侯敏娜，李 丹，劉艷紅，彭修娟，陶星茹

(1.陜西國(guó)際商貿(mào)學(xué)院 醫(yī)藥學(xué)院，陜西 咸陽(yáng) 712046；2. 西安外事學(xué)院 醫(yī)學(xué)院， 陜西 西安 710077)

百合，是百合科百合屬(Lilium)植物卷丹的干燥肉質(zhì)鱗葉[1]，其味甘、性寒，歸心、肺二經(jīng)，具有藥食同源的本領(lǐng)[2,3]。百合中主要含有酚酸甘油酯、皂苷、生物堿及多糖等多種活性成分[4]?，F(xiàn)代藥理研究表明，百合具有止咳、祛痰、清心安神、調(diào)節(jié)免疫、抗腫瘤和抗氧化等作用[5～7]。

現(xiàn)行版《中國(guó)藥典》中蜜炙百合的炮制方法無(wú)明確的工藝參數(shù)，缺乏客觀、量化的指標(biāo)，故本研究以浸膏重量和百合皂苷得率的綜合評(píng)價(jià)為指標(biāo)，考察炒藥溫度、加蜜量、炒藥時(shí)間等因素，設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)以確定其炮制工藝各參數(shù)。這為蜜炙鮮百合飲片的深加工提供理論參考依據(jù)，同時(shí)對(duì)于臨床用藥具有重要的理論和實(shí)際意義。

1 儀器與試藥

1.1 試藥

鮮百合(購(gòu)于甘肅蘭州，經(jīng)我院中藥學(xué)教研室雷國(guó)蓮教授鑒定為L(zhǎng)ilium)、薯蕷皂苷標(biāo)準(zhǔn)品(中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：2014041)、蜂蜜(冠生園牌，上海冠生園蜂制品有限公司)、高氯酸(天津市盛奧化學(xué)試劑有限公司)、甲醇(天津化學(xué)試劑有限公司)等，試劑均為分析純。

1.2 儀器

KQ5200DE型超聲波提取儀(昆山市超聲儀器有限公司)、SHZ-3型循環(huán)水真空泵(上海亞榮生化儀器廠)、TCL-62B型臺(tái)式離心機(jī)(長(zhǎng)沙恒諾儀器設(shè)備公司)、TU-1810型紫外分光光度計(jì)(上海長(zhǎng)城制造有限公司)、BS224S型電子分析天平(賽多利斯儀器有限公司)、HH-2型電熱恒溫水浴鍋(北京科偉永興儀器有限公司)等。

2 方法

2.1 煉蜜

百合藥材富含淀粉有一定黏性，且質(zhì)地致密，生蜜不易被吸收，故選擇嫩蜜。即將生蜜加熱煮沸，直到溫度達(dá)到105～115 ℃，過(guò)濾去沫，即可。

2.2 試驗(yàn)方法

2.2.1 蜜炙百合的炮制方法 準(zhǔn)確稱(chēng)取經(jīng)曬干、切片后的鮮百合藥材40 g，倒入預(yù)先預(yù)熱好的炒鍋中，翻炒，待百合切片中水分蒸發(fā)至其表面顏色稍微加深，用手掰之干脆，加入定量嫩蜜，在一定溫度下，翻炒數(shù)分鐘，至表面呈黃棕色，偶見(jiàn)黃焦斑，摸之不粘手，傾出，攤涼，即可。

2.2.2 對(duì)照品溶液配制 準(zhǔn)確稱(chēng)取2.1500 mg薯蕷皂苷對(duì)準(zhǔn)品，加甲醇溶解，定容于10 mL容量瓶中。即可得到濃度為0.2150 mg·mL-1的薯蕷皂苷對(duì)照品溶液，密閉保存，備用。

2.2.3 樣品溶液制備 稱(chēng)取蜜炙后的百合10 g置于燒杯中，加60 mL蒸餾水，超聲提取3次，合并提取液，濃縮至20 mL，放涼，加入100 mL乙醇，靜置24 h。抽濾、離心，可得沉淀和上清液。將沉淀于恒溫干燥箱中干燥，稱(chēng)重。精密移取5 mL上清液于50 mL容量瓶，加蒸餾水定容至刻度，搖勻，密閉保存，備用。

2.2.4 測(cè)定波長(zhǎng)的選擇 精密移取“2.2.2”中對(duì)照品溶液1 mL，依次加入新配制的5%香草醛-冰醋酸溶液0.3 mL，高氯酸0.7 mL，搖勻后，在60 ℃水浴中反應(yīng)20 min，取出，放涼。加入冰醋酸8 mL，搖勻。在紫外波長(zhǎng)為200～800 nm范圍內(nèi)掃描，發(fā)現(xiàn)波長(zhǎng)在535 nm處為最大吸收。因此，選擇535 nm作為百合皂苷的檢測(cè)波長(zhǎng)。

2.2.5 驗(yàn)證性試驗(yàn) 主要有:

(1)精密度試驗(yàn)

設(shè)定波長(zhǎng)為535 nm，連續(xù)測(cè)定5次吸光度值的對(duì)照品溶液及空白溶液。計(jì)算可得RSD值為0.27%，表明儀器精密度良好。

(2)穩(wěn)定性試驗(yàn)

移取“2.2.3”項(xiàng)下制備的樣品溶液1 mL于試管中，在0～5 h內(nèi)，每隔1 h，照“2.2.4”中顯色體系的參數(shù)及方法處理后，在波長(zhǎng)535 nm處測(cè)百合皂苷A值，經(jīng)計(jì)算得RSD值為0.10 %，表明供試品溶液穩(wěn)定性良好。

(3)重復(fù)性試驗(yàn)

照“2.2.3”法制備5份樣品溶液，分別移取1 mL，照“2.2.4”中顯色體系的參數(shù)及方法處理后，測(cè)定0～5 h內(nèi)的各A值，計(jì)算得到RSD值為0.20 %，表明了本法重復(fù)性良好。

(4)加樣回收率試驗(yàn)

稱(chēng)取6份百合粉末各0.5 g，按“2.2.3”法制備樣品溶液，移取1 mL于25 mL容量瓶，加入0.25 mg薯蕷皂苷標(biāo)準(zhǔn)品溶液，照“2.2.4”中顯色體系的參數(shù)及方法處理后，測(cè)定0～5 h內(nèi)的A值，計(jì)算加樣回收率，計(jì)算得RSD值為1.42 %，說(shuō)明了本法加樣回收率良好。

2.2.6 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 取6支試管，分別移入0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL對(duì)照品溶液，按“2.2.4”中顯色體系的參數(shù)及方法處理后，測(cè)定A值。以薯蕷皂苷的濃度(C)為橫坐標(biāo)(x)，吸光度(A)為縱坐標(biāo)(y)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線?？傻脴?biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=0.0167 x +0.255，R2=0.9957，在0.048～0.162 mg·mL-1范圍內(nèi)，濃度跟吸光度呈良好的線性關(guān)系。

2.2.7 樣品溶液的測(cè)定 移取1 mL樣品溶液于試管中，照“2.2.3”中顯色體系的參數(shù)及方法處理后，于535 nm下測(cè)定吸光度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，代入公式得到百合皂苷濃度，計(jì)算可得百合皂苷得率。

2.2.8 百合皂苷得率及綜合評(píng)分計(jì)算 根據(jù)吸光度值，計(jì)算百合皂苷濃度，以浸膏重量和百合皂苷得率進(jìn)行綜合性評(píng)分[8～13]。公式如下：

百合皂苷的得率(%)=C×D×V/M×100 %

其中，C為皂苷濃度，單位為mg·mL-1；D為稀釋倍數(shù)；V為體積，單位為mL；M為稱(chēng)取藥材質(zhì)量，單位為g。

綜合評(píng)分(Y)= (浸膏重量×0.5 /浸膏重量最大值+皂苷得率×0.5 /皂苷得率最大值) × 100

3 結(jié)果與分析

3.1 單因素選取

選擇可能影響綜合評(píng)分高低的炒藥溫度(60 ℃、80 ℃、100 ℃、120 ℃、140 ℃、160 ℃)；加蜜量(4 mL、8 mL、12 mL、16 mL、20 mL、24 mL)；炒藥時(shí)間(3 min、6 min、9 min、12 min、15 min、18 min)3個(gè)因素進(jìn)行試驗(yàn)，以確定相關(guān)因素及各因素的適應(yīng)范圍，研究這3個(gè)因素對(duì)綜合評(píng)分的影響[14～17]。

3.2 綜合評(píng)分的影響因素水平篩選結(jié)果

3.2.1 炒藥溫度對(duì)綜合評(píng)分的影響 在百合加蜜量為8 mL，炒藥時(shí)間為9 min的前提下，將炒藥溫度設(shè)置為6個(gè)水平，分別為60 ℃、80℃、100 ℃、120 ℃、140 ℃、160 ℃。在此條件下考察炒藥溫度對(duì)綜合評(píng)分高低的影響。結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 炒藥溫度對(duì)綜合評(píng)分的影響

由圖1可看出，當(dāng)炒藥溫度為120 ℃時(shí)，綜合評(píng)分達(dá)最高。當(dāng)炒藥溫度小于120 ℃時(shí)，綜合評(píng)分呈上升趨勢(shì)；當(dāng)炒藥溫度大于120 ℃時(shí)，綜合評(píng)分明顯呈降低趨勢(shì)?？赡苁怯捎跍囟仍礁撸俸纤幉脑浇咏炕?，使得浸膏重量和皂苷得率有所下降，以致其綜合評(píng)分下降。因此，炒藥溫度選擇為120 ℃時(shí)，百合蜜炙效果最佳。

3.2.2 加蜜量對(duì)綜合評(píng)分的影響 在百合炒藥溫度為120 ℃，炒藥時(shí)間為9 min的前提下，將加蜜量設(shè)置為6個(gè)水平，分別為4 mL、8 mL、12 mL、16 mL、20 mL、24 mL。在此條件下考察加蜜量對(duì)綜合評(píng)分高低的影響。結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 加蜜量對(duì)綜合評(píng)分的影響

由圖2可以看出，當(dāng)加蜜量為16 mL時(shí)，綜合評(píng)分達(dá)最高。當(dāng)加蜜量小于16 mL時(shí)，綜合評(píng)分呈明顯上升趨勢(shì)；當(dāng)加蜜量大于16 mL時(shí)，綜合評(píng)分略顯降低趨勢(shì)。可能是由于加蜜量越高時(shí)，藥材不能完全、均勻的吸收，且阻止了皂苷的溶出，以致其綜合評(píng)分下降。因此，加蜜量選擇為16 mL時(shí)，百合蜜炙效果最佳。

3.2.3 炒藥時(shí)間對(duì)綜合評(píng)分的影響 在百合炒藥溫度為120 ℃，加蜜量為16 mL的前提下，將炒藥時(shí)間設(shè)置為6個(gè)水平，分別為3 min、6 min、9 min、12 min、15 min、18 min。在此條件下考察炒藥時(shí)間對(duì)綜合評(píng)分高低的影響。結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 炒藥時(shí)間對(duì)綜合評(píng)分的影響

由圖3可以看出，當(dāng)炒藥時(shí)間為12 min時(shí)，綜合評(píng)分達(dá)最高。當(dāng)炒藥時(shí)間小于12 min時(shí)，綜合評(píng)分因受炒藥時(shí)間的影響較大，呈顯著的上升趨勢(shì)；當(dāng)炒藥時(shí)間大于12 min時(shí)，綜合評(píng)分呈緩慢下降趨勢(shì)?？赡苁怯捎诔此帟r(shí)間越長(zhǎng)時(shí)，百合藥材內(nèi)的成分因高溫發(fā)生了變化，使得浸膏重量和皂苷得率有所下降，以致其綜合評(píng)分下降。因此，炒藥時(shí)間選擇為12 min時(shí)，百合蜜炙效果最佳。

3.3 正交試驗(yàn)法優(yōu)化蜜炙百合炮制工藝條件的確定

3.3.1 正交設(shè)計(jì)分析因素水平的選取及實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 根據(jù)單因素的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，綜合考慮炒藥溫度、加蜜量、炒藥時(shí)間三個(gè)自變量對(duì)綜合評(píng)分存在顯著影響，以A、B和C分別表示炒藥溫度、加蜜量及炒藥時(shí)間，各自的不同水平分別以1、2和3表示，設(shè)計(jì)三因素三水平的9組正交試驗(yàn)。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 蜜炙百合的炮制工藝正交試驗(yàn)因素水平

3.3.2 正交試驗(yàn)數(shù)據(jù)分析結(jié)果 由表2，表3正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析可知，炒藥溫度對(duì)綜合評(píng)分的影響最為顯著。其他因素的影響不顯著，三個(gè)因素對(duì)綜合評(píng)分的影響程度為炒藥溫度(A) >炒藥時(shí)間(B)>加蜜量(C)，A因素各水平對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響大小依次為A2>A1>A3，A2對(duì)其影響最大，B因素各水平對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響大小依次為B2>B3>B1，B2對(duì)其影響最大，C因素各水平對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響大小依次為C1>C2>C3，C2對(duì)其影響最大， 由此得到最佳的百合蜜炙工藝為A2B2C1，即炒藥溫度為120 ℃，炒藥時(shí)間為9 min，加蜜量為16 mL。

表2 數(shù)據(jù)直觀分析

表3 方差分析

3.3.3 工藝驗(yàn)證 按照上述所得的最佳炮制工藝進(jìn)行三次驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。由驗(yàn)證結(jié)果可知，按最佳炮制工藝蜜炙的百合浸膏重量為0.7058 g， 百合皂苷得率為1.62 %，計(jì)算綜合評(píng)分為85.06，計(jì)算得RSD均小于5 %，說(shuō)明此蜜炙工藝條件穩(wěn)定可行。結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 工藝驗(yàn)證試驗(yàn)

4 討論

試驗(yàn)是對(duì)蜜炙鮮百合的炮制工藝進(jìn)行的優(yōu)選。由于大量文獻(xiàn)資料和現(xiàn)行版《中國(guó)藥典》未對(duì)蜜炙藥材的煉蜜程度進(jìn)行明確的說(shuō)明，故本研究首先根據(jù)百合藥材富含淀粉且質(zhì)地比較致密、有一定黏性的特征，選擇了嫩蜜。即將生蜜加熱煮沸，直到溫度達(dá)到105～115 ℃，過(guò)濾去沫；其次，以薯蕷皂苷為對(duì)照，以百合皂苷得率和浸膏重量的綜合評(píng)價(jià)為指標(biāo)，通過(guò)對(duì)可能影響蜜炙百合炮制工藝的炒藥溫度、加蜜量和炒藥時(shí)間的三個(gè)單因素的考察，正交試驗(yàn)分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)這三個(gè)因素對(duì)其影響大小順序?yàn)槌此帨囟?>炒藥時(shí)間>加蜜量；最終優(yōu)選的工藝為：炒藥溫度120 ℃，炒藥時(shí)間9 min，加蜜量16 mL；此時(shí)百合浸膏重量為0.7058 g，百合皂苷得率為1.62 %，綜合評(píng)分為85.06，RSD均小于5%。

5 結(jié)論

研究通過(guò)單因素試驗(yàn)與正交試驗(yàn)相結(jié)合的方式優(yōu)選出了蜜炙鮮百合的炮制工藝。其炮制品，表面呈深黃色，偶有焦斑；用手摸之，略有黏性，但不黏手，并具有輔料蜜的香氣，味甜，符合蜜炙炮制品的特征。說(shuō)明本法可行，可用于鮮百合的蜜炙。這為鮮百合藥材的深加工及臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)，也為蜜炙其他類(lèi)中藥材提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。