唐婉林，王路得，顧美萍，Kamara SAIDU，汪琪，李明洋，陳韶，張麗芳

溫州醫(yī)科大學(xué)微生物學(xué)與免疫學(xué)教研室,浙江溫州325035

宮頸癌是常見的女性惡性腫瘤之一,在全球女性惡性腫瘤中發(fā)病率僅次于乳腺癌居第二位［1］。人乳頭瘤病毒(human papillomavirus,HPV)高危型別16、18、31、33、45、58 等感染與宮頸癌的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)。盡管HPV 高危型別感染呈區(qū)域或地區(qū)分布特點,但研究表明,全球誘發(fā)宮頸癌的主要型別為HPV16 和18,尤其以HPV16 多見,約占宮頸癌組織細(xì)胞中 HPV 檢測的 85%［2］。HPV16 可通過表達(dá)E6 和E7 腫瘤蛋白誘發(fā)宮頸癌,目前對E6 和E7 蛋白的致癌機(jī)制研究表明,E6 和E7 蛋白可分別通過抑制宮頸細(xì)胞抑癌基因p53 和pRB 的表達(dá),誘導(dǎo)宮頸細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化并發(fā)展為宮頸癌。而HPV16 E5 蛋白主要在宮頸癌發(fā)生的早期階段發(fā)揮誘導(dǎo)細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化作用,即可通過增強(qiáng)表皮生長因子(epidermal augmentum factor,EGF)表達(dá),干擾宿主免疫應(yīng)答和增進(jìn)病毒免疫逃逸,抗凋亡和促進(jìn)血管生成,并與E6和E7 蛋白在增強(qiáng)細(xì)胞永生化潛能方面具有協(xié)同作用等,發(fā)揮著早期誘導(dǎo)細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化的作用。因此,E5 蛋白是誘發(fā)早期宮頸惡性轉(zhuǎn)化的蛋白之一,也是早期靶向治療和分子診斷的靶抗原之一［3］。

本研究通過生物信息學(xué)方法分析HPV16 E5 蛋白的免疫優(yōu)勢肽段,進(jìn)一步通過免疫白兔的方法制備高效價多克隆抗體并鑒定其免疫原性,通過間接細(xì)胞免疫熒光試驗驗證多克隆抗體識別和結(jié)合HPV16 E5 蛋白的特異性,為HPV16 E5 蛋白的生物學(xué)特性研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 SPF 級日本大耳白兔,雌性,6 ～8周齡,體重4 ～5 kg,購自溫州醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心,合格證號:SYXK(浙)2014-0006。

1.2 細(xì)胞 TC-1 細(xì)胞為溫州醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院微生物與免疫實驗室前期保存,TC-1-E5 細(xì)胞由該實驗室前期構(gòu)建并保存。

1.3 主要試劑及儀器 匙孔血藍(lán)蛋白(keyhole limpet hemocyanin,KLH)、完全弗氏佐劑、不完全弗氏佐劑、TMB 顯色液均購自美國Sigma 公司；脫脂奶粉購自美國BD 公司；濃硫酸、吐溫、戊二醛購自溫州金山試劑公司；HRP-羊抗兔IgG(H + L)購自杭州聯(lián)科生物有限公司；Hoechst33258、抗熒光猝滅劑、Cy3 羊抗兔Ig(H + L)購自碧云天生物技術(shù)有限公司；甘氨酸、山羊血清購自北京Solarbio 公司；Bio Elx 800 酶標(biāo)儀購自美國Bio-tek 公司。

1.4 HPV16 E5 蛋白氨基酸序列的獲取 從瑞士生物信息網(wǎng)站的 Swissport 蛋白數(shù)據(jù)庫(http:／ ／ www.expasy.org ／)獲取 HPV16 E5 的全長氨基酸序列(PRO-0000133289)。

1.5 HPV16 E5 蛋白二級結(jié)構(gòu)的預(yù)測 分別采用EXPASY(http:／ ／ www.expasy.org ／ proteomics ／)在線服務(wù)器中的 GOR［4］和 SOPMA［5］軟件進(jìn)行分析預(yù)測。

1.6 HPV16 E5 蛋白跨膜結(jié)構(gòu)的預(yù)測 分別采用Expasy 在線服務(wù)器中的TMPRED 和PROTSCALE軟件進(jìn)行分析預(yù)測。

1.7 HPV16 E5 蛋白親水性、表面可及性、抗原性、極性和柔韌性參數(shù)的預(yù)測 用Expasy(https:／ ／ web.expasy.org ／ protscale ／)分析預(yù)測 E5 蛋白的 HOOP ＆WOODS 親水性［6］、Emini 表面可及性,用 DNAstar分析E5 蛋白的Jameson-Wolf 抗原性、Zimmerman極性［7］及柔韌性。

1.8 HPV16 E5 蛋白細(xì)胞毒性T 細(xì)胞(cytotoxic T lymphocyte,CTL)表位的預(yù)測 用Syfpeithi［8］(http:／／www.syfpeithi.de ／)分析預(yù)測 E5 蛋白的 CTL 抗原表位。

1.9 綜合分析 綜合以上參數(shù),分析HPV16 E5 蛋白B 細(xì)胞表位的優(yōu)勢位點,并采用吳玉章等［9］建立的抗原性指數(shù)(antigenic index,AI)綜合分析。篩選含HPV16 E5 蛋白B 細(xì)胞表位,同時參考CTL 表位,篩選HPV16 E5 蛋白的免疫優(yōu)勢肽段。

1.10 E5 免疫優(yōu)勢肽段的合成及動物免疫 選擇含E5 可能的B 細(xì)胞表位和CTL 表位的N-端氨基酸序列肽段,即E-ZLF102(MTNLDTASTTLLACFLL,aa 1 ～17),由上海波泰生物科技有限公司進(jìn)行多肽合成。并將白兔分為 3 組,即 E-ZLF102、KLH 和 PBS 組,每組3 只。其中 E-ZLF102 組為E-ZLF102 多肽與KLH 偶聯(lián)后免疫,偶聯(lián)比例:根據(jù)KLH 與多肽的摩爾質(zhì)量比1︰100,經(jīng)計算質(zhì)量比約為1︰1,即加入等量的KLH 和多肽。將KLH 與多肽混合后,緩慢滴加1 mL 0.3%戊二醛溶液,置冰中,脫色搖床振蕩反應(yīng)2 h,溶液變成黃色后,加入1 mol ／ L 甘氨酸作用30 min,終止反應(yīng),將反應(yīng)物于PBS 溶液中4 ℃透析過夜,4 ℃保存待用。

實驗前采集白兔血清,作為陰性對照。按照0、2、4、6 周免疫程序進(jìn)行免疫,首次免疫佐劑采用完全弗氏佐劑,第2 ～4 次免疫采用不完全弗氏佐劑,分別與抗原等量混勻并充分乳化,每次每只家兔背部皮下多點注射500 μg E-ZLF102 多肽抗原、KLH蛋白和PBS 對照。同時,于2、4、6 周自兔耳緣靜脈采血,第8 周兔心臟取血,4 ℃,1 500×g 離心20 min,收集上層血清,置-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.11 多克隆抗體反應(yīng)及效價的ELISA 檢測 取0、2、4、6、8 周血清,按 1 ∶1 000 稀釋后,ELISA 法檢測3 組血清與HPV16 E5 E-ZLF102 免疫優(yōu)勢肽段結(jié)合的特異性。將無偶聯(lián)KLH E-ZLF102 多肽抗原按20 μg ／ mL 比例稀釋后包被 ELISA 板,4 ℃過夜；PBST 洗滌3 次,PBST-5%脫脂奶粉37 ℃封閉 1 h；加入倍比稀釋后第8 周的白兔免疫血清(分別按1 ∶160、1 ∶640、1 ∶2 560、1 ∶10 240 和 1 ∶40 960 稀釋),37 ℃孵育 1 h；PBST 洗滌 3 次,加入 HRP-羊抗兔 IgG(H + L)(1 ∶5 000 稀釋),37 ℃孵育 1 h；置 Bio Elx 800 酶標(biāo)儀于450 nm 波長處讀取A 值。所有血清樣本均重復(fù)檢測3 孔,設(shè)KLH 組為陰性對照組,并設(shè)PBS 組為空白對照組。

1.12 多克隆抗體特異性的間接細(xì)胞免疫熒光試驗分別將 TC-1-E5 和TC-1 細(xì)胞以每孔 2 × 104個接種放置蓋玻片的6 孔板中,細(xì)胞培養(yǎng)箱37 ℃培養(yǎng)24 h至長成單層細(xì)胞,取出蓋玻片,經(jīng)40 g ／ L 多聚甲醛固定后,1 g ／ L Triton X-100 處理 10 min,加入 20%山羊血清37 ℃封閉1 h；經(jīng)PBS 洗滌后,每孔分別加入 HPV16 E5 E-ZLF102 組、KLH 組和 PBS 空白對照組兔血清(均 1 ∶2 000 稀釋),4 ℃過夜；洗滌后,每孔加入 Cy3 羊抗兔Ig(H + L)(1 ∶1 000 稀釋),37 ℃孵育 1 h；加入 Hoechst33258 襯染細(xì)胞核(1 ∶1 000 稀釋)；PBS 洗滌、封片,熒光顯微鏡下觀察拍照。試驗設(shè)未轉(zhuǎn)染E5 的TC-1 細(xì)胞及KLH 組血清、PBS 組血清作為對照。

1.13 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS V 21.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析,組間比較采用配對t 檢驗,以P﹤0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 HPV16 E5 蛋白的氨基酸序列 HPV16 E5 蛋白由83 個氨基酸組成,相對分子質(zhì)量約為9 400,等電點(pI)為8.30。氨基酸序列見圖1。

圖1 HPV16 E5 蛋白的氨基酸序列Fig.1 Amino acid sequence of HPV16 E5 protein

2.2 HPV16 E5 蛋白的二級結(jié)構(gòu) 結(jié)果顯示,E5 蛋白的二級結(jié)構(gòu)以無規(guī)則卷曲和α-螺旋為主,β-轉(zhuǎn)角相對較少。兩種方法預(yù)測HPV16 E5 蛋白的二級結(jié)構(gòu)的構(gòu)成比［n = 83,n(%)］,GOR 法:α-螺旋 23(27.7%)、β-折疊27(32.5%)、無規(guī)則卷曲33(39.8%)；SOPMA 法:α-螺旋 59(71%)、β-折疊 11(13.3%)、無規(guī)則卷曲13(15.7%)。取兩種方案中預(yù)測結(jié)果一致的重疊區(qū),可見無規(guī)則卷曲主要位于N-端氨基酸序列的1 ～ 5、29 ～ 35,見圖 2。

圖2 HPV16 E5 蛋白的二級結(jié)構(gòu)Fig.2 Secondary structure of HPV16 E5 protein

2.3 HPV16 E5 蛋白的跨膜結(jié)構(gòu) 結(jié)果顯示,E5 蛋白為跨膜蛋白,其3 處跨膜區(qū)域分別位于N-端氨基酸序列的 10 ～ 28、42 ～ 62 和 63 ～ 83 處,見圖 3。

圖3 HPV16 E5 蛋白的跨膜區(qū)域預(yù)測Fig.3 Prediction of transmembrane region of HPV16 E5 protein

2.4 HPV16 E5 蛋白的親水性、表面可及性、抗原性、極性及柔韌性參數(shù) 結(jié)果顯示,應(yīng)用不同參數(shù)預(yù)測的B 細(xì)胞抗原表位肽段略有差異,但E5 的N-端氨基酸片段2 ～7(抗原指數(shù) ≥ 0,親水性指數(shù) ≥ 0,表面可及性指數(shù) ≥ 1)在多種預(yù)測方法中一致,見圖 4 和表 1。

2.5 HPV16 E5 蛋白的 CTL 表位 HLA-A2 和 HLAA3 限制性表位分析結(jié)果顯示,CTL 表位可能位于N-端氨基酸序列的 3 ～ 11、11 ～ 19、15 ～ 23 處,見表 2和表3。

圖4 HPV16 E5 不同參數(shù)的預(yù)測結(jié)果Fig.4 Prediction of various parameters of HPV16 E5 protein

表1 不同參數(shù)預(yù)測結(jié)果區(qū)域Tab.1 Regions of prediction results of various parameters

表2 HPV16 E5 來源的HLA-A2 限制性表位預(yù)測結(jié)果Tab.2 Prediction of HLA-A2 restricted epitopes from HPV16 E5

表3 HPV16 E5 來源的HLA-A3 限制性表位預(yù)測結(jié)果Tab.3 Prediction of HLA-A3 restricted epitopes from HPV16 E5

2.6 綜合分析結(jié)果 HPV16 E5 蛋白 N-端 2 ～7(NLDTAST)顯示出較好的親水性、柔韌性、表面可及性及抗原性,在二級結(jié)構(gòu)上易于形成無規(guī)則卷曲和轉(zhuǎn)角,是可能B 細(xì)胞線性肽段位置。計算HPV16 E5 蛋白B 細(xì)胞可能的表位區(qū)段AI,結(jié)果顯示,HPV16 E5 蛋白 N-端 2 ～ 7 肽段 AI 為 0.031,29 ～ 42 肽段AI 為0.021,經(jīng)同源性分析,與HPV 其他型別E5 無同源性。本研究篩選含有可能B 細(xì)胞表位(N-端2 ～7 肽段)和3 個CTL 表位在內(nèi)的N-端氨基酸序列(MTNLDTASTTLL ACFLL,aa 1 ～17)作為免疫優(yōu)勢表位,進(jìn)一步進(jìn)行免疫原性分析和鑒定。

2.7 多克隆抗體反應(yīng)及效價 在抗原免疫后約2周,家兔開始產(chǎn)生特異性抗體,并于第8 周達(dá)到最大值。0、2、4、6、8 周血清按 1 ∶1 000 稀釋后,ELISA法檢測各組血清與HPV16 E5 E-ZLF102 免疫優(yōu)勢肽段結(jié)合的特異性,結(jié)果顯示,HPV16 E5 免疫優(yōu)勢肽段E-ZLF102 組兔于免疫后4 周開始產(chǎn)生HPV16 E5 優(yōu)勢表位特異性抗體,并隨時間延長抗體滴度逐漸增加。E-ZLF102 組產(chǎn)生的抗體效價在第8 周與KLH 和PBS 組比較,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t 分別為50.16 和 38.91,P﹤0.001),見圖 5。用 ELISA 法檢測稀釋后第8 周兔血清,結(jié)果顯示,HPV16 E5 免疫優(yōu)勢肽段E-ZLF102 血清抗體效價可達(dá)1 ∶10 000以上,見圖6。

圖5 ELISA 法檢測HPV16 E5 多肽多克隆抗體反應(yīng)Fig.5 ELISA of reaction of polyclonal antibody against HPV-16 E5

圖 6 ELISA 法檢測家兔血清中抗HPV16 E5 多克隆抗體效價Fig.6 ELISA titer of anti-HPV16E5 polyclonal antibody in rabbit sera

2.8 多克隆抗體的特異性 結(jié)果顯示,在TC-1-E5 細(xì)胞中,HPV16 E5 多肽E-ZLF102 免疫組胞漿內(nèi)可見斑點狀的紅色特異性結(jié)合團(tuán)塊,KLH 和PBS 組則未見特異性結(jié)合的染色信號；而在未轉(zhuǎn)染HPV16 E5基因的TC-1 細(xì)胞中,3 組兔血清抗體均未見特異性結(jié)合的染色信號。見圖7。表明HPV16 E5 多肽EZLF102 組多克隆抗體可特異性識別穩(wěn)轉(zhuǎn)TC-1 細(xì)胞表達(dá)的E5 蛋白。

圖 7 間接細(xì)胞免疫熒光試驗檢測多克隆抗體與抗HPV16 E5 蛋白結(jié)合能力(× 400)Fig.7 IFA of binding capacity of polyclonal antibody to anti-HPV16 E5 protein(× 400)

3 討 論

抗體是B 細(xì)胞受到外界抗原刺激后分化為漿細(xì)胞分泌的具有清除抗原作用的蛋白質(zhì)?？贵w分為單克隆抗體、多克隆抗體和基因工程抗體3 種,其中以多克隆抗體的制備最簡單,成本較低,通常為眾多研究的首選［10］。HPV16 E5 蛋白在宮頸癌早期發(fā)生過程中起重要作用,提示HPV16 E5 蛋白的研究可為闡述宮頸早期病變損傷的機(jī)制奠定基礎(chǔ),也可為早期宮頸病變的治療及預(yù)防提供可能的靶標(biāo)。本研究分析了HPV16 E5 蛋白的二級結(jié)構(gòu)、親水性、抗原性、表面可及性、CTL 表位等生物信息學(xué)參數(shù),并結(jié)合抗原指數(shù)分析,確定其可能的B 細(xì)胞表位位于N-端aa 2 ～7。本研究將含有B 表位及多個CTL 表位的 HPV16 E5 蛋白 N-端(MTNLDTASTTLLACFLL,aa 1 ～17)序列肽段作為免疫優(yōu)勢肽段進(jìn)行了免疫原性分析,并對制備的多克隆抗體的效價及特異性進(jìn)行了驗證。選擇免疫優(yōu)勢肽段(aa 1 ～17),其中E5蛋白可能B 細(xì)胞表位位于N-端aa 2 ～7 區(qū)段,而跨膜區(qū)位于N-端aa 10 ～28 區(qū)段,經(jīng)預(yù)測分析主要為CTL表位。研究結(jié)果顯示,免疫優(yōu)勢肽(MTNLDTASTTLLACFLL)免疫日本大白耳兔后,其多克隆抗體效價隨免疫次數(shù)的增加而逐漸升高,且通過間接免疫熒光試驗分析,多克隆抗體可特異結(jié)合HPV E5 蛋白穩(wěn)轉(zhuǎn)的細(xì)胞株(TC-1-E5)表達(dá)的E5 靶蛋白。表明,HPV16 E5 蛋白 N-端(MTNLDTASTTLLACFLL,aa 1 ～17)序列肽段具有良好的免疫原性,并可制備多克隆抗體。同時也提示生物信息學(xué)分析和篩選免疫優(yōu)勢肽的方法具有較高的可靠性。鑒于目前尚無HPV16 E5 蛋白的商業(yè)化抗體,本研究獲得的HPV16 E5 特異性多克隆抗體,可為進(jìn)一步研究HPV16 E5 蛋白的生物學(xué)特性奠定實驗基礎(chǔ)。