來水或PBS沖洗2 min。加入適量枸櫞酸鈉抗原修復(fù)液，在高壓鍋中加熱煮沸并冷卻，漂洗修復(fù)好的石蠟切片3次，每次5 min，封閉內(nèi)源性過氧化氫酶、封閉內(nèi)源性抗原，進(jìn)行MT2-MMP(1∶200)一抗4℃孵育過夜、二抗室溫孵育2 h，滴加適量生物素底物放大信號，然后DAB顯色、蘇木精復(fù)染，最后組織脫水、石蠟透明、封片掃描檢測MT2-MMP的蛋白表達(dá)，分析MT2-MMP在癌組織的表達(dá)情況。根據(jù)腫瘤實(shí)質(zhì)細(xì)胞MT2-MMP染色強(qiáng)度及細(xì)胞陽性率對染色結(jié)果計(jì)分：0分≤陰性≤0.4分、0.5<陽性≤4分，并以2.5分為界將陽性結(jié)果的癌組織樣本進(jìn)一步分為MT2-MMP高、低表達(dá)組。

1.4 TCGA數(shù)據(jù)庫分析

從UCSC(https：//xena.ucsc.edu/public)下載獲得TCGA肺腺癌的基因表達(dá)譜以及肺腺癌樣本的臨床信息。獲得肺腺癌515個(gè)疾病樣本和59個(gè)癌旁樣本，使用臨床表型信息將疾病樣本分為了3個(gè)階段，包括TNM分期Ⅰ期(307)，TNM分期Ⅱ期(153)和TNM分期Ⅲ/Ⅳ(125)?；虮磉_(dá)數(shù)據(jù)使用log2(RSEM+1)進(jìn)行量化，差異分析使用t檢驗(yàn)。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析

使用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，計(jì)數(shù)資料用百分?jǐn)?shù)表示，組間比較采用卡方檢驗(yàn)，配對資料分析采用配對t檢驗(yàn)，P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，采用Image J軟件繪圖。

2 結(jié)果

2.1 MT2-MMP在肺腺癌組織中的表達(dá)

HE染色結(jié)果顯示癌組織表現(xiàn)出明顯的無序增殖特征，肺腺癌細(xì)胞多呈小條索狀排列，形成腺管樣結(jié)構(gòu)，具有明顯的肺癌組織特征。MT2-MMP免疫組化染色結(jié)果顯示在肺腺癌腫瘤實(shí)質(zhì)細(xì)胞呈現(xiàn)明顯的棕黃色染色，表明MT2-MMP在肺腺癌中呈高表達(dá)，在癌旁正常組織中呈低表達(dá)或不表達(dá)(圖1)。

圖1 肺腺癌及癌旁正常組織HE染色和免疫組化分析(200×)

分析40對肺腺癌組織樣本MT2-MMP免疫組化染色結(jié)果，與癌旁組織相比，肺腺癌組織中的MT2-MMP表達(dá)量明顯增高(P<0.01)，提示MT2-MMP表達(dá)上調(diào)可能與肺腺癌有關(guān)(圖2)。

圖2 MT2-MMP在肺腺癌與癌旁正常組織中的相對表達(dá)量

2.2 MT2-MMP表達(dá)與肺腺癌患者臨床信息的相關(guān)性

將40例肺腺癌組織樣本MT2-MMP表達(dá)情況與性別、年齡、腫瘤大小、是否有淋巴轉(zhuǎn)移等臨床信息進(jìn)行分析，結(jié)果顯示MT2-MMP高表達(dá)組與MT2-MMP低表達(dá)組患者間腫瘤大小存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，性別、年齡、是否淋巴轉(zhuǎn)移與MT2-MMP表達(dá)無關(guān)(P>0.05)(表1)。

表1 MT2-MMP表達(dá)與肺腺癌臨床特征分析

2.3 TCGA數(shù)據(jù)庫分析

TCGA數(shù)據(jù)庫分析結(jié)果顯示腫瘤組織相比癌旁組織，MT2-MMP表達(dá)上調(diào)(P<0.001)(圖3)。不同TNM分期階段的癌癥樣本與癌旁樣本MT2-MMP表達(dá)相比(圖4)，不同TNM分期階段的癌組織樣本MT2-MMP表達(dá)均上調(diào)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，表明MT2-MMP的表達(dá)與肺腺癌相關(guān)。但不同TNM分期階段癌癥樣本之間MT2-MMP表達(dá)差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，推測可能與不同分期癌組織的大小與轉(zhuǎn)移情況的復(fù)雜性及所呈現(xiàn)不同的特征有關(guān)。

圖3 TCGA數(shù)據(jù)庫分析肺腺癌組織與癌旁組織中MT2-MMP表達(dá)情況

圖4 TCGA大數(shù)據(jù)分析不同分期肺腺癌MT2-MMP表達(dá)情況

3 討論

肺腺癌的發(fā)生發(fā)展常伴有基因突變、蛋白異常表達(dá)[12-14]，以及細(xì)胞內(nèi)復(fù)雜信號通路異常激活[15]。肺腺癌的進(jìn)展是一個(gè)多階段性過程，包含腫瘤細(xì)胞原位增殖、侵襲、循環(huán)擴(kuò)散、遠(yuǎn)處克隆和血管生成。在這一系列的進(jìn)展過程中，細(xì)胞外基質(zhì)的降解是其中的關(guān)鍵步驟之一，只有完成了對細(xì)胞外基質(zhì)的降解，腫瘤細(xì)胞才能向周圍組織侵襲并進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)，進(jìn)一步進(jìn)入遠(yuǎn)端的器官組織定植形成轉(zhuǎn)移灶。一旦發(fā)展為晚期肺癌，其侵襲及轉(zhuǎn)移進(jìn)展無法遏制且對常規(guī)化療藥物耐受性和敏感性較低，導(dǎo)致預(yù)后極差[16]，因此尋找肺癌早期的診斷標(biāo)志物具有重要意義。

多項(xiàng)研究證據(jù)表明，基質(zhì)金屬蛋白酶在降解細(xì)胞外基質(zhì)過程中起到關(guān)鍵作用。MT2-MMP作為基質(zhì)金屬蛋白酶家族中的一員可能發(fā)揮重要作用。MT2-MMP基因全長3530bp，位于16號染色體上，編碼產(chǎn)生MT2-MMP蛋白。MT2-MMP蛋白定位于細(xì)胞膜表面，多肽鏈由669個(gè)氨基酸組成，包含疏水信號肽序列、前肽區(qū)、催化區(qū)、鉸鏈區(qū)和羧基末端區(qū)，具有鋅離子、鈣離子的結(jié)合位點(diǎn)。其功能不僅可以水解細(xì)胞外基質(zhì)，降解癌細(xì)胞之間的E-鈣粘蛋白導(dǎo)致上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化[17-18]，同時(shí)還可以參與細(xì)胞內(nèi)外信號調(diào)節(jié)，激活其他MMPs酶原(如明膠酶A)變成活化酶[19]。目前已證實(shí)MT2-MMP在肺癌、宮頸癌、胃癌、食管癌、乳腺癌[20]、結(jié)直腸癌[21]及急性骨髓性白血病[22]中均高表達(dá)，并與多種惡性腫瘤的預(yù)后有關(guān)。有研究發(fā)現(xiàn)MT2-MMP可以直接賦予無侵襲能力的細(xì)胞穿透I型膠原蛋白基質(zhì)的能力[23]，參與癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移[24]。Tao等[25]報(bào)道MT2-MMP為上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化進(jìn)程(EMT)中Snai1的一個(gè)直接靶點(diǎn)。Gómez等[26]報(bào)道MT2-MMP的胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域結(jié)合ZO-1，從而允許蛋白酶在上皮連接處裂解E-鈣粘蛋白，同時(shí)促進(jìn)上皮細(xì)胞增殖。此外，MT2-MMP還可以激活MMP-2從而發(fā)揮抗細(xì)胞凋亡的作用，Reimar等[8]發(fā)現(xiàn)MT2-MMP以不依賴TIMP-2的方式結(jié)合MMP-2的HPX結(jié)構(gòu)域。

在肺癌組織中，對MT2-MMP的研究還十分有限。Kobayashi等[27]研究發(fā)現(xiàn)，與支氣管上皮細(xì)胞與Ⅱ型肺泡細(xì)胞相比，MT2-MMP在肺腺癌細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)。Chen等[11]研究發(fā)現(xiàn)，非小細(xì)胞肺癌組織中的MT2-MMP表達(dá)在mRNA水平和蛋白水平均升高，且與腫瘤內(nèi)血管密度(MVD)相關(guān)，但是該研究樣本量過小，需要進(jìn)行更充分的研究?？紤]到TNM Ⅱ期在臨床上發(fā)病率比I期發(fā)病率高，本研究選取40對Ⅱ期肺腺癌的癌組織樣本，通過免疫組化染色觀察到癌組織MT2-MMP表達(dá)明顯高于癌旁正常組織，同時(shí)發(fā)現(xiàn)在癌組織中MT2-MMP的表達(dá)有高表達(dá)和低表達(dá)兩種情況，但以高表達(dá)為主。進(jìn)一步通過TCGA大數(shù)據(jù)進(jìn)行驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)肺腺癌MT2-MMP表達(dá)比癌旁組織明顯上調(diào)，與本研究免疫組化染色結(jié)果相同。另外，MT2-MMP表達(dá)與肺腺癌腫瘤大小呈正相關(guān)，表明MT2-MMP表達(dá)水平可能與肺腺癌的發(fā)生發(fā)展相關(guān)。雖然不同分期的癌癥樣本相比癌旁其表達(dá)均上調(diào)，但不同分期癌癥樣本之間表達(dá)沒有顯著差異，分析原因可能與T3、T4腫瘤的復(fù)雜性有關(guān)，因?yàn)門2的分期主要以腫瘤的大小為考量因素結(jié)合少量的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，而T3、T4的考量因素較為復(fù)雜，主要以轉(zhuǎn)移(淋巴轉(zhuǎn)移與遠(yuǎn)端器官轉(zhuǎn)移)為考量因素，因此判斷MT2-MMP與分期是否相關(guān)，應(yīng)該采取更精細(xì)的樣本分類進(jìn)行分析。

綜上所述，MT2-MMP在肺腺癌中高表達(dá)，并與患者腫瘤大小有關(guān)，可以考慮作為肺腺癌Ⅱ期的診斷標(biāo)志物，進(jìn)行肺腺癌的早期篩查。MT2-MMP可能促進(jìn)肺腺癌的發(fā)生發(fā)展，但由于本研究樣本量并不充足，無法進(jìn)行生存分析等缺點(diǎn)，需要搜集資料更完備的樣本深入研究MT2-MMP的表達(dá)、作用及分子機(jī)制。