吳云樺 譚敏 王子君 孫學(xué)軍 李凡妮

結(jié)腸癌是常見的消化道惡性腫瘤之一，在全球范圍內(nèi)，其發(fā)病率及病死率均位于前列，是嚴(yán)重威脅人類健康的惡性疾病[1]。進(jìn)一步探究結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制，有助于促進(jìn)我們對(duì)該病的認(rèn)識(shí)并尋求有效的治療方式[2]。TMIGD1(Transmembrane and immunoglobulin domain-containing protein 1)是新近發(fā)現(xiàn)的一種細(xì)胞粘附分子，主要表達(dá)于腸和腎臟的上皮細(xì)胞[3]?，F(xiàn)有研究表明，TMIGD1在腎上皮細(xì)胞中高表達(dá)，具有抑制腎上皮細(xì)胞遷移、保護(hù)腎細(xì)胞免受氧化損傷的功能；然而在腎癌細(xì)胞中，其表達(dá)下調(diào)并表現(xiàn)出抑制腎癌細(xì)胞增殖、遷移及細(xì)胞周期等抑癌基因活性[3-4]。另有研究表明，在正常腸道黏膜上皮逐步發(fā)展成為癌前病變及結(jié)腸癌的過程中，TMIGD1含量顯著下降，然其機(jī)制尚不清楚[5]。本研究通過分析TMIGD1在結(jié)腸癌及相應(yīng)癌旁正常結(jié)腸上皮組織中的表達(dá)情況，采用慢病毒包裝系統(tǒng)建立穩(wěn)定過表達(dá)TMIGD1的SW480結(jié)腸癌細(xì)胞株，檢測(cè)TMIGD1對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞增殖、克隆形成、細(xì)胞周期以及遷移和侵襲的影響，并分析其潛在機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 結(jié)腸癌組織、細(xì)胞及病毒轉(zhuǎn)染

采用GEPIA數(shù)據(jù)庫(kù)(http：//gepia.cancer-pku.cn/)對(duì)TMIGD1在結(jié)腸癌組織以及正常腸粘膜組織中表達(dá)情況進(jìn)行對(duì)比，其中包括癌組織275例，正常組織349例。 此外，收集2019年6月—2019年12月在西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院普通外科行手術(shù)切除的結(jié)腸癌組織及其相應(yīng)癌旁正常組織40例，并收集患者臨床病理資料，包括27例男性，13例女性，平均年齡為65歲±12歲。本研究征得所有入組患者同意并簽署知情同意書，通過西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)同意。本研究中使用的人結(jié)腸癌細(xì)胞系SW480由西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)轉(zhuǎn)化中心饋贈(zèng)。細(xì)胞培養(yǎng)于含有10%胎牛血清(四季青)和1%雙抗(Hyclone)的DMEM高糖培養(yǎng)基(Hyclone)，培養(yǎng)條件5%CO2、37℃。TMIGD1過表達(dá)質(zhì)粒購(gòu)自上海吉瑪公司，慢病毒轉(zhuǎn)染嚴(yán)格按照操作說明進(jìn)行。

1.2 免疫組織化學(xué)染色

臨床標(biāo)本置于10%福爾馬林(青島捷世康生物科技有限公司)中固定24 h，然后石蠟包埋并制備4 μm病理切片。抗原修復(fù)采用高壓修復(fù)法，免疫組織化學(xué)SP法染色按照試劑盒說明書進(jìn)行(武漢博士德生物工程有限公司)，TMIGD1抗體(貨號(hào)：bs-9427R，北京博奧森生物技術(shù)有限公司)稀釋濃度為1∶50。免疫組織化學(xué)染色評(píng)分參照既往文獻(xiàn)所述[6]，由兩位獨(dú)立的研究人員進(jìn)行。

1.3 MTT實(shí)驗(yàn)

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，以5 000個(gè)細(xì)胞/孔接種于96孔板中(200 μL/孔)，待細(xì)胞生長(zhǎng)融合后，每孔加入20 μL MTT溶液(上海源葉生物科技有限公司)，培養(yǎng)4 h后棄去孔板中的上清液，每孔加入150 μL DMSO溶液，搖蕩10 min，通過酶標(biāo)儀檢測(cè)吸光度(490 nm)OD值，計(jì)算細(xì)胞增殖率。

1.4 平板克隆形成實(shí)驗(yàn)

于6 cm細(xì)胞培養(yǎng)皿中接種1 000個(gè)細(xì)胞，充分搖勻后放置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)14天，每3～5天更換培養(yǎng)基，并在顯微鏡下定時(shí)觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況，培養(yǎng)14天后，2%結(jié)晶紫溶液對(duì)孔內(nèi)細(xì)胞染色，鏡下拍照并統(tǒng)計(jì)每孔的克隆形成數(shù)目。克隆率=克隆形成數(shù)目/接種細(xì)胞數(shù)目×100%。

1.5 細(xì)胞周期檢測(cè)

于6孔板中接種2×105個(gè)細(xì)胞，培養(yǎng)24 h后使用含EDTA的0.25%胰酶消化細(xì)胞為單細(xì)胞懸液，PBS溶液洗滌2遍后棄上清液，使用預(yù)冷的70%乙醇于-20℃固定過夜。次日離心沉淀細(xì)胞，PBS洗滌1次后加入RNase A，于37℃下孵育30 min以充分降解細(xì)胞內(nèi)RNA，離心并棄去上清液，加入PI染液懸浮細(xì)胞，于4℃避光孵育30 min，通過流式細(xì)胞儀上機(jī)檢測(cè)，結(jié)果用FlowJo軟件進(jìn)行細(xì)胞周期分析。

1.6 Transwell小室實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移和侵襲

以200 μL體積無血清培養(yǎng)基將4×105個(gè)細(xì)胞加入至Transwell小室上層，將含10%血清的完全培養(yǎng)基500 μL加入至下室，于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后4%多聚甲醛固定10 min，使用1%結(jié)晶紫染色30 min，用濕棉簽輕輕擦去小室內(nèi)貼壁細(xì)胞，置于倒置顯微鏡下觀察，隨機(jī)選取5個(gè)高倍鏡視野對(duì)穿膜細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。

1.7 Western blot實(shí)驗(yàn)

使用RIPA蛋白裂解液(西安赫特公司)冰上裂解細(xì)胞30 min后，離心并通過BCA試劑盒(西安赫特公司)進(jìn)行蛋白定量，制備蛋白樣品。分離膠濃度為12%，每孔加入20 μg蛋白，電泳120 min后30 V電壓PVDF轉(zhuǎn)膜過夜，5% BSA/TBST溶液封閉30 min，加入相應(yīng)一抗在4℃孵育過夜，TBST洗滌3次，隨后孵育二抗1 h，TBST洗滌2次后通過電化學(xué)發(fā)光法進(jìn)行檢測(cè)?？贵w信息如下：p21(1∶1 000，Immunoway公司)，Cyclin D1(1∶1 000，Immunoway公司)，E-cadherin(1∶1 000，Proteintech公司)，Vimentin(1∶1 000，Proteintech公司)，Snail1(1∶1 000，Proteintech公司)，GAPDH(1∶1 000，Proteintech公司)。

1.8 細(xì)胞粘附率檢測(cè)

細(xì)胞粘附采用細(xì)胞粘附檢測(cè)試劑盒(北京百奧萊博科技有限公司)進(jìn)行。包被96孔板后，每孔接種5×104個(gè)細(xì)胞，設(shè)置5個(gè)平行對(duì)照。將細(xì)胞于37℃培養(yǎng)30 min后吸除培養(yǎng)基，然后用相應(yīng)的培養(yǎng)基洗滌3次，每孔加入100 μL新鮮培養(yǎng)基，然后加入10 μL細(xì)胞染色液。37℃孵育4 h后通過酶標(biāo)儀于450 nm處測(cè)定各孔的吸光度值。細(xì)胞粘附率(%)=(待測(cè)細(xì)胞OD-空白OD)/(對(duì)照細(xì)胞OD-空白OD)×100%。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

本研究使用SPSS 18.0行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料滿足正態(tài)分布使用t檢驗(yàn)和配對(duì)t檢驗(yàn)，并采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。計(jì)數(shù)資料使用卡方檢驗(yàn)或者Fisher精確檢驗(yàn)。重復(fù)測(cè)量設(shè)計(jì)資料使用重復(fù)測(cè)量方差分析并用Bonferroni法進(jìn)行兩兩比較，P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 TMIGD1在結(jié)腸癌中的表達(dá)情況

通過檢索GEPIA數(shù)據(jù)庫(kù)發(fā)現(xiàn)，相較于癌旁正常組織，TMIGD1在結(jié)腸癌組織中呈低表達(dá)(圖1A)。對(duì)收集的結(jié)腸癌相應(yīng)臨床標(biāo)本進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色發(fā)現(xiàn)，TMIGD1主要表達(dá)在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜，并且腫瘤組織中TMIGD1免疫組織化學(xué)染色評(píng)分明顯低于癌旁正常組織(t=3.013，P=0.003)(圖1B，C)。

圖1 TMIGD1在結(jié)腸癌腫瘤組織和癌旁正常組織中的表達(dá)情況

2.2 結(jié)腸癌組織中TMIGD1的表達(dá)與臨床病理因素的關(guān)系

進(jìn)一步分析結(jié)腸癌中TMIGD1的表達(dá)與患者臨床病理因素之間的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)TMIGD1的陰性表達(dá)與結(jié)腸癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P=0.037)和TNM分期(P=0.022)密切相關(guān)(表1)。

表1 結(jié)腸癌中TMIGD1的表達(dá)與臨床病理因素之間的關(guān)系

2.3 過表達(dá)TMIGD1能夠抑制結(jié)腸癌細(xì)胞SW480的增殖能力

為進(jìn)一步了解TMIGD1對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響，我們構(gòu)建了穩(wěn)定過表達(dá)TMIGD1的細(xì)胞株。通過體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)過表達(dá)TMIGD1后結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖能力自第4天開始受到抑制(P<0.05)(圖2A)，并且克隆形成能力也明顯降低(t=6.236，P=0.003)(圖2B)。結(jié)腸癌細(xì)胞中G0/G1期的細(xì)胞數(shù)目明顯升高(t=8.601，P=0.001)(圖2C)。通過Western blot檢測(cè)細(xì)胞周期相關(guān)蛋白，發(fā)現(xiàn)過表達(dá)TMIGD1細(xì)胞株中p21表達(dá)明顯升高(t=5.768，P=0.004)，而Cyclin D1的表達(dá)明顯降低(t=5.745，P=0.005)(圖2D)。

圖2 過表達(dá)TMIGD1能夠抑制結(jié)腸癌細(xì)胞SW480的增殖

2.4 過表達(dá)TMIGD1能夠抑制結(jié)腸癌細(xì)胞SW480的遷移侵襲能力

Transwell實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)過表達(dá)TMIGD1后，細(xì)胞的遷移能力(t=3.388，P=0.028)和侵襲能力(t=4.571，P=0.010)受到抑制(圖3)，結(jié)合本研究關(guān)于TMIGD1與結(jié)腸癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和TNM分期的相關(guān)性結(jié)果，表明TMIGD1可能影響結(jié)腸癌細(xì)胞株的遷移與侵襲能力。

圖3 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)TMIGD1過表達(dá)組與對(duì)照組細(xì)胞的遷移與侵襲能力(200×)

2.5 TMIGD1能夠促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞SW480的粘附能力

本研究通過Western blot檢測(cè)TMIGD1過表達(dá)組和對(duì)照組中EMT相關(guān)蛋白E-cadherin、Vimentin和Snail1的表達(dá)，但兩組細(xì)胞并無差異(圖4A)。由于TMIGD1是細(xì)胞粘附分子之一，進(jìn)一步檢測(cè)了兩組細(xì)胞的粘附能力，發(fā)現(xiàn)過表達(dá)TMIGD1能夠明顯促進(jìn)細(xì)胞的粘附(t=5.985，P=0.004)(圖4B)。

圖4 TMIGD1對(duì)EMT相關(guān)蛋白及細(xì)胞粘附能力的影響

3 討論

隨著人們生活方式和環(huán)境的改變，結(jié)腸癌的發(fā)病呈上升趨勢(shì)[7]。雖然目前有關(guān)結(jié)腸癌治療的理論和技術(shù)手段已經(jīng)取得了一定的進(jìn)展，但腫瘤轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)仍是影響患者預(yù)后的重要因素[8-9]。因此，積極探究結(jié)腸癌的發(fā)生發(fā)展機(jī)制，尋求新的治療靶點(diǎn)是目前的研究熱點(diǎn)之一。

TMIGD1屬于新近發(fā)現(xiàn)的一類細(xì)胞表面粘附分子，本研究旨在探究TMIGD1與結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)系。通過生物信息學(xué)GEPIA數(shù)據(jù)庫(kù)分析發(fā)現(xiàn)，相較于癌旁正常組織，TMIGD1在結(jié)腸癌中呈現(xiàn)低表達(dá)；隨后本研究對(duì)收集的結(jié)腸癌臨床標(biāo)本進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色，進(jìn)一步證實(shí)了該結(jié)果，并且發(fā)現(xiàn)TMIGD1的陰性表達(dá)與結(jié)腸癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和TNM分期密切相關(guān)。此前已有研究發(fā)現(xiàn)TMIGD1在結(jié)腸癌組織中呈現(xiàn)低表達(dá)[10]，與本研究結(jié)果一致。

本研究進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，過表達(dá)TMIGD1能夠降低SW480細(xì)胞增殖及克隆形成能力，并將細(xì)胞周期阻滯在G0/G1期；同時(shí)，過表達(dá)TMIGD1細(xì)胞株中p21表達(dá)明顯升高，而Cyclin D1的表達(dá)明顯降低，提示TMIGD1可能通過影響調(diào)控細(xì)胞周期的相關(guān)蛋白來抑制細(xì)胞的增殖。此前，Meyer等[4]研究發(fā)現(xiàn)過表達(dá)TMIGD1通過活化p38蛋白的磷酸化上調(diào)p21等蛋白的表達(dá)，從而抑制腎癌細(xì)胞的增殖，這與本研究的結(jié)果相符；此外，該研究進(jìn)一步在基因水平發(fā)現(xiàn)C/EBPβ/TMIGD1信號(hào)通路在調(diào)控腎癌細(xì)胞TMIGD1表達(dá)方面發(fā)揮了顯著作用。后續(xù)研究需進(jìn)一步驗(yàn)證該機(jī)制在結(jié)腸癌中的作用，并探索是否存在新的分子機(jī)制。

惡性腫瘤的重要特征之一是局部侵襲和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移[11]，本研究發(fā)現(xiàn)過表達(dá)TMIGD1可以明顯抑制SW480細(xì)胞的遷移和侵襲能力。上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)是目前影響腫瘤轉(zhuǎn)移的常見假說，即上皮細(xì)胞在特定條件下轉(zhuǎn)化為間質(zhì)細(xì)胞，失去極性及正常的細(xì)胞間連接，變成具有間質(zhì)細(xì)胞形態(tài)和特性的一類細(xì)胞[12]。既往研究表明，EMT過程能夠賦予細(xì)胞遷移侵襲能力，與患者預(yù)后不良密切相關(guān)[13]。本研究中，Western blot結(jié)果顯示TMIGD1對(duì)EMT相關(guān)蛋白E-cadherin、Vimentin和Snail1的表達(dá)均無影響，提示TMIGD1抑制腫瘤轉(zhuǎn)移的機(jī)制與EMT無關(guān)。而隨后對(duì)細(xì)胞粘附能力檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)TMIGD1能夠明顯促進(jìn)細(xì)胞的粘附。這與TMIGD1促進(jìn)腎小管上皮細(xì)胞與基底膜的粘附這一結(jié)論相符[4]。然而，關(guān)于TMIGD1促進(jìn)細(xì)胞粘附的具體分子機(jī)制尚不清楚。

目前，對(duì)于TMIGD1在結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展過程中作用的認(rèn)識(shí)仍較局限，后續(xù)研究應(yīng)進(jìn)一步探索其相應(yīng)的分子機(jī)制；另外，應(yīng)將對(duì)TMIGD1的研究與臨床緊密結(jié)合，進(jìn)一步分析TMIGD1的表達(dá)與患者病情及預(yù)后之間的關(guān)系，從而為尋求新的結(jié)腸癌診斷及治療方式做鋪墊。

綜上所述，本研究表明TMIGD1在結(jié)腸癌中低表達(dá)，其與結(jié)腸癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和TNM分期密切相關(guān)。過表達(dá)TMIGD1可以抑制SW480結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖、克隆形成、細(xì)胞周期進(jìn)展以及遷移和侵襲能力，并促進(jìn)細(xì)胞的粘附過程，提示TMIGD1可能在結(jié)腸癌進(jìn)展中發(fā)揮抑癌基因的作用，具有作為腫瘤早期診斷標(biāo)志物的潛在作用，并可為結(jié)腸癌的靶向治療提供新的參考和方向。