陸妹英

（柳州市工人醫(yī)院，廣西 柳州 545005）

宮頸癌是女性最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一。相關(guān)的調(diào)查數(shù)據(jù)顯示，宮頸癌的發(fā)病率排在全球女性惡性腫瘤發(fā)病率的第四位。宮頸癌患者在發(fā)病的初期無(wú)特異性癥狀，其病情易被誤診為其他疾病。多數(shù)此病患者的病情被確診時(shí)往往已經(jīng)進(jìn)展至中晚期，進(jìn)而延誤了治療的時(shí)機(jī)[1]。對(duì)宮頸癌患者的病情進(jìn)行早期篩查及確診對(duì)改善其預(yù)后具有重要的意義。大量的流行病學(xué)及分子生物學(xué)研究結(jié)果顯示，持續(xù)存在的高危型人乳頭狀瘤病毒（HPV）感染是導(dǎo)致宮頸癌及宮頸癌癌前病變的主要病因[2]。HPV是一種無(wú)包膜病毒，由8000個(gè)堿基對(duì)組成的雙鏈環(huán)狀DNA及正二十面體蛋白質(zhì)衣殼組成。HPV感染可分為黏膜表面感染和皮膚感染[3]。本次研究主要探討三種HPV-DNA檢測(cè)法在篩查高危型HPV感染中的應(yīng)用效果。

1 資料與方法

1.1 一般資料

本次研究的對(duì)象為2019年1月至2020年10月期間在柳州市工人醫(yī)院接受婦科檢查的21 965例受檢者。這21 965例受檢者均知曉本次研究的內(nèi)容，并簽署了參加本次研究的知情同意書。本次研究對(duì)象的排除標(biāo)準(zhǔn)是：1）臨床資料不全者。2）中途退出本次研究者。這21 965例受檢者的年齡為19～99歲，平均年齡為（65.6±9.4）歲。按照檢測(cè)方法的不同將這21 965例受檢者分為DH3法組（n=12 648）、HPV原位雜交法組（n=5）和實(shí)時(shí)熒光定量PCR法組（n=9312）。本次研究獲得了柳州市工人醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)。

1.2 研究方法

對(duì)DH3法組受檢者使用DH3法進(jìn)行HPV-DNA檢測(cè)，方法是：1）采集受檢者宮頸部位的脫落細(xì)胞作為檢測(cè)標(biāo)本。2）將檢測(cè)標(biāo)本滴入DH3 HPV核酸檢測(cè)試劑盒的捕獲微孔板中，嚴(yán)格按照試劑盒的質(zhì)控要求進(jìn)行操作。3）根據(jù)試劑盒底物的光強(qiáng)度判斷HPV-DNA的數(shù)量。對(duì)HPV原位雜交法組受檢者使用HPV原位雜交法進(jìn)行HPV-DNA檢測(cè)，方法是：1）用一次性宮頸軟毛刷采集受檢者宮頸部位的脫落細(xì)胞放入標(biāo)本瓶中。2）用過(guò)濾器濾出細(xì)胞后移至載玻片上，采用三步法對(duì)細(xì)胞涂片進(jìn)行染色。先在細(xì)胞涂片上加入地高辛抗體識(shí)別地高辛并標(biāo)記靶點(diǎn)，再加入兔抗鼠抗體與地高辛抗體進(jìn)行結(jié)合，然后加入辣根過(guò)氧化物酶檢測(cè)試劑。將3.3-二氨基聯(lián)苯胺（DAB）作為顯色底物，對(duì)細(xì)胞涂片進(jìn)行顯色后，根據(jù)雜交信號(hào)的有無(wú)判斷是否感染HPV。當(dāng)細(xì)胞核呈黃色、棕黃色或棕褐色著色、但細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜無(wú)著色時(shí)即可判定HPV陽(yáng)性。對(duì)實(shí)時(shí)熒光定量PCR法組受檢者使用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法進(jìn)行HPV-DNA檢測(cè)，方法是：1）采集受檢者宮頸部位的脫落細(xì)胞作為檢測(cè)標(biāo)本。2）使用實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀及配套試劑盒對(duì)檢測(cè)標(biāo)本進(jìn)行HPV-DNA檢測(cè)。對(duì)三組受檢者中HPV-DNA檢測(cè)結(jié)果呈陽(yáng)性者進(jìn)行陰道鏡活檢，方法是：1）對(duì)受檢者的陰道進(jìn)行清潔、消毒后，使用活檢鉗咬取其可疑病變部位一定量的組織作為標(biāo)本送至病理科。要求患者在采集標(biāo)本前的3 d內(nèi)無(wú)性交活動(dòng)及陰道用藥史，且處于非月經(jīng)期。2）對(duì)組織標(biāo)本進(jìn)行切片、包埋、染色處理后，觀察其細(xì)胞和組織的形態(tài)結(jié)構(gòu)變化的情況。3）根據(jù)患者組織標(biāo)本的細(xì)胞及組織形態(tài)結(jié)構(gòu)，判定其是否發(fā)生HPV感染及HPV感染的程度[4]。

1.3 觀察指標(biāo)

觀察三組受檢者進(jìn)行陰道鏡活檢結(jié)果與進(jìn)行HPV-DNA檢測(cè)結(jié)果的符合率。符合率﹦陰道鏡活檢高危型HPV感染的例數(shù)∕HPV-DNA檢測(cè)陽(yáng)性的例數(shù)×100%。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

對(duì)本次研究中的數(shù)據(jù)均采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料用百分比（%）表示，采用χ2檢驗(yàn)。以P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

進(jìn)行陰道鏡活檢的結(jié)果為，DH3法組中高危型HPV感染者有546例患者，HPV原位雜交法組中高危型HPV感染者有5例，實(shí)時(shí)熒光定量PCR法組中高危型HPV感染者有332例。DH3法組受檢者陰道鏡活檢結(jié)果與HPV-DNA檢測(cè)結(jié)果的符合率為89.22%（546∕612），HPV原位雜交法組受檢者陰道鏡活檢結(jié)果與HPV-DNA檢測(cè)結(jié)果的符合率為100%（5∕5），實(shí)時(shí)熒光定量PCR法組受檢者陰道鏡活檢結(jié)果與HPV-DNA檢測(cè)結(jié)果的符合率為93.26%（332∕356）。詳見(jiàn)表1。

表1 三組受檢者檢測(cè)結(jié)果的比較

3 討論

相關(guān)的調(diào)查結(jié)果顯示，有90%以上的宮頸癌患者是由高危型HPV感染所致[5]。宮頸癌患者在發(fā)病的初期會(huì)出現(xiàn)接觸性出血、陰道排液異味等癥狀，當(dāng)其病情發(fā)展至中晚期還會(huì)出現(xiàn)不規(guī)則陰道流血及感染等癥狀。目前，臨床上檢測(cè)HPV-DNA的方法有DH3法、HPV原位雜交法和實(shí)時(shí)熒光定量PCR法等。DH3 HPV核酸檢測(cè)試劑盒是一種快速HPV-DNA檢測(cè)試劑盒。該試劑盒中的變性試劑可使宮頸脫落細(xì)胞HPV的雙鏈DNA變性分解成單鏈DNA，單鏈DNA可與特異性RNA探針結(jié)合為DNA-RNA雜合體，DNARNA雜合體與捕獲微孔板上的特異性抗體相結(jié)合后，與偶聯(lián)堿性磷酸酶的抗DNA-RNA雜合體中的特異性抗體相結(jié)合后會(huì)在酶促反應(yīng)下發(fā)光，然后觀察者可根據(jù)底物的光強(qiáng)度判斷HPV-DNA的數(shù)量。DH3 HPV核酸檢測(cè)試劑盒中的特異性RNA探針可與HPV的14種亞型相結(jié)合，形成14種DNA-RNA雜合體，能夠有效地避免假陰性及假陽(yáng)性檢測(cè)結(jié)果的產(chǎn)生，適用于對(duì)宮頸疾病的初步篩查及定性監(jiān)測(cè)。HPV原位雜交法主要是通過(guò)三步法對(duì)細(xì)胞涂片進(jìn)行染色，再將DAB作為顯色底物對(duì)細(xì)胞進(jìn)行顯色，然后根據(jù)雜交信號(hào)的有無(wú)判斷是否感染HPV，當(dāng)細(xì)胞核呈黃色、棕黃色或棕褐色著色、但細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜無(wú)著色時(shí)即可判定HPV陽(yáng)性。HPV原位雜交法可以準(zhǔn)確定位HPV細(xì)胞，明確組織細(xì)胞中HPV的位置及感染的程度。但是，由于本次研究中HPV原位雜交法組納入的樣本量較少，故未能準(zhǔn)確地反映出HPV原位雜交法檢測(cè)HPV-DNA的效果。實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)主要是利用DNA變性與復(fù)性原理，對(duì)宮頸脫落細(xì)胞進(jìn)行特定的DNA片段高效擴(kuò)增，特異性引物及探針?lè)謩e與靶序列相結(jié)合，Taq酶在引物的引導(dǎo)下復(fù)制靶序列，遇到結(jié)合2條引物之間的探針時(shí)發(fā)揮“5”游離端外切酶的功能，使探針?biāo)庑纬捎坞x羧基熒光素發(fā)射熒光，合成HNA鏈發(fā)射的熒光信號(hào)量的增加與序列指數(shù)的增長(zhǎng)呈正相關(guān)。但是，使用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)HPV-DNA時(shí)，不僅需要使用專用的實(shí)驗(yàn)室，而且對(duì)檢測(cè)人員的技術(shù)要求較高，不適于作為普查HPV感染的檢測(cè)方法[6]。上述研究結(jié)果說(shuō)明，與使用HPV原位雜交法和實(shí)時(shí)熒光定量PCR法相比，使用DH3法進(jìn)行HPV-DNA檢測(cè)具有操作簡(jiǎn)便、無(wú)需PCR實(shí)驗(yàn)室、對(duì)操作人員無(wú)特殊資質(zhì)要求、價(jià)格低廉等特點(diǎn)，適合在各醫(yī)療機(jī)構(gòu)中推廣應(yīng)用。

綜上所述，使用DH3 HPV-DNA檢測(cè)法、HPV原位雜交 HPV-DNA檢測(cè)法和實(shí)時(shí)熒光定量PCR HPV-DNA檢測(cè)法篩查高危型HPV感染均具有較高的應(yīng)用效果。與應(yīng)用HPV原位雜交 HPV-DNA檢測(cè)法和實(shí)時(shí)熒光定量PCR HPV-DNA檢測(cè)法相比，用DH3 HPV-DNA檢測(cè)法篩查高危型HPV感染更為簡(jiǎn)單、方便、快捷，更適用于對(duì)HPV感染進(jìn)行大范圍的篩查。