羅國玲 ，王孝謙 ，簡紀常 ，魯義善 ，湯菊芬 ，黃瑜*

(1.廣東海洋大學(xué) 水產(chǎn)學(xué)院，廣東 湛江 524088； 2.廣東省水產(chǎn)經(jīng)濟動物病原生物學(xué)及流行病學(xué)重點實驗室，廣東 湛江 524088； 3.水產(chǎn)經(jīng)濟動物病害控制廣東省普通高等學(xué)校重點實驗室，廣東 湛江 524088)

先天免疫是免疫防御機制的第一道防線，在脊椎動物和無脊椎動物中對外來病原體具有重要的防御功能。在低等脊椎動物硬骨魚中，先天免疫系統(tǒng)在保護生物體免受病原體入侵方面發(fā)揮著關(guān)鍵作用[1]。機體通過模式識別受體(pattern recognition receptors, PRRs)識別細菌、真菌和病毒等病原體，使自身免受病原體侵害[2]，其中，Toll樣受體(toll-like receptors，TLRs)、NOD樣受體(NOD-like receptors，NLRs)、RIG-Ⅰ樣受體(RIG-I like receptors，RLRs)和C型凝集素受體(C-type lectin receptors，CLRs)在識別病原體相關(guān)分子模式的先天免疫中起著重要的作用[3]。

CD209又稱為樹突狀細胞特異性細胞間黏附分子3結(jié)合的非整合素(dendritic cell-specific intercellular adhesion molecule-3-grabbing nonintegrin，DC-SIGN)，是模式識別受體C型凝集素家族的成員,其既能激活初始免疫反應(yīng)，又能抑制免疫反應(yīng)，具有正負免疫調(diào)節(jié)作用，近年來該研究較受關(guān)注[4-6]。研究者最初研究樹突狀細胞(dendritic cell，DC)在人類免疫缺陷病毒(HIV)感染過程中的作用時發(fā)現(xiàn)，CD209是樹突狀細胞膜上的一種C型凝集素，可以和T細胞表面的細胞間黏附分子3(ICAM-3)相互作用，介導(dǎo)DC細胞與T細胞的原始黏附，后來研究發(fā)現(xiàn)，CD209可在DC黏附遷移及炎癥反應(yīng)、激活初始T細胞并啟動免疫應(yīng)答及病原體與腫瘤逃逸等諸多方面發(fā)揮著重要作用[7-9]。CD209主要在DC和巨噬細胞的表面表達，可參與細胞相互作用的調(diào)節(jié)和模式識別[10]。目前，關(guān)于CD209的研究主要集中在人和小鼠，而對于魚類的CD209和DCs的研究報道較少。研究表明，斑馬魚在受到釘形貝血藍蛋白(keyhole limpet hemocyanin，KLH)或嗜水氣單胞菌刺激后，通過干擾CD209的表達可以顯著抑制T細胞活化、抗體(IgM)的產(chǎn)生和細菌免疫保護，這表明CD209在適應(yīng)性免疫的啟動和發(fā)展中發(fā)揮至關(guān)重要的作用[11]。此外，在病原感染后，半滑舌鰨腎臟和血液中的CD209表達顯著上調(diào)，且CD209蛋白能顯著促進半滑舌鰨白細胞對細菌的吞噬作用[12]，這表明CD209在病原體感染過程中發(fā)揮著重要作用。

尼羅羅非魚Oreochromisniloticus為中國重要的經(jīng)濟魚類之一。近年來,隨著養(yǎng)殖規(guī)模的不斷擴大,高密度養(yǎng)殖和水體污染等原因?qū)е铝_非魚疾病大規(guī)模暴發(fā),給水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失[13]。尤其是近年來新發(fā)現(xiàn)的羅非魚湖病毒，已對厄瓜多爾等國家的羅非魚養(yǎng)殖造成了巨大損失，因此，有關(guān)羅非魚先天免疫防御系統(tǒng)的研究可為病害的控制提供幫助。目前，關(guān)于CD209在尼羅羅非魚中的作用未見報道，其在尼羅羅非魚疾病的發(fā)生、發(fā)展中的作用機理尚不清楚，為此，本研究中對尼羅羅非魚CD209基因(OnCD209)進行了克隆及序列分析，檢測了CD209在各組織中的表達情況及無乳鏈球菌感染后的表達模式，并分析了CD209在細胞中的定位情況及其在細胞中過表達時對NK-κB(nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cell)通路的影響，以期為進一步研究羅非魚CD209的生物學(xué)功能提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗用健康尼羅羅非魚(體質(zhì)量為100 g±5 g)購自廣東省湛江市湖光鎮(zhèn)的某漁場。無乳鏈球菌是廣東省水產(chǎn)經(jīng)濟動物病原生物學(xué)及流行病學(xué)重點實驗室從患病尼羅羅非魚體內(nèi)分離保存的菌株(ZQ1901)。

實驗室常規(guī)基因克隆相關(guān)試劑購自生工生物工程(上海)股份有限公司，RNA提取、cDNA合成及熒光定量相關(guān)試劑購自北京全式金生物公司，雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒購自碧云天生物公司，引物合成和測序均由廣州生工生物有限公司完成。

1.2 方法

1.2.1 試驗設(shè)計及飼養(yǎng)管理 試驗開始前，將尼羅羅非魚于實驗室條件下暫養(yǎng)2周，暫養(yǎng)于1 000 L的充氧水箱，每個水箱養(yǎng)殖200尾尼羅羅非魚，水溫控制在28 ℃左右，每日早晚各投喂一次飼料(恒興羅非魚膨化飼料106)，每3日換一次水，每次排掉1/2養(yǎng)殖水后再注入新水，并利用虹吸法清理缸內(nèi)排泄物。試驗開始前，隨機抽檢一些尼羅羅非魚的脾臟、頭腎、肝臟等組織，驗證是否含有病原微生物。對魚體解剖取其組織前使用丁香酚麻醉處理，所有的處理均符合廣東省試驗動物福利相關(guān)規(guī)定。

1.2.2 尼羅羅非魚總RNA的提取及CD209開放閱讀框的克隆 采用TRIZOLUP方法提取尼羅羅非魚脾臟總RNA，將脾臟組織置于2 mL的無RNA酶EP管中，加入1 mL的TRIZOLUP及鋼珠一個，使用研磨器研磨3 min；將200 μL氯仿加入組織勻漿中，充分震蕩，混合液于4 ℃下以12 000 r/min離心15 min，將分層后的上層水相轉(zhuǎn)移至1.5 mL無RNA酶的EP管中；加入等體積提前預(yù)冷的異丙醇，室溫靜置10 min；離心后棄上清液，加入500 μL體積分數(shù)75%的乙醇，溫和震蕩后以8 000 r/min離心5 min，棄上清液，室溫下晾干10 min，然后加入無RNA酶的水溶解RNA樣品，使用超微量生物檢測儀檢測其濃度，并用瓊脂凝膠電泳檢測提取的RNA質(zhì)量。使用全式金公司的反轉(zhuǎn)錄試劑盒進行第一鏈cDNA的合成，產(chǎn)物于-20 ℃下保存待用。

使用Prime 5.0設(shè)計一對引物(CD209-F: ATGAGTGTCGAGTACCATGCATCC,CD209-R: CTACATCTCACAGATCCAGTTTTGTTC)，以脾臟的第一鏈cDNA為模板，進行CD209開放閱讀框(Open reading frame，ORF)片段的克隆。PCR反應(yīng)體系(共20 μL)：Ex Taq 酶10 μL，cDNA模板1 μL，CD209-F/R各1 μL，ddH2O 7 μL。PCR反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃下循環(huán)變性30 s，60 ℃下退火復(fù)性30 s，72 ℃下延伸50 s，共進行35個循環(huán)；最后再在72 ℃下延伸5 min。通過瓊脂凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物條帶大小與理論值是否相符，然后對PCR產(chǎn)物進行純化，將純化后的PCR產(chǎn)物轉(zhuǎn)入pMD-18T克隆載體，涂板挑菌后進行菌落PCR檢測，挑取陽性克隆送至廣州生工生物有限公司進行測序。

1.2.3OnCD209序列分析 測序結(jié)果采用DNAMAN進行拼接，用美國生物技術(shù)信息中心(NCBI)Blast在線程序進行序列比對。用ORF Finder程序(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)分析OnCD209潛在的開放閱讀框架。利用在線軟件ExPASy-ProtParam工具(https://web.expasy. org/protparam/)對氨基酸序列、分子量和理論pI進行預(yù)測。使用在線程序ExPASY (http://ca.expasy.org)和SMART(http://smart.embl-heidelberg.de)獲得氨基酸序列和結(jié)構(gòu)域信息,在NCBI的資源庫中對多個物種的CD209蛋白進行選擇,然后采用ClustalX 2.0、GeneDoc和DNAMAN進行多重序列比對分析，采用MEGA 5.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.4OnCD209基因的組織表達 從實驗室暫養(yǎng)的健康尼羅羅非魚中隨機抽取5尾，于無菌條件下進行解剖，分別取肝臟、脾臟、頭腎、鰓、腸道、胸腺、皮膚、肌肉、血液和腦10個組織，分別放入無RNA酶的2 mL EP管中進行組織研磨后，提取RNA并反轉(zhuǎn)錄成cDNA，方法同“1.2.2節(jié)”。采用RT-qPCR法檢測10個組織CD209基因的表達情況，設(shè)計一對熒光定量引物(qCD209-F: TGTTTACTCCTCTTGGCTGGTG，qCD209-R: AGCT- TATCTGCGTATCCCGTTT)。PCR反應(yīng)體系(共10 μL)：Mix 5.0 μL，ddH2O 3.5 μL，cDNA模板 0.5 μL，qCD209-F/R各0.5 μL。反應(yīng)程序為：95 ℃下預(yù)變性30 s；95 ℃下循環(huán)變性15 s，60 ℃下退火復(fù)性15 s，72 ℃下延伸20 s，共進行30個循環(huán)。對每份樣品的CD209和β-actin表達量進行檢測，每個樣品設(shè)置3個重復(fù)，采用2-ΔΔCT法計算基因相對表達量[14]。

1.2.5 無乳鏈球菌刺激后OnCD209基因的組織表達 采用RT-qPCR法(使用羅氏Light Cycler 96實時熒光定量PCR儀)檢測注射無乳鏈球菌后OnCD209基因的表達量。病原刺激如下：將-80 ℃下保存的無乳鏈球菌解凍后取出1.5 mL接種于100 mL的BHI培養(yǎng)基中，于37 ℃條件下培養(yǎng)至OD600 nm為1.0后，收集于離心管內(nèi)，用PBS懸浮細菌濃度至1×107CFU/mL，而后吸取100 μL菌液對尼羅羅非魚進行腹腔注射。在注射后0、6、12、24、48、72、96 h采集組織樣本，并進行RNA提取和cDNA合成，方法同“1.2.2節(jié)”。然后以合成的cDNA為模板，分別對所提取的組織樣品進行RT-qPCR檢測，反應(yīng)體系和反應(yīng)程序同“1.2.4節(jié)”。對每份樣品CD209和β-actin表達量進行檢測，每個樣品設(shè)置3個重復(fù)。

1.2.6OnCD209在293T細胞中的亞細胞定位 設(shè)計一對引物(CD209-pEGFP-N1-F:CCGGAATTCTATGAGTGTCGAGTACCATG，CD209-pEGFP-N1-R:CGGGGTACCCTACATCTCACAGATCCAG)，以尼羅羅非魚的脾臟cDNA為模板進行基因克隆，PCR產(chǎn)物純化后，使用相同的限制性快切酶對PCR產(chǎn)物及pEGFP-N1進行雙酶切處理，酶切產(chǎn)物純化后使用T4連接酶進行產(chǎn)物與載體連接，然后轉(zhuǎn)入DH5α感受態(tài)細胞中，涂板挑菌，將陽性菌落送至廣州生工生物有限公司進行測序，測序正確的菌液進行去內(nèi)毒素質(zhì)粒提取。

將293T細胞接種于12孔細胞培養(yǎng)板內(nèi)，當細胞增殖至密度為80%～90%時，根據(jù)Lip3 000使用說明書，將構(gòu)建好的CD209-pEGFP-N1或pEGFP-N1表達載體轉(zhuǎn)染至細胞內(nèi)。將酒精浸潤的圓形蓋玻片于火上烤至干燥后放入12孔板內(nèi)，使用胰酶對轉(zhuǎn)染24 h的細胞進行消化處理后，加入培養(yǎng)基混合物(10%的胎牛血清、1%的青霉素鏈霉素混合液及M199培養(yǎng)基)懸浮細胞并轉(zhuǎn)入含蓋玻片的細胞培養(yǎng)板內(nèi)，試驗設(shè)3個重復(fù)。培養(yǎng)5 h后，使用體積分數(shù)4%的多聚甲醛固定細胞，30 min后吸取固定液并加入PBS洗滌，取出蓋玻片反蓋于滴有1～2滴含DAPI封片劑的載玻片上。封片完畢后于熒光顯微鏡下觀察拍照。

1.2.7 雙熒光素酶活性分析 設(shè)計一對引物(CD209-pcDNA3.1-F：CCGGAATTCGCCACCATGAGTGTCGAGTACCATG,CD209-pcDNA3.1-R：CCCAAGCTTCATCTCACAGATCCAG)，構(gòu)建OnCD209-pcDNA3.1過表達載體，方法同“1.2.6節(jié)”。將293T細胞接種于12孔板內(nèi)，按照Lip3000使用說明書將啟動子報告質(zhì)粒(200 ng)、內(nèi)參質(zhì)粒PRL-TK(4 ng)及CD209-pcDNA 3.1或pcDNA 3.1質(zhì)粒(250 ng)共轉(zhuǎn)染至細胞內(nèi)，24 h后收取細胞培養(yǎng)物，試驗設(shè)3個重復(fù)。使用碧云天生物公司的雙熒光素酶報告基因檢測系統(tǒng)檢測螢火蟲熒光素酶與海腎熒光素酶活性。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)均以平均值±標準差(mean±S.D.)表示，采用SPSS 17.0軟件進行最小顯著性差異(LSD)檢驗，顯著性水平設(shè)為0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 OnCD209基因的克隆及其推導(dǎo)的氨基酸序列

利用聚合酶鏈式反應(yīng)擴增了尼羅羅非魚CD209基因的ORF區(qū)(圖1)，命名為OnCD209(GenBank登錄號:XP_003448039.1)。OnCD209基因的ORF區(qū)片段長度為1 383 bp，編碼460個氨基酸，預(yù)測蛋白相對分子質(zhì)量為53 270，理論等電點為5.04。用SMART保守結(jié)構(gòu)域在線軟件預(yù)測該蛋白為一個跨膜蛋白，該蛋白存在一個C型凝集素結(jié)構(gòu)域(C-type lectin domain，CTLD)(圖2)。用SignalP 4.1預(yù)測該蛋白的氨基酸序列第1～29位為CD209的信號肽區(qū)。用TMHMM 2.0預(yù)測該蛋白在N端1～42氨基酸殘基之間對應(yīng)一個胞內(nèi)區(qū)，在43～65氨基酸殘基之間為一個跨膜區(qū)，在66～460氨基酸殘基之間對應(yīng)一個胞外區(qū)(圖1)。用PSITE預(yù)測該蛋白存在8個糖基化位點，1個糖胺聚糖附著位點，2個cAMP和cgmp依賴的蛋白激酶磷酸化位點，8個磷酸化位點，11個酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位點，2個酪氨酸激酶磷酸化位點，5個?；稽c，1個Prenyl基團結(jié)合位點(CAAX box)，6個微體C端定位信號，1個C型凝集素域信號和9個亮氨酸拉鏈模式。

加粗部分為起始密碼子(ATG)和終止密碼子(TAG);加下劃線部分為C型凝集素結(jié)構(gòu)域。

圖2 尼羅羅非魚CD209保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測

2.2 OnCD209氨基酸同源性比較及系統(tǒng)進化分析

OnCD209氨基酸序列與其他已知脊椎動物的CD209、CD209-like及C型凝集素的多重比對顯示，其均具有一個C型凝集素保守結(jié)構(gòu)域，經(jīng)BlastX比對顯示，尼羅羅非魚CD209與斑馬魚DaniorerioC型凝集素家族4成員M(C-type lectin domain family 4 member M)的氨基酸序列一致性最高(90.34%)，與高等脊椎動物人、獼猴、牛、豬的CD209一致性較低(14.86%～20.04%)(圖3)。進化樹分析顯示，尼羅羅非魚CD209氨基酸序列與田紋獅子魚LiparistanakaeCD209聚為一大支，親緣關(guān)系最近,且魚類的CD209聚為一支，高等哺乳動物的CD209聚為另一支(圖4)。

方框示C型凝集素保守結(jié)構(gòu)域。

圖4 尼羅羅非魚CD209氨基酸序列聚類分析

2.3 OnCD209基因的組織表達

使用實時熒光定量PCR法檢測了健康尼羅羅非魚組織中的CD209基因表達情況。從圖5可見：OnCD209 mRNA在所有組織中均被檢測到，其中，在腦中微量表達，在血液、皮膚和肌肉中高表達，在頭腎和腸道中較高表達，而在鰓、肝臟、脾臟和胸腺中的表達水平相似，血液、皮膚、肌肉、頭腎、腸道、鰓、肝臟、脾臟和胸腺中CD209基因的表達量分別為腦中的8.57、8.37、8.04、4.18、3.58、2.38、2.27、1.59、1.42倍。

*表示與腦組織的表達量相比有顯著性差異(P<0.05)。

2.4 無乳鏈球菌刺激后OnCD209基因的組織表達

為了分析細菌感染對CD209基因表達的影響，用無乳鏈球菌感染尼羅羅非魚，檢測了被感染6、12、24、48、72、96 h后尼羅羅非魚肝臟、脾臟、頭腎和腸道中CD209基因的表達情況。結(jié)果顯示，羅非魚肝臟和頭腎中CD209的表達量均在6、72、96 h時顯著上調(diào)(P<0.05)，脾臟中的表達量在6 h和72 h時顯著上調(diào)(P<0.05)，腸道中的表達量在6、48、72 h時顯著上調(diào)(P<0.05)，在肝臟、頭腎、脾臟和腸道中的最高表達量分別為對照組的1.26、2.43、1.33和5.83倍(圖6)。

*表示與0 h的表達量相比有顯著性差異(P<0.05)。

2.5 OnCD209基因的亞細胞定位分析

將構(gòu)建的綠色熒光標簽載體OnCD209-pEGFP-N1與空載pEGFP-N1分別轉(zhuǎn)染入293T細胞，經(jīng)DAPI染色后結(jié)果如圖7所示，pEGFP-N1均勻地分布于整個細胞內(nèi)，而OnCD209-pEGFP-N1主要分布于胞膜上，與預(yù)測結(jié)果相符合。

A1和B1分別為OnCD209-pEGFP-N1、pEGFP-N1細胞核DAPI染色；A2和B2分別為OnCD209-pEGFP-N1、pEGFP-N1的綠色熒光蛋白；A3和B3為細胞核與綠色熒光蛋白疊加。

2.6 過表達OnCD209基因?qū)F-κB活性的影響

使用細胞轉(zhuǎn)染和雙熒光素酶報告基因檢測系統(tǒng)研究了OnCD209在信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中的作用，結(jié)果顯示，在293T細胞中過表達OnCD209基因能增強NF-κB通路的活性(圖8)。

*表示組間有顯著性差異(P<0.05)。

3 討論

3.1 OnCD209分子結(jié)構(gòu)分析

CD209(DC-SIGN)是C型凝集素受體家族的重要成員之一，是先天免疫中識別和清除病原體的關(guān)鍵分子[15]，在人類中，CD209主要在促炎性細胞因子的巨噬細胞群上表達，在激活炎癥免疫反應(yīng)中發(fā)揮重要的作用[16-17]。CD209在人類、靈長動物及小鼠中的同源物已被鑒定出來，然而在魚類的研究中了解較少。為了深入了解魚類CD209基因，本研究中首次獲得了尼羅羅非魚CD209的開放閱讀框序列，其片段長度為1 383 bp，可編碼461個氨基酸，預(yù)測OnCD209是一個含有胞漿外區(qū)、跨膜區(qū)和胞內(nèi)區(qū)的跨膜蛋白，在其胞漿外區(qū)含有一個C型凝集素特有的CTLD。氨基酸多重序列比對結(jié)果表明，尼羅羅非魚CD209氨基酸序列與半滑舌鰨、人和小鼠的CD209亞型具有中等一致性，為33%～35%[18]。然而，本研究中尼羅羅非魚CD209氨基酸序列與人、獼猴等高等哺乳動物的CD209氨基酸序列一致性不高，僅為14.86%～20.04%，這表明CD209在高等與低等脊椎動物間功能比較分化，相對不保守。系統(tǒng)進化分析表明，CD209氨基酸序列在高低等脊椎動物進化上聯(lián)系密切，尼羅羅非魚CD209與田紋獅子魚聚為一支，而與斑馬魚等同為低等脊椎動物的物種聚為不同分支，這表明CD209在進化上也相對不保守。

3.2 OnCD209基因的組織表達分析

本研究表明，OnCD209基因在所有受檢的組織中均有分布，在血液、皮膚和肌肉中表達量較高，其次是頭腎、腸道，在腦中表達量最低。血液內(nèi)的血循環(huán)是復(fù)雜的固有免疫和適應(yīng)性免疫反應(yīng)的交匯場所，而固有免疫反應(yīng)是機體防御致病原入侵血循環(huán)的第一道防線，但血液固有免疫反應(yīng)必須得到精確適當?shù)恼{(diào)控才能消滅病原菌[19-20]，同CD209基因在半滑舌鰨中的表達模式相似[12]，CD209基因在尼羅羅非魚的腦組織中有表達，推測CD209參與了血液固有免疫反應(yīng)的調(diào)節(jié)。而眾所周知，皮膚是魚類黏膜免疫系統(tǒng)的第一道屏障，極易感染[21]，且OnCD209基因在肌肉組織中也大量表達，表明其在免疫和非免疫組織中均有潛在的作用。

3.3 無乳鏈球菌感染后OnCD209基因的表達變化

本研究表明，無乳鏈球菌侵染后,CD209在尼羅羅非魚肝臟、脾臟、頭腎和腸道中的表達模式具有相似的變化趨勢，均在6 h時表達量明顯上調(diào)，在12 h和24 h時表達量明顯下調(diào)，之后在48 h時表明量再次上調(diào)，其中，表達量顯著性下調(diào)可能是無乳鏈球菌感染12 h和24 h時造成了尼羅羅非魚機體紊亂，使CD209表達受到抑制。肝臟具有非特異性吞噬的免疫功能[22]，且CD209主要表達于巨噬細胞表面，本研究中尼羅羅非魚肝臟中CD209表達量在感染后顯著上調(diào)，可能是CD209參與了巨噬細胞的吞噬作用；無乳鏈球菌感染后，在尼羅羅非魚脾臟和頭腎中也能觀察到CD209表達量顯著上調(diào)，這可能是因為脾臟和頭腎是魚類的兩個主要造血器官，也是無乳鏈球菌攻擊的主要靶器官[23]；腸道是屬于黏膜免疫系統(tǒng)的組成之一，是執(zhí)行局部特異性免疫功能的主要場所[24]，OnCD209在腸道中顯著上調(diào)，表明其在魚體抵御病原體的入侵過程中發(fā)揮重要作用。以上結(jié)果表明，OnCD209可能參與了魚體抗細菌感染的免疫途徑。

3.4 OnCD209基因的亞細胞定位分析

研究表明，哺乳動物的CD209是一種特異表達于樹突狀細胞和巨噬細胞表面的跨膜蛋白[25-26]，主要于細胞膜表面表達。本研究中將OnCD209-pEGFP-N1重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T細胞，發(fā)現(xiàn)其主要定位于細胞膜中，這與前人的研究結(jié)果相同，表明同哺乳動物的CD209相同，尼羅羅非魚的CD209也在細胞膜中發(fā)揮其免疫調(diào)控作用。

3.5 OnCD209基因?qū)F-κB信號通路的影響

NF-κB是一種蛋白復(fù)合物，參與調(diào)控DNA的轉(zhuǎn)錄、細胞因子的產(chǎn)生及細胞的存活[27]。NF-κB信號通路在免疫和炎癥中起到重要作用，能夠通過細胞因子、黏附因子、酶、受體等多個方式參與炎癥反應(yīng)[28-29]。樹突狀細胞上表達的不同的模式識別受體，能識別入侵的病原體，導(dǎo)致細胞內(nèi)信號傳導(dǎo)過程的激活，從而激活適應(yīng)性免疫。已有研究表明，CD209(DC-SIGN)與不同甘露糖表達的病原體，如結(jié)核分枝桿菌和HIV-1相互作用，被CD209識別后，會觸發(fā)Raf-1依賴的信號通路，調(diào)節(jié)TLR誘導(dǎo)的NF-κB信號的激活[30]。本研究中，通過轉(zhuǎn)染OnCD209真核表達質(zhì)粒至293T細胞內(nèi)，并采用雙熒光素酶報告系統(tǒng)檢測了尼羅羅非魚CD209對NF-κB信號通路的影響，結(jié)果表明，293T細胞內(nèi)過表達時OnCD209基因?qū)F-κB通路活性有顯著上調(diào)作用，這與前人研究結(jié)果相符。

4 結(jié)論

1)本研究中成功克隆了尼羅羅非魚CD209基因的ORF序列，預(yù)測CD209蛋白具有一個保守的C型凝集素結(jié)構(gòu)域，且在不同物種間相對不保守。

2)在健康尼羅羅非魚的各個組織中均能檢測到OnCD209 mRNA，其中，血液中CD209 mRNA表達量最高。

3)OnCD209在無乳鏈球菌感染后的體內(nèi)表達呈現(xiàn)先上調(diào)后下調(diào)再上調(diào)的表達模式，表明OnCD209可能參與了抗細菌感染的免疫途徑。

4)OnCD209定位于細胞膜，且在293T細胞中過表達時能顯著增強NF-κB的活性。