張宇哲,王秀華,于黨輝,王楓林,孫祥山,黃經(jīng)獻(xiàn)

(1.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部海水養(yǎng)殖病害防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 青島市海水養(yǎng)殖流行病學(xué)與生物安保重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 青島 266071； 2.上海海洋大學(xué) 水產(chǎn)與生命學(xué)院，上海 201306； 3.青島海洋科學(xué)與技術(shù)試點(diǎn)國家實(shí)驗(yàn)室 海洋漁業(yè)科學(xué)與食物產(chǎn)出過程功能實(shí)驗(yàn)室，山東 青島 266071； 4.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院下營增殖站，山東 濰坊 261312)

弧菌病是海水養(yǎng)殖動(dòng)物的重要病害之一，給海水魚、蝦和貝類養(yǎng)殖帶來了嚴(yán)重危害。目前，針對(duì)弧菌病的生物防控，研究人員已發(fā)現(xiàn)有多種微生物對(duì)弧菌具有拮抗活性[1-3]，其中，殺魚假交替單胞菌Pseudoalteromonaspiscicida是極具開發(fā)潛力的一種菌，該菌不僅抗菌譜廣[4]，而且還可提高動(dòng)物的免疫力，將殺魚假交替單胞菌用于養(yǎng)殖期對(duì)蝦及貝類也表現(xiàn)出良好的生物安全性[5-6]。然而也有研究顯示，有些殺魚假交替單胞菌分離株可感染克氏雙鋸魚Amphiprionclarkii卵，導(dǎo)致其存活率較低[7]。喬毅等[8]報(bào)道，一株與殺魚假交替單胞菌同源性較近的菌株對(duì)黑鯛表現(xiàn)出一定的致病性。

細(xì)菌毒性來自其含有的內(nèi)外毒素，內(nèi)毒素主要為細(xì)菌脂多糖[9]，外毒素種類較多，按照作用的靶組織，分為細(xì)胞毒素、神經(jīng)毒素和腸毒素[10]。假交替單胞菌多為海洋菌株，其內(nèi)毒素毒性通常較低[11]，但研究發(fā)現(xiàn)，有些假交替單胞菌可分泌細(xì)胞毒素，誘導(dǎo)白血病細(xì)胞凋亡或溶血[12-13]，而有些種類能夠分泌神經(jīng)毒性的河豚毒素[14]，目前對(duì)殺魚假交替單胞菌的毒性研究尚未見報(bào)道。本研究中，針對(duì)前期篩選出的一株具有廣譜弧菌拮抗特性的殺魚假交替單胞菌，測試了其對(duì)中國明對(duì)蝦Fenneropenaeuschinensis受精卵及幼體發(fā)育的影響，以及對(duì)凡納濱對(duì)蝦Litopenaeusvannamei、魚及羊血細(xì)胞的溶血活性，為去除其潛在毒性，還探討了熱處理對(duì)菌株滅活、溶血活性和抗菌物質(zhì)活性的影響，以期為該菌的開發(fā)應(yīng)用提供技術(shù)及方法支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)用中國明對(duì)蝦受精卵、無節(jié)幼體和蚤狀幼體由中國水產(chǎn)科學(xué)研究院下營增殖實(shí)驗(yàn)站提供。

殺魚假交替單胞菌2515(簡稱菌株2515)、地衣芽孢桿菌Bacilluslicheniformis、對(duì)照組假交替單胞菌2905(簡稱菌株2905)和金黃色葡萄球菌Staphylococcusaureus均由農(nóng)業(yè)農(nóng)村部海水養(yǎng)殖病害防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存。TCBS培養(yǎng)基、羊血平板均購自北京路橋技術(shù)股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1 培養(yǎng)基及血平板制備 TCBS培養(yǎng)基：配制方法參照說明書。2216E培養(yǎng)基：胰蛋白胨5 g、酵母膏1 g、FePO4·4H2O 0.01 g、瓊脂粉16 g(固體培養(yǎng)基)、陳海水1 L，pH 7.8，121 ℃高壓滅菌15 min。

魚血平板制備：用無菌注射器抽取大菱鲆尾靜脈血液，置入等體積的阿氏液(Na3C6H5O7·2H2O 1.60 g、C6H8O70.11 g、C6H12O64.10 g、NaCl 0.84 g、蒸餾水200 mL，pH 6.1，115 ℃滅菌30 min)輕輕搖勻備用。將滅菌后的2216E固體培養(yǎng)基冷卻至40～50 ℃時(shí)，加入10%的魚血備用液，搖勻后倒平板。

1.2.2 菌液制備 將菌株2515和地衣芽孢桿菌分別接種于2216E固體平板，于28 ℃下培養(yǎng)活化后再接種到液體培養(yǎng)基中，在28 ℃ 下以150 r/min搖床培養(yǎng)24 h，菌液經(jīng)過6 000×g離心10 min，將沉淀用海水稀釋成1×109CFU/mL菌懸液，4 ℃下冷藏帶到試驗(yàn)場地，根據(jù)試驗(yàn)設(shè)計(jì)濃度稀釋后使用。

1.2.3 菌株2515對(duì)中國明對(duì)蝦受精卵孵化及幼體發(fā)育成活影響試驗(yàn)

1)幼體成活試驗(yàn)。試驗(yàn)用對(duì)蝦育苗袋(直徑25 cm，高40 cm)132個(gè)，分別加入經(jīng)過消毒殺菌處理的育苗用海水2 L作為試驗(yàn)水體。根據(jù)幼體發(fā)育階段設(shè)置3個(gè)試驗(yàn)，分別測試菌株2515對(duì)中國明對(duì)蝦蝦受精卵孵化至無節(jié)幼體Ⅲ期(N3)、N3發(fā)育至蚤狀幼體Ⅰ期(Z1)、蚤狀幼體Ⅱ期(Z2)發(fā)育至糠蝦幼體Ⅰ期(M1)成活率的影響，每個(gè)試驗(yàn)均設(shè)置地衣芽孢桿菌陽性對(duì)照組及空白對(duì)照組，菌株2515及地衣芽孢桿菌均設(shè)置105、106、107、108CFU/mL 4個(gè)濃度，每個(gè)濃度設(shè)3組平行。蝦受精卵孵化至N3期試驗(yàn)中，每個(gè)袋投入中國明對(duì)蝦受精卵800個(gè)；N3至Z1期、Z2至M1期試驗(yàn)中，每個(gè)袋中投入相應(yīng)期別的幼體40個(gè)。在受精卵孵化至N3期、 N3發(fā)育至Z1期試驗(yàn)中，試驗(yàn)水體中不添加任何餌料；Z2發(fā)育至M1期試驗(yàn)中，每袋添加鹵蟲幼體600個(gè)，經(jīng)充氧氣后打包，放在育苗池中水浴。受精卵孵化期、N3發(fā)育至Z1期、Z2發(fā)育至M1期的溫度分別控制在17、20、23 ℃，試驗(yàn)用海水pH 7.8、鹽度30。在各期試驗(yàn)結(jié)束后，將試驗(yàn)袋內(nèi)幼體用網(wǎng)目為125 μm的篩絹網(wǎng)過濾到燒杯中逐尾計(jì)數(shù)，并統(tǒng)計(jì)成活率：

成活率=試驗(yàn)結(jié)束時(shí)存活數(shù)量/試驗(yàn)初始投放數(shù)量×100%。

2)幼體發(fā)育觀察。中國明對(duì)蝦受精卵孵化至N3期時(shí)，從各組隨機(jī)挑出無節(jié)幼體5尾，通過光鏡觀察幼體體表、附肢和活力情況，評(píng)價(jià)菌株2515對(duì)幼體發(fā)育的影響。

1.2.4 溶血試驗(yàn)

英美新批評(píng)理論是對(duì)19世紀(jì)西方文學(xué)研究中對(duì)社會(huì)歷史、政治、傳記、心理等傾向的反撥與糾偏，以此重新突顯文學(xué)研究中作品文本中心這一向度。作為一種策略，文本細(xì)讀以及其他的策略，使得這一批評(píng)理論流派得以確立。美國華人學(xué)者與英美新批評(píng)之間有著復(fù)雜的糾纏，他們自覺或不自覺地在現(xiàn)代漢詩的相關(guān)研究中透露出英美新批評(píng)的理論視角與觀念方法。然而，理論的旅行總會(huì)發(fā)生變異，因具體歷史文化語境與觀照對(duì)象的變化，美國華人學(xué)者在英美新批評(píng)視野下開展的現(xiàn)代漢詩批評(píng)實(shí)踐也產(chǎn)生不一樣的效應(yīng)。這些效應(yīng)彰顯了他們的研究所具有的詩學(xué)意義與文化價(jià)值。

1)血平板溶血觀察。刮取菌株2515、金黃色葡萄球菌及菌株2905的2216E平板菌落，分別用PBS制成濃度為109CFU/mL的菌懸液，各取5 μL等距點(diǎn)種在羊血瓊脂和魚血瓊脂平板上，每種菌株設(shè)3個(gè)重復(fù)。28 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h，觀察溶血情況。

2)蝦細(xì)胞溶血顯微觀察。從凡納濱對(duì)蝦Litopenaeusvannamei圍心腔抽取血液淋巴與等體積的阿氏液混合作為對(duì)蝦血細(xì)胞懸液，取5 μL對(duì)蝦血細(xì)胞懸液與等體積的菌株2515發(fā)酵液(濃度108CFU/mL)混合后，滴加在載玻片上，改好蓋玻片，置于濕盒中4 ℃條件下計(jì)時(shí)存放，顯微鏡下間隔1 h觀察1次蝦血細(xì)胞的溶血情況，并設(shè)置生理鹽水及大菱鲆血細(xì)胞對(duì)照組。

1.2.5 熱處理對(duì)菌株2515的滅活效果 取發(fā)酵24 h的菌株2515發(fā)酵液，用PBS稀釋成103CFU/mL,分裝到6個(gè)無菌的1.5 mL離心管中，每管400 μL，分別置于40、45、50、55、60、65 ℃的水浴鍋中加熱處理1 h，空白組常溫放置1 h，之后從每管取100 μL涂布于2216E平板。每個(gè)樣品設(shè)3個(gè)平行，28 ℃下培養(yǎng)，觀察有無菌落形成，統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)量。

1.2.6 熱處理后菌株2515的溶血活性 取“1.2.5節(jié)”中經(jīng)40 ℃和55 ℃不同時(shí)間熱處理后的菌株2515處理液，按照“1.2.4”節(jié)中血平板溶血觀察方法，點(diǎn)種在魚血與羊血平板上，觀察處理液的溶血活性。

1.2.7 熱處理對(duì)菌株2515抑菌活性的影響 取菌株2515發(fā)酵液(濃度3.9×109CFU/mL)110 mL，以5 000×g離心10 min，棄上清，將沉淀用PBS洗滌2次后，加50 mL PBS重懸，用超聲波細(xì)胞破碎儀超聲破碎10 min(300 W)，至菌液澄清。將澄清的菌液經(jīng)0.22 μm孔徑的細(xì)菌過濾器過濾，之后置于平皿中-20 ℃下真空干燥12 h。再用20 mL PBS將干燥后的產(chǎn)物洗脫混勻，之后分裝到無菌1.5 mL離心管中(每管0.2 mL)，分別在40、45、50、55、60、65、75 ℃水浴鍋中進(jìn)行溫浴處理，每個(gè)溫度設(shè)置15、30、45、60 min 4個(gè)處理時(shí)間段，對(duì)照組常溫放置，每組設(shè)3個(gè)平行。完成熱處理后參照李萍等[15]的方法進(jìn)行抑菌活性測定，測試用2216E平板含有鰻弧菌Vibrioanguillarum濃度為107CFU/mL，經(jīng)28 ℃培養(yǎng)24 h后，用游標(biāo)卡尺十字交叉法測量抑菌圈直徑，根據(jù)抑菌圈直徑大小計(jì)算菌株2515抗菌活性物質(zhì)的抑菌活性增長率，即

抑菌活性增長率=(De-D0)/D0×100%。

其中,De、D0分別為試驗(yàn)組和對(duì)照組抑菌圈直徑。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±S.D.)表示。采用SPSS 16.0軟件進(jìn)行單因素方差分析，采用Duncan法進(jìn)行組間多重比較，顯著性水平設(shè)為0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株2515對(duì)中國明對(duì)蝦幼體發(fā)育的影響

從圖1可見：相同濃度組中，添加菌株2515與添加地衣芽孢桿菌陽性對(duì)照組無節(jié)幼體的成活率均無顯著性差異(P>0.05)；在所有試驗(yàn)組中，添加濃度為105CFU/mL 2515菌株的幼體成活率最高，顯著高于添加濃度為106、108CFU/mL的地衣芽孢桿菌組(P<0.05)，也顯著高于添加濃度107、108CFU/mL的菌株2515組(P<0.05)；空白對(duì)照組與各濃度組均無顯著性差異(P>0.05)。顯微觀察各組無節(jié)幼體的外形特征，可見各試驗(yàn)組無節(jié)幼體活力較好，體表干凈，附肢發(fā)育正常，未出現(xiàn)彎曲現(xiàn)象。這表明，所選擇的濃度范圍內(nèi)，菌株2515對(duì)中國明對(duì)蝦受精卵孵化至N3期的成活率無明顯影響。

標(biāo)有不同字母者表示組間有顯著性差異(P<0.05)，標(biāo)有相同字母者表示組間無顯著性差異(P>0.05),下同。

從圖2可見：各濃度組對(duì)蝦的成活率差別較大，相同濃度組中，添加菌株2515與添加地衣芽孢桿菌陽性對(duì)照組的成活率中僅濃度為105CFU/mL的組與空白對(duì)照組無顯著性差異(P>0.05)，其他組均顯著低于空白對(duì)照組(P<0.05)，而添加濃度為106、107CFU/mL的兩組中，添加2515菌株的對(duì)蝦成活率顯著低于添加地衣芽孢桿菌組(P<0.05)；在所有添加菌株2515的組中，隨著添加濃度的升高對(duì)蝦的存活率呈降低趨勢。這表明，在本試驗(yàn)條件下，菌株2515濃度高于105CFU/mL時(shí)對(duì)中國明對(duì)蝦由N3期發(fā)育至Z1期有顯著性影響，可顯著降低無節(jié)幼體變態(tài)發(fā)育至蚤狀幼體的成活率。

圖2 N3到Z1期變態(tài)成活率

從圖3可見，各試驗(yàn)組與添加地衣芽孢菌組及空白對(duì)照組的對(duì)蝦成活率均無顯著性差異(P>0.05)。

圖3 Z2到M1期變態(tài)成活率

2.2 菌株2515的溶血性

從圖4可見，菌株2515在兩種血平板上均具有溶血活性，陽性對(duì)照組金黃色葡萄球菌在羊血平板上產(chǎn)生溶血，對(duì)照組假交替單胞菌株2905在羊血平板上未產(chǎn)生溶血，而在魚血平板上產(chǎn)生溶血。

圖4 菌株2515對(duì)羊血和魚血的溶血情況

大菱鲆血細(xì)胞試驗(yàn)組，在加入菌株2515 3 h后，紅細(xì)胞出現(xiàn)細(xì)胞膜溶解(圖5C)，胞內(nèi)物質(zhì)固縮變形，有些趨于解體，白細(xì)胞則不發(fā)生溶血，而大菱鲆生理鹽水對(duì)照組放置18 h后(圖5B)，白細(xì)胞及紅細(xì)胞的形態(tài)仍然完整；對(duì)蝦血細(xì)胞試驗(yàn)組(圖5G)與對(duì)蝦生理鹽水對(duì)照組(圖5F)中，在加入菌株2515及生理鹽水18 h時(shí)，兩組對(duì)蝦血細(xì)胞形態(tài)相似，細(xì)胞的形態(tài)均趨于收縮變圓，但外形完整，未出現(xiàn)溶血現(xiàn)象。

A—試驗(yàn)開始前大菱鲆血細(xì)胞；B—在生理鹽水中18 h的大菱鲆血細(xì)胞；C—在菌液中3 h的大菱鲆血細(xì)胞；D—圖C中方框區(qū)域的放大圖片；E—溶血開始前蝦血細(xì)胞；F—在生理鹽水中18 h的蝦血細(xì)胞；G—在菌液中18 h的蝦血細(xì)胞。圖中白色箭頭為大菱鲆紅細(xì)胞；黑色箭頭為大菱鲆白細(xì)胞；左向空心箭頭為不同類型蝦血細(xì)胞；魚尾箭頭為菌體。

2.3 熱處理對(duì)菌株2515的滅活效果

菌株2515經(jīng)不同溫度滅活1 h后，涂布于2216E平板培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)40 ℃處理組中，平板上菌株2515菌落數(shù)與未處理組數(shù)量相近，分別為(88±12)CFU/平板與(90±8)CFU/平板，在45 ℃處理組中2515菌落數(shù)為(77±5)CFU/平板，而在50、55、60、65 ℃處理組平板上，無細(xì)菌生長，表明50 ℃熱處理1 h即可將該菌滅活。

2.4 熱處理后菌株2515的溶血活性

破碎液經(jīng)40、55 ℃處理15～60 min后，各組破碎液失去對(duì)魚紅細(xì)胞溶血作用(圖6A、B)，而對(duì)羊紅細(xì)胞的溶血效果依然保持較高的活性(圖6C、D)。

A、B—40、55 ℃處理組大菱鲆血平板；C、D—40、55 ℃處理組羊血平板。

2.5 熱處理對(duì)菌株2515抑菌活性的影響

從圖7、圖8可見：當(dāng)處理溫度為40～65 ℃時(shí)，各處理時(shí)間組的抑菌活性均比對(duì)照組高，但抑菌活性存在差別；當(dāng)溫度為55 ℃時(shí)，抑菌活性增長最高，隨著處理時(shí)間從15 min增加到60 min，抑菌活性增長率由46.1%提高到55.8%；當(dāng)溫度為65 ℃時(shí)，處理15 min活性增加最高，達(dá)到33.3%，之后隨時(shí)間延長而降低；當(dāng)溫度為75 ℃時(shí)，處理15 min即可降低抑菌活性，處理45 min時(shí)即可使抑菌活性完全失活，增長率達(dá)到-100%。

圖7 菌株2515在不同溫度下滅活不同時(shí)間對(duì)鰻弧菌的抑菌效果

圖8 熱處理菌株破碎液后抑菌物質(zhì)活性的增長率

3 討論

3.1 殺魚假交替單胞菌生物學(xué)功能

目前，已發(fā)現(xiàn)假交替單胞菌屬細(xì)菌中有20余種能夠產(chǎn)生活性物質(zhì)，其功效包括降解瓊膠、抗細(xì)菌、抗真菌、殺菌、促進(jìn)水生動(dòng)物幼體附著等[16]。殺魚假交替單胞菌作為其中的一個(gè)種，不僅能分泌廣譜抗菌活性物質(zhì)[17]，還可產(chǎn)生蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶和甘露糖酶，用該菌作益生菌并通過鹵蟲作為載體投喂對(duì)蝦幼體，能夠提高對(duì)蝦生長率、存活率和腸道總菌數(shù)[18]。菌株2515是從對(duì)蝦養(yǎng)殖池分離出的一株殺魚假交替單胞菌[4]，該菌株具有廣譜抗弧菌特性，而對(duì)其生物安全性尚未有系統(tǒng)研究。本研究中，初步確定了該菌對(duì)魚類的溶血毒性及對(duì)中國明對(duì)蝦幼體的潛在毒性，獲得了對(duì)已知毒素的熱減毒方法，而對(duì)其潛在的其他毒性物質(zhì)種類及致病力尚需后續(xù)開展研究。

3.2 菌株2515的溶血素及其熱穩(wěn)定性

溶血素為細(xì)菌的外毒素，種類較多，其均為單鏈多肽蛋白，溶血素的溶血活性是衡量細(xì)菌毒力的因子之一，根據(jù)溶血素結(jié)構(gòu)、其與細(xì)胞結(jié)合的方式及形成孔道的機(jī)制等不同，可將溶血素分為重復(fù)子毒素家族和硫醇活性膽固醇結(jié)合細(xì)胞溶血素家族[19]。溶血素可導(dǎo)致細(xì)胞溶解或裂解、細(xì)胞膜損傷等病變，進(jìn)一步導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)鈉、鉀、鈣離子失衡及細(xì)胞凋亡[20]。溶血素在同種細(xì)菌的不同分離株中，其基因編碼、數(shù)量和基因表達(dá)存在差異[21]，弧菌中存在5類有代表性的溶血素家族，其中，包括副溶血弧菌熱穩(wěn)定性溶血素和熱不穩(wěn)定性溶血素[22]。目前，對(duì)殺魚假交替單胞菌溶血素的結(jié)構(gòu)、分類、溶血機(jī)制等研究尚為空白,但從本研究結(jié)果可知，菌株2515同時(shí)含有熱穩(wěn)定性與熱不穩(wěn)定性兩種溶血素，分別對(duì)羊紅細(xì)胞及魚紅細(xì)胞具有溶血活性，其中，溶解羊血的熱穩(wěn)定性溶血素對(duì)魚紅細(xì)胞不具有溶血活性。由于菌株2515在水產(chǎn)養(yǎng)殖中具有潛在開發(fā)應(yīng)用價(jià)值，對(duì)該兩種溶血素在水產(chǎn)動(dòng)物中的致病性強(qiáng)弱尚需進(jìn)一步研究。本研究結(jié)果也提示，在進(jìn)行水生動(dòng)物益生菌溶血性評(píng)價(jià)時(shí)，應(yīng)針對(duì)性地選擇靶動(dòng)物的血細(xì)胞。

3.3 殺魚假交替單胞菌對(duì)中國明對(duì)蝦的潛在毒性

Sun等[6]將分離的一株殺魚假交替單胞菌(P.-SW-1)用于貝類養(yǎng)殖，發(fā)現(xiàn)該菌能夠減輕溶藻弧菌Vibrioalginolyticus對(duì)貝類的致病力，認(rèn)為該菌株可以用作貝類的益生菌。而喬毅等[8]發(fā)現(xiàn)了一株與殺魚假交替單胞菌分離地位相近的假交替單胞菌屬細(xì)菌LSHD-1含有絲氨酸蛋白酶基因、溶血素基因、腸毒素基因，對(duì)黑鯛Acanthopagrusschlegel具有致病性。本研究中，菌株2515用于對(duì)蝦幼體培育，僅在N3至Z1期顯示出隨著添加劑量的增大幼體成活率呈現(xiàn)降低的趨勢，而在低濃度組(105CFU/mL)表現(xiàn)出能提高對(duì)蝦卵孵化率及N3至Z1期變態(tài)率的效果，表明該菌株對(duì)中國明對(duì)蝦幼體具有的潛在危害與使用濃度有關(guān)。有關(guān)殺魚假交替單胞菌對(duì)中國明對(duì)蝦的毒性評(píng)價(jià)及機(jī)制研究較少，但相關(guān)研究表明，殺魚假交替單胞菌能夠產(chǎn)生降解幾丁質(zhì)的酶[23]，若定殖在對(duì)蝦前腸中，可能會(huì)對(duì)中國明對(duì)蝦前腸幾丁質(zhì)具有潛在的破壞作用[24]。而Z1期對(duì)蝦幼體消化道初步發(fā)育完成，為幼體開口期，需要單胞藻類為食物，試驗(yàn)養(yǎng)殖水體中無添加餌料，幼體會(huì)濾食菌體導(dǎo)致菌體附著，使得前腸更易受到損傷，但該推測尚需進(jìn)一步結(jié)合組織病理學(xué)研究加以證實(shí)。

3.4 殺魚假交替單胞菌熱脫毒后的抗菌效果

去除生物毒素有化學(xué)、物理及微生物等方法，其中，加熱脫毒是降解生物毒素的常用方法，加熱脫毒效果與毒素種類有關(guān)，過高的溫度處理會(huì)破壞產(chǎn)品中有價(jià)值的成分，因此，適宜的脫毒溫度選擇尤為重要。存在于糧食中的脫氧雪腐鐮刀菌烯醇和T-2毒素為耐高溫毒素，需105 ℃以上高溫處理方可達(dá)到部分去除效果[25]。而為提高牛奶的保質(zhì)期同時(shí)保持其溶菌酶的抗菌活性，采用63 ℃ 30 min處理即可達(dá)到效果[26]。菌株2515的抗菌物質(zhì)成分目前尚未闡明，但為了去除其對(duì)魚類紅細(xì)胞具有破壞作用的溶血素，滅活該菌，防止其在環(huán)境中定殖，同時(shí)維持細(xì)菌抗菌物質(zhì)的活性，本研究中采用55 ℃熱處理1 h即可達(dá)到最佳效果。

4 結(jié)論

1)菌株2515直接用于對(duì)蝦育苗，影響對(duì)蝦蚤狀幼體成活率。該菌存在能夠分別溶解魚與羊紅細(xì)胞的溶血素，若用于魚類養(yǎng)殖存在潛在毒性。

2)菌株2515同時(shí)含有熱穩(wěn)定性與熱不穩(wěn)定性兩種溶血素，熱不穩(wěn)定性溶血素對(duì)魚紅細(xì)胞產(chǎn)生溶血，而熱穩(wěn)定性溶血素對(duì)羊紅細(xì)胞產(chǎn)生溶血，對(duì)魚紅細(xì)胞不產(chǎn)生溶血。

3)通過55 ℃ 1 h熱處理能夠去除菌株熱不穩(wěn)定性溶血素活性，能夠滅活該菌，而對(duì)其抗菌活性無影響，熱處理可以作為該菌脫毒的一種備選方法。