鄧濤 ，張家友 綜述， 楊曉明 審校

1.武漢生物制品研究所有限責(zé)任公司,湖北武漢430207；2.國家聯(lián)合疫苗工程技術(shù)研究中心,湖北武漢430207；3.中國生物技術(shù)股份有限公司,北京100029

流行性感冒(簡稱流感)是一種由流感病毒引起的急性呼吸道傳染病。據(jù)WHO 統(tǒng)計(jì),每年季節(jié)性流感可造成約65 萬人死亡［1］。目前,有多種抗病毒藥物用于治療人類季節(jié)性流感,但耐藥性日趨嚴(yán)重［2］,接種疫苗成為預(yù)防流感最有效的方法［3］。流感病毒血凝素(hemagglutinin,HA)和神經(jīng)氨酸酶(neuraminidase,NA)是流感裂解疫苗的主要抗原,由于HA 與流感病毒毒株匹配程度存在差異,使流感疫苗的有效性每年也會有所不同［4-5］。FLANNERY 等［6］對2016 — 2017 年季節(jié)性流感疫苗的有效性進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,結(jié)果顯示,疫苗有效率為19% ～48%。除HA外,流感疫苗的效力可能還受流感病毒其他抗原影響,研究表明,若疫苗中HA 抗原與當(dāng)年流感病毒HA有顯著差異,NA 免疫誘導(dǎo)的特異性抗體為流感重癥患者提供了重要的保護(hù)作用［7］。研究發(fā)現(xiàn),許多NA特異性抗體可結(jié)合在同一NA 亞型中的保守抗原表位上,保護(hù)機(jī)體免受異種病毒的侵襲［8-9］,表明基于。NA 設(shè)計(jì)的疫苗可能成為一種通用流感疫苗,NA 特異性抗體可有效抵御流感病毒感染［10］,因此NA 抗體滴度與流感減毒活疫苗及滅活疫苗的有效性密切相關(guān)。但NA 特異性抗體作用效果的評價方法及準(zhǔn)確量化多價流感疫苗中NA 含量的方法尚需進(jìn)一步深入研究。本文就流感病毒NA 及基于NA 流感疫苗的研究進(jìn)展作一綜述。

1 NA 的結(jié)構(gòu)及功能

流感病毒是有包膜的單股負(fù)鏈RNA 病毒,其分節(jié)段的RNA 編碼至少10 種獨(dú)立的蛋白質(zhì),包括2 種表面糖蛋白HA 和NA。A 型流感病毒根據(jù)NA 抗原性分為9 個亞型(N1 ～N9),B 型和C 型流感病毒不分亞型。A 型流感病毒NA 根據(jù)進(jìn)化親疏程度分為2 組,Group 1(包括 N1、N4、N5、N8)和 Group 2(包括N2、N3、N6、N7、N9),在蝙蝠身上分離出來的 N10 和N11 亞型流感病毒與A 及B 型流感病毒的NA 關(guān)系均較遠(yuǎn),目前尚未發(fā)現(xiàn)其有NA 活性。見圖1。NA是典型的Ⅱ型跨膜蛋白,由4 個完全相同的單體非共價結(jié)合形成的蘑菇狀四聚體。NA 蛋白通常是由450 ～480 個氨基酸殘基組成,可分為4 個主要區(qū)域,分別為位于氨基末端的親水胞漿區(qū)、疏水跨膜區(qū)、高度多變的莖部及具有酶活性的頭部［11］。胞漿區(qū)包括不同亞型中高度保守的6 個氨基酸(MNPNQK),該序列在A 型流感病毒中高度保守,但其功能尚未明確；跨膜區(qū)是蛋白合成、折疊及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)運(yùn)輸過程中的信號肽［12］；莖部結(jié)構(gòu)在不同亞型甚至同一亞型中具有較大差異；頭部的保守氨基酸數(shù)量最多［13］。

NA 是流感病毒傳播所必需的蛋白之一,其通過水解宿主細(xì)胞膜上的病毒唾液酸受體,防止子代病毒在細(xì)胞表面聚集,促進(jìn)病毒顆粒的釋放,從而使整個病毒復(fù)制周期順利完成［14-15］。有研究表明,NA 可能在促進(jìn)病毒對呼吸道上皮細(xì)胞的識別中發(fā)揮作用,NA 通過降解呼吸道表面含唾液酸的黏蛋白,降低黏液層黏度,從而暴露出宿主細(xì)胞受體,使病毒更易結(jié)合至易感細(xì)胞表面［16］。還有研究報(bào)道了一種新機(jī)制,即NA 在病毒感染的初始階段促進(jìn)病毒進(jìn)入靶細(xì)胞［17］,從而提高病毒感染效率。

2 NA 基因的相對保守性

作為缺乏RNA 校正酶的分節(jié)段病毒,流感病毒具有較高的突變率。研究表明,NA 的年突變率低于HA,分別為0.45%～1.01%和1%～2%［18］。WESTGEEST等［19］對 1968 — 2011 年流行的 H3N2 全基因組進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,結(jié)果表明,HA0、HA1、HA2 氨基酸的年平均突變率分別為1.08%、1.49%、0.14%,而NA氨基酸的年平均突變率為0.91%。對NA 抗原漂移的單獨(dú)研究表明,HA 和NA 的抗原變化是相互獨(dú)立的［20］。因此,當(dāng)HA 發(fā)生抗原漂移時,NA 免疫可能提供一定程度的保護(hù),如1968 年的流感大流行,H2N2 流感病毒的抗體有助于抵御H3N2 病毒感染。當(dāng)抗原發(fā)生變化時,NA 對同一亞型內(nèi)的異源病毒具有廣泛的保護(hù)作用,表明一些NA 是相對保守的［21］；再如,2009 年流感大流行中,老年人群中的發(fā)病率相對較低,主要原因可能是老年人群體內(nèi)已存在2009 年前流行的H1N1 流感病毒的NA 特異性抗體［22］。CHEN 等［10］還發(fā)現(xiàn),流感病毒感染過程中誘導(dǎo)的NA 特異性抗體比HA 特異性抗體具有更廣泛的反應(yīng)性,且保護(hù)作用和中和效力也與HA 特異性抗體相當(dāng)。

圖1 流感病毒NA 基因進(jìn)化樹分析Fig.1 Phylogenetic tree of NA gene of influenza virus

3 NA 的免疫原性及免疫機(jī)制

NA 具有較強(qiáng)的免疫原性,在動物和人類機(jī)體中能夠誘導(dǎo)產(chǎn)生NA 特異性抗體,該抗體在預(yù)防感染、抑制病毒擴(kuò)散、減輕臨床癥狀及增強(qiáng)疫苗效力方面發(fā)揮重要作用。研究表明,自然感染和免疫接種產(chǎn)生的NA 特異性抗體均具有獨(dú)立的保護(hù)作用［23］,人接種了減毒活疫苗及滅活流感疫苗后均觀察到NA 特異性抗體滴度有所提高［8-9］。一項(xiàng)臨床研究顯示,健康成人受到H1N1pdm09(A／California／7／2009)挑戰(zhàn)時,顯示HA 和NA 特異性抗體在免疫中的作用存在明顯差異［24］。病毒脫落程度與HA 抑制性(hemagglutinin-inhibition,HI)抗體滴度相關(guān),但NA 抑制性(NA- inhibition,NI)抗體滴度與疾病嚴(yán)重程度及癥狀和病毒脫落持續(xù)時間相關(guān)。NA 免疫在動物試驗(yàn)中也顯示了明顯效果,括重組 NA［25］、NA 表達(dá)載體［26］和 NA 的病毒樣顆粒(virus-like particle,VLP)［27］,上述研究中大多數(shù)采用了同源、異源及異NA 亞型的流感毒株進(jìn)行攻毒試驗(yàn),結(jié)果顯示,對同源毒株攻擊具有最大保護(hù)作用,對同NA 亞型的異源毒株具有交叉保護(hù)作用,但對于異NA 亞型毒株基本無保護(hù)作用。從小鼠和家兔體內(nèi)分離的NA 特異性抗體可保護(hù)動物免受同源和異源流感病毒感染［10,28］。

流感病毒NA 蛋白的免疫反應(yīng)主要是體液免疫。NA 特異性抗體與感染細(xì)胞表面的NA 蛋白結(jié)合,通過抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用(antibody dependent cell-mediated cytotoxicity,ADCC)和補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒作用(complement-dependent cytotoxicity,CDC)清除病毒［29］。NA 特異性抗體有助于預(yù)防疾病,可能是在感染初期NA 特異性抗體誘導(dǎo)的一種“允許免疫”(“permissive immunity”)作用［30］,該作用可阻止病毒顆粒從感染細(xì)胞頂部釋放,從而減少病毒的傳播數(shù)量,具體機(jī)制可能包括以下幾個方面:直接抑制酶活性；使單個病毒顆粒交聯(lián),減少可用于感染宿主細(xì)胞的病毒數(shù)量；將病毒顆粒與細(xì)胞相關(guān)的NA 聚集黏合,抑制新生病毒顆粒從宿主細(xì)胞脫離。無論是自然感染還是免疫接種,對NA抗原的免疫反應(yīng)可限制病毒在宿主內(nèi)的傳播,降低發(fā)病率和死亡率,從而減少傳播給其他易感個體的機(jī)會。

4 基于NA 的流感疫苗

基于NA 的流感疫苗類型包括重組亞單位疫苗、核酸疫苗、VLP 疫苗等。各種類型基于NA 設(shè)計(jì)的流感疫苗方案主要目的均是誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生NI 抗體,以獲得更廣泛的交叉保護(hù)作用。

4.1 重組亞單位疫苗 LIU 等［9］利用桿狀病毒-昆蟲表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)的重組H5N1 NA 蛋白免疫小鼠,可產(chǎn)生 NA 特異性抗體,使用 H5N1、pH1N1(CA ／ 09)或H7N9 流感病毒進(jìn)行攻毒試驗(yàn),結(jié)果顯示,能夠抵抗同源病毒致死量攻擊,20 μg 劑量組對異源H5N1流感病毒攻擊的保護(hù)率為60%,但對異亞型H7N9 無論劑量大小均無保護(hù)作用；WOHLBOLD 等［25］利用桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)制備了N1 ～N8 的重組NA 蛋白,接種小鼠后進(jìn)行攻毒試驗(yàn),結(jié)果顯示,重組NA 蛋白能夠?qū)ν?、異源非異NA 亞型流感病毒提供廣泛保護(hù),但對異NA 亞型病毒無交叉保護(hù)作用；BOSCH等［31］利用無細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)了可溶性四聚體NA蛋白,免疫雪貂后進(jìn)行同源H1N1 病毒攻擊,結(jié)果顯示,顯著減輕了感染的臨床癥狀。

4.2 核酸疫苗 CHEN 等［32］構(gòu)建了A／PR／8 ／34(PR8,H1N1)和 A ／ Chicken Henan ／ 12 ／ 2004(H5N1)株流感病毒NA-DNA 疫苗,在小鼠模型中可提供同源病毒的保護(hù)作用；CHEN 等［33］制備了 N2-DNA 疫苗,通過表達(dá)HA 和NA 可增強(qiáng)對致死劑量流感病毒挑戰(zhàn)的保護(hù)；目前,美國Protein Sciences 公司研發(fā)的FluNhance(重組NA 亞單位疫苗)已完成Ⅱ期臨床試驗(yàn)［34］。

4.3 載體疫苗 KINGSTAD 等［35］構(gòu)建了 H5N1 NA的浣熊痘病毒(raccoon poxvirus,RCN)載體疫苗,免疫小鼠后,能夠抵抗致死量同源病毒攻擊,對H3N2 流感病毒有 20%保護(hù)作用；LEI 等［26］構(gòu)建了 H5N1 NA 的乳酸球菌NZ9000 載體疫苗,能夠抵抗同源病毒攻擊。

4.4 VLP 疫苗 EASTERBROOK 等［27］制備了 H1N1-pdm09 的NA VLP 疫苗,在小鼠的攻毒模型中,不僅可以抵抗H1N1pdm09 的致死劑量攻擊,還可抵抗同NA 亞型的的H5N1 致死劑量攻擊,同時能夠有效降低病毒感染后肺部病毒載量。WU 等［36］利用Vero細(xì)胞制備H5N1 NA 的VLP 疫苗,在小鼠動物模型中可產(chǎn)生良好的免疫應(yīng)答反應(yīng),能抵抗致死劑量H5N1及H1N1 流感病毒的攻擊。

4.5 聯(lián)合其他流感病毒蛋白的NA 疫苗 WU 等［36］構(gòu)建了 H5N1 NA、M2e、HA 的 VLP 疫苗,聯(lián)合免疫這3 種疫苗,動物能夠產(chǎn)生比單獨(dú)使用NA 疫苗更為廣譜的保護(hù)作用。

5 NA 流感疫苗面臨的挑戰(zhàn)

基于NA 研發(fā)流感疫苗具有良好的應(yīng)用前景,但目前尚未建立統(tǒng)一的定量檢測NA 的標(biāo)準(zhǔn)和方法。缺乏一種實(shí)用的分析方法來測定多價流感疫苗NA 含量,是制約流感疫苗質(zhì)量評價的瓶頸之一。NA酶活性是反映其天然結(jié)構(gòu)的良好指標(biāo),與免疫原性密切相關(guān)。酶活性測定通常以4-MUNANA 作為底物,通過測定NA 催化底物分解后產(chǎn)物的熒光強(qiáng)度,用以評價NA 酶活性。但該方法不能區(qū)分NA 的亞型,不適合測量三價和四價季節(jié)性流感疫苗中的NA含量。另外,由于疫苗生產(chǎn)、儲存和運(yùn)輸?shù)冗^程復(fù)雜,蛋白酶活性可能已受到影響,因此酶活性的測定不適用于疫苗中NA 的準(zhǔn)確定量?？紤]到疫苗制劑中的NA 酶活性不穩(wěn)定等問題,已開發(fā)了一種基于質(zhì)譜的替代方法來定量流感疫苗中的NA［37］。這種同位素稀釋質(zhì)譜(isotope dilution mass spectrometry,IDMS)方法采用同位素標(biāo)記的多肽來確定每種NA的摩爾量,該標(biāo)準(zhǔn)對每種流感類型和亞型均是特異性的。雖然該分析不能反映NA 的免疫原性,但其提供了一種測量季節(jié)性和大流行性疫苗中每種NA 型／亞型的絕對濃度的方法。GRAVEL 等［38］利用生物信息學(xué)分析A 型和B 型流感病毒NA 的氨基酸普遍為保守序列,獲得兩條保守表位多肽(HCA-2 和HCA-3),并制備相應(yīng)的特異性通用抗體,該通用抗體可用于定量流感疫苗的NA 含量。但HCA-2 和HCA-3 通用抗體僅用于單價疫苗NA 的定量,并不能量化三價／ 四價流感疫苗的NA 含量。XU 等［39］利用類似方法制備了 CNA1、CNA2 及 CNAB 單克隆抗體,CNA1 僅能與N1 亞型反應(yīng),CNA2 僅能與N2 亞型反應(yīng),而CNAB 僅能與B 型流感病毒的NA 特異性反應(yīng),因此,這些抗體可用于定量三價流感疫苗的NA 含量。

除了NA 的定量分析,還需要一種預(yù)測免疫原性的試驗(yàn)(即效價試驗(yàn)),對NA 特異性抗體進(jìn)行定量分析。NA 的免疫原性可通過測定結(jié)合或抑制NA的抗體滴度來評價。硫代巴比妥酸(thiobarbituric acid,TBA)試驗(yàn)是最先用于測量NA 抗體效價的方法,由于操作繁瑣,還需使用危險化學(xué)品,目前已被其他方法取代。酶聯(lián)凝集試驗(yàn)(enzyme linked lectin assay,ELLA)準(zhǔn)確度和精密度高,是一種測定NA 特異性抗體效價的替代方法,且還可用于評估流感病毒NA 的抗原漂移［40-42］。目前,廣泛應(yīng)用的酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzymelinkedimmunosorbentassay,ELISA)則是在ELLA 上進(jìn)一步升級,解決了ELLA 不能滿足高通量樣本檢測需求,可用于NA 特異性抗體的檢測。

6 小 結(jié)

NA 作為季節(jié)性流感疫苗及大流行流感疫苗主要成分之一,能夠誘導(dǎo)動物和人類產(chǎn)生獨(dú)立保護(hù)作用。因NA 基因的相對保守性及NA 特異性抗體的廣泛交叉保護(hù)作用,使得基于NA 流感疫苗適用作為通用流感疫苗研究。當(dāng)NA 和HA 的含量達(dá)到病毒包膜上的天然比例,能夠誘導(dǎo)一種平衡反應(yīng),使流感滅活／裂解疫苗具有更好免疫效果。流感疫苗中NA蛋白的量化及對NA 特異性抗體檢定方法的逐步建立,對生產(chǎn)具有廣泛保護(hù)性的高質(zhì)量流感疫苗具有重要意義。