江征，朱文慧，宋彥麗，劉婷，張雪子，英志芳，王劍鋒，李長貴

中國食品藥品檢定研究院,北京102629

全球根除脊髓灰質炎(簡稱脊灰)認證委員會(Global Commission for The Certification of Poliomyelitis,GCC)于2015 年9 月20 日宣布全球已根除Ⅱ型野生脊灰病毒(wild polio virus typeⅡ,WPVⅡ)。2016 年,口服脊灰減毒活疫苗(oral poliomyelitis vaccine,OPV)中去除了Ⅱ型成分,由三價OPV(trivalent OPV,tOPV)轉換為二價OPV(bivalent OPV,bOPV),目的是消除OPVⅡ型衍生病毒導致的相關病例。同時在計劃免疫程序要求引入至少一劑脊灰滅活疫苗(inactivated poliomyelitis vaccine,IPV),以維持兒童對Ⅱ型脊灰病毒的免疫力。隨著根除脊灰的進展,實驗室暫存和使用野生脊灰病毒將受到嚴格控制,因此,采用Sabin 減毒株生產脊灰滅活疫苗更安全。目前,對IPV 的需求不斷增加,許多制造商正在或計劃生產sIPV,且已有sIPV 在中國和日本上市使用［1-3］。

IPV 的效力在體外采用經驗證的ELISA 法及合適的參考物質進行測定,以D 抗原單位(DU)表示。目前,制造商和質控實驗室將WHO 以野毒株生產的第3 代傳統(tǒng)脊髓灰質炎滅活疫苗(conventional inactivated poliomyelitis vaccine,cIPV)國際標準品(international standard,IS)12 ／ 104 用于校準實驗室參考品,來檢測WPV IPV 產品中的D 抗原含量和體內大鼠效力評價［4］。在缺乏具體的sIPV 參考標準和明確規(guī)定劑量要求的情況下,sIPV 產品抗原標識含量差異較大。隨著sIPV 生產和需求不斷增長,建立適用于sIPV 抗原含量檢測的國際標準品尤為重要,以實現sIPV 產品的全球標準化。2015 — 2016年的一項國際合作研究發(fā)現,IPV 國際標準品12 ／104 作為參考來測量sIPV 產品的效價時,無效試驗的比例較高,且實驗室結果間差異較大；當以sIPV樣品作為參考來確定sIPV 研究樣本的效力時,試驗有效性和實驗室間的一致性得到了改善［5］,因此WHO 決定建立專門針對sIPV 產品的新國際標準品。2017—2018 年,WHO 和NIBSC 組織開展了第1 代sIPV D 抗原含量國際標準品的協(xié)作研究,中國食品藥品檢定研究院(簡稱中檢院)呼吸道病毒疫苗室受邀參加此次協(xié)作標定,現將結果報道如下。

1 材料與方法

1.1 樣品 sIPV 候選標準品 17 ／ 130(復樣,編號為17002 和 17005)和 17 ／ 160(復樣,編號為 17004 和17007)分別為已批準上市的制造商提供的商業(yè)生產規(guī)模的濃縮三價sIPV 原液,由NIBSC 分裝為0.5 mL ／安瓿(未添加任何成分),分裝過程隨機抽樣進行裝量和無菌檢查,均符合規(guī)定；監(jiān)測樣品17 ／ 134(編號為 17001)來源與 17 ／ 160 相同,由 NIBSC 稀釋制成疫苗劑量樣品；樣品17 ／ 131(編號為17003)為不同于sIPV 候選標準品的第三家生產廠家提供疫苗原液,由NIBSC 手動無菌分裝；樣品17 ／ 161(編號為17006)由與候選標準品17 ／ 130 相同制造商生產的原液制備的國家參考品,在NIBSC 匯集后重新分裝；cIPV IS 12 ／ 104 的Ⅰ型、Ⅱ型及Ⅲ型標識效價分別為 277、65 和 248 DU ／ mL；cIPV IS 的替代參考制劑08／143 的Ⅰ型、Ⅱ型及Ⅲ型標識效價分別為381、82 和288 DU ／ mL。所有樣品干冰運輸至各參加協(xié)作標定單位,于-70 ℃保存。

1.2 主要試劑及儀器 BD-Difco?脫脂奶粉(貨號:232100)購自BD 美國公司；Sigma?牛血清白蛋白(貨號:HZB0148)購自美國Sigma 公司；Tween 20(貨號:85113)、GibcoTM磷酸鹽緩沖液PBS(pH 7.4,貨號:10010031)、CorningCostar?96 孔酶標板和 ThermoMultiskan Ascent 酶標儀均購自美國ThermoFisher 公司。

1.3 實驗設計 選擇歐洲、美洲和亞洲共13 家單位(7 家制造商實驗室和6 家國家質控實驗室,大部分單位參加過2015—2016 年NIBSC 組織的sIPV疫苗D 抗原效力檢測標準化第一次國際協(xié)作研究)進行協(xié)作標定。要求各單位分別采用統(tǒng)一方法和自建方法對編號 17001 ～ 17007 的 sIPV 樣品和 12 ／104、08 ／ 143 進行 ELISA 試驗,NIBSC 提供統(tǒng)一方法的標準操作程序和各檢測樣品的推薦稀釋度。每個血清型進行3 次獨立檢測,每次試驗包含所有的樣品,并使用新打開的安瓿制劑。以12 ／ 104 及兩種候選標準品為參考標準計算樣品的D 抗原含量。每次檢測原始數據、效力計算結果和試驗有效性統(tǒng)計標準按要求統(tǒng)一報告給NIBSC 進行匯總統(tǒng)計分析。

1.4 統(tǒng)一方法 所用試劑均由NIBSC 統(tǒng)一提供,并按NIBSC 推薦配制方案自行配備,試驗過程按照NIBSC提供的SOP 進行操作。用碳酸鹽緩沖液包被羊源多克隆捕獲抗體,50 μL ／ 孔,2 ～ 8 ℃反應過夜；用洗液1(PBS + 2%脫脂奶粉+ 0.5% Tween 20)洗滌4次,室溫封閉30 min；加入稀釋樣品(按NIBSC 推薦稀釋度進行稀釋),50 μL ／ 孔,每個稀釋度設 2 個復孔,37 ℃反應2 h；用洗液1 洗滌3 次,加入鼠源單克隆檢測抗體(按NIBSC 推薦稀釋度進行稀釋),50 μL ／ 孔,37 ℃反應 1 h；用 PBS 洗滌 3 次,加入顯色試劑 OPD,50 μL ／ 孔,室溫黑暗放置 30 min；用1 mol ／ L 硫酸終止反應,用酶標儀檢測 A492值。

1.5 自建方法 各參加單位使用自建ELISA 體系進行檢測。中檢院自建方法中各試劑均由本實驗室保存。用碳酸鹽緩沖液包被牛源多克隆捕獲抗體,100 μL ／ 孔,2 ～ 8 ℃孵育過夜；用洗液 2(PBS + 1%牛血清白蛋白+ 0.5% Tween 20)洗滌3 次,室溫封閉 1 min；加入稀釋樣品,100 μL ／ 孔,每個稀釋度設2 個復孔,37 ℃反應過夜；用洗液2 洗滌3 次,加入兔源多克隆檢測抗體,100 μL ／ 孔,37 ℃反應 2 h；用洗液 2 洗滌 3 次,加入二抗,100 μL ／孔,37 ℃反應2 h；用洗液 2 洗滌 4 次,加入 TMB,100 μL ／ 孔,室溫黑暗放置 30 min；1 mol ／ L 硫酸終止反應,用酶標儀檢測A450和A620值。

1.6 統(tǒng)計學分析 依據第1 次國際協(xié)作研究經驗,不同實驗室不同型別反應數據可能需要不同類型的分析模型:保證反應線性部分保留至少3 個稀釋度的前提下,大多數實驗室使用平行線法計算樣品相對參考標準效力；為獲取線性劑量反應關系,有的實驗室反應數據可能需做對數轉換處理,且在同一實驗室同一檢測方法下所有型別數據轉換要保持一致；另外有的實驗室自建方法使用四參數模型計算相對效力。

所有數據統(tǒng)一采用NIBSC 官方軟件CombiStats進行有效性分析和結果計算［6-7］。平行線模型的適用以試驗有效性成立為前提,判定試驗無效或不適用平行線法計算的依據包括:劑量反應數據目視明顯不呈線性；測試樣本劑量-反應范圍與協(xié)標參考標準不重疊；測試樣本與參考標準呈非平行關系。其中對樣品和參考標準平行關系成立的有效性標準是通過采用重復樣本相對于彼此的斜率比(即候選標準17 ／ 130樣品編碼17002 與17005 的相互比,候選標準17／160樣品編碼17004 與17007 的相互比)分別定義每種血清型的平行性接受標準。通過公式m = max(s,1 ／ s)計算m 的非參數上限值(95%置信度),其中s 表示一個試驗中復樣的斜率比,取該界值及其倒數值定義為一個可接受的呈平行關系的斜率比范圍。

匯總所有有效的結果計算產生每個實驗室和總體未加權D 抗原含量幾何平均值(geometric mean,GM)。實驗室內和實驗間的結果變異程度用幾何變異系數(geometric coefficient of variation,GCV)表示,按下列公式計算。

GCV(%)=(10 s - 1)× 100%

式中s 為log10 轉換效力的標準偏差。

2 結 果

2.1 平行關系成立的有效性標準 規(guī)定時間內共收到12 個實驗室的檢測數據,采用前10 個按時間順序提交的實驗室數據計算樣品和參考標準呈平行關系的斜率比范圍,Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ的斜率比范圍分別為0.66 ～ 1.51、0.70 ～ 1.43、0.65 ～ 1.54。

2.2 試驗有效性分析 呈現非線性的樣本數據(約3%)被排除計算,見表1。采用上述平行性判定標準,在 08 ／ 143 與 12 ／ 104 之間未發(fā)現不平行情況。當采用候選參考標準時對比12 ／ 104,平行性未發(fā)生一致性改善,但對所有Ⅱ型測定具有較好的提升。當實驗室采用自建方法時,排除計算的數據比例較采用統(tǒng)一方法時更少。以17 ／ 160 作為參考標準時,采用任一方法的平行性均比采用17 ／ 130 更好。

2.3 實驗室內變異 自建方法Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ型實驗室內變異范圍分別為2.6% ～43.6%、2.0% ～21.6%及2.7% ～20.4%,統(tǒng)一方法Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ型實驗室內部變異范圍分別為2.2% ～55.2%、2.2% ～46.5%和3.0% ～45.8%?？傮w上,有91.8%實驗室檢測結果的重復性高于20%,67%實驗室檢測結果的重復性高于10%,個別高變異值可能是由于單一的異常結果。當使用候選標準17 ／ 160 作為參考時結果略好。

2.4 實驗室間變異 當采用自建方法,并以12／104為參考標準時,一些極端差異(最大GCV 為91.8%)集中來自兩個實驗室,因此這兩個實驗室的結果被排除在最終效力計算之外。當采用自建方法,以兩個sIPV 候選標準為參考時,未出現極端差異,且與12／104的參考標準相比,實驗室間一致性有所提升。各實驗室采用統(tǒng)一方法測定的sIPV 樣本D 抗原效力在實驗室間差異較小,結果均納入最終計算中。當采用12 ／ 104 作為參考無論采用何種方法,各實驗室測量08 ／ 143 的效力差異均較小(最大 GCV 為 20.9%)。當采用sIPV 參考標準和檢測樣本來自同一制造商時,實驗室間檢測結果的一致性更優(yōu)(GCV 平均低于10%)。無論采用何種檢測方法,候選標準復樣的檢測結果間一致性均良好:各型別17 ／ 130 復樣間相對比值范圍為0.935 ～ 1.040,最大 GCV 為21.1%；各型別 17 ／160復樣間相對比值范圍為0.961 ～1.018,最大GCV 為11.0%,后者略優(yōu)于前者。見表1。

2.5 候選標準的D 抗原效力 以12 ／ 104 為參考標準時,候選標準品 17 ／ 130 的 I、Ⅱ和Ⅲ型 D 抗原含量幾何平均值分別為 50、608 和 450 DU ／ mL,17 ／160 的Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ型D 抗原含量幾何平均值分別為239、136 和 237 DU ／ mL,見圖 1。

表1 試驗有效性及實驗室間變異情況(%)Tab.1 Assay validity and inter-laboratory variability(%)

圖1 以不同標準品檢測各樣品的D 抗原含量GMFig.1 Geometric mean of D-Ag contentdetermined by using various standards

2.6 中檢院檢測情況 采用自建方法的Ⅲ型檢測結果與總體平均估計值有較大偏離,因此未納入研究統(tǒng)計評價中。采用統(tǒng)一方法檢測的所有結果均滿足平行性可接受標準,納入最終賦值統(tǒng)計計算,實驗室內部變異為5.6% ～9.9%,表明本實驗室操作精準度良好。

3 討 論

在2015—2016 年第1 次sIPV 標準化國際協(xié)作研究的基礎上,確定了本次協(xié)作標定的研究方案和候選標準材料,并沿用了第1 次協(xié)作研究的各參加單位。本次研究結果證實了第1 次協(xié)作研究的結論,即現行國際cIPV 標準品12 ／ 104 作為標準測定sIPV 產品中D 抗原含量的做法并不是最佳選擇,主要由于檢測結果在實驗室自建方法間變異度較高。當采用兩種sIPV 候選標準材料作為標準時,sIPV 產品D 抗原結果的實驗室間一致性得到了明顯提升。另外,兩個候選標準的重復樣品的D 抗原含量GM在實驗室內和實驗室間均有較好的一致性。上述結果表明,兩種sIPV 候選標準材料均具有作為sIPV D抗原含量測定的國際標準品的潛力。

NIBSC 開展的穩(wěn)定性研究表明,這兩種候選標準材料在長期儲存(-70 ℃)和短期實驗室操作的溫度下(4 ～20 ℃)均是穩(wěn)定的。但兩種材料在-20 ℃儲存期間的穩(wěn)定性較差,特別是17 ／ 160 保存9 個月后基本檢測不到D 抗原。在4 ℃儲存9 個月,17／130的效力有所下降,但17 ／ 160 的效力保持相對穩(wěn)定。因此,綜合協(xié)作標定和穩(wěn)定性研究結果得出結論:候選材料 17 ／ 130 和 17 ／ 160 均適合作為 sIPV D 抗原含量檢測國際標準；目前17 ／ 160 在試驗有效性、實驗室內和實驗室間的一致性和整體熱穩(wěn)定性方面的總體結果略好,因此被選定為第1 代sIPV D 抗原含量檢測的國際標準品,標識的效價Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ型分別為 239、136 和 237 DU ／ mL［8］。

目前各sIPV 實驗室自建的ELISA 檢測方法形式多種多樣,包括不同的捕獲和檢測抗體組合、重復樣品數量和每個樣品的稀釋度數目、不同的檢測用底物和計算D 抗原量的統(tǒng)計分析方法等。采用統(tǒng)一檢測方法之后,無論使用何種材料作為標準去檢測sIPV 抗原含量,實驗室間的差異大幅減小,原因可能是統(tǒng)一方法的操作在一定程度上避免了不同檢測方法差異帶來的影響。另外,無論是否統(tǒng)一檢測方法,以cIPV 或sIPV 作為標準檢測sIPV 樣品時,不同實驗室間均顯示良好的一致性,尤其是當標準和樣品來自同一生產廠家時,實驗室間一致性最好,可能是由于生產工藝不同,如不同的蛋白質-甲醛相對濃度等,導致來源相同毒株的不同產品一些表位結構出現了微小差異。因此,建立sIPV 國際標準品后的標準化研究,可考慮進一步優(yōu)化協(xié)調實驗室間的D 抗原ELISA 檢測方法,或建立適用于不同sIPV 產品的放行檢測方法,如建立對不同sIPV 產品和 ／ 或cIPV 產品具有相似反應活性的抗體試劑等。

基于cIPV 和sIPV 的抗原特性差異及建立同源參考物質以精確測量有效成分的必要性,防止未來使用sIPV 國際標準賦值與cIPV 產生混淆,國際上提議一個獨立于cIPV 效力的D 抗原單位(DU)的新抗原單位,即Sabin D 抗原單位(SDU),專門用于定義sIPV 產品。2019 年WHO 標準物質委員會同意將推薦的候選標準材料17 ／ 160 作為第1 個sIPV D抗原含量的國際標準品,并賦予Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ型效價分別為100 SDU ／ mL,用于校準sIPV 的二級參考品。目前該新國際標準僅被驗證用于體外試驗,WHO 標準物質委員會提議將進一步研究評估其用于大鼠體內效力測定的適用性,并根據全球現狀提出了有效的使用建議:現有已獲得許可和處于后期開發(fā)階段的sIPV 產品制造商,已根據其使用DU 表示了效力值,在獲得國家監(jiān)管機構(National Regulation Authority,NRA)批準的情況下可繼續(xù)使用已經標識DU 的內部參考效力值；同時建議根據sIPV 國際標準品測定其sIPV 產品的SDU 效力值,并建立“SDU”與“DU”之間的相關性,作為一個關鍵的質量屬性,確保產品間的可比性［9-10］。