趙詠梅, 李婷雨, 阮 倩

(西安文理學(xué)院 生物與環(huán)境工程學(xué)院，西安 710065)

植物的生長發(fā)育和光合作用都離不開磷元素，磷是植物體內(nèi)有機化合物的主要成分，是植物生長必需的營養(yǎng)元素之一。植物中的磷主要來源于土壤，然而，土壤中大部分的磷與Ca2+,Fe2+,Fe3+,Al3+結(jié)合形成難溶性磷酸鹽，致使植物無法直接利用[1]。據(jù)報道，我國有75%的耕地土壤缺磷，并且95%以上的磷為無效形式，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中就極易導(dǎo)致化肥過量施用，并且磷肥的當(dāng)季利用率僅為5%至25%，這使得土壤營養(yǎng)失調(diào)，土壤品質(zhì)性質(zhì)退化，農(nóng)作物產(chǎn)量降低，形成惡性循環(huán)。近年來，利用植物根際與磷循環(huán)相關(guān)的生物學(xué)系統(tǒng)來調(diào)節(jié)植物根際磷的有效性，特別是利用解磷微生物來活化土壤難溶性磷，已成提高土壤磷的有效性研究熱點。土壤中存在大量的具有解磷能力的微生物，能夠?qū)㈦y溶性的磷酸鹽如磷礦粉轉(zhuǎn)化為水溶性磷，提高土壤中的可溶性磷含量，從而改善植物磷素營養(yǎng)，提高作物產(chǎn)量[2]。所以，從土壤中分離具有解磷功效的菌株制備成微生物肥料，提高土壤對磷的利用率，具有重要的意義。筆者研究了從土壤中提取鑒定解磷菌株的過程，為開發(fā)新型微生物肥料提供了參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 樣本材料 西安文理學(xué)院附近地表以下10 cm取土樣各100 g，混勻，烘干，保藏于實驗室備用。

1.1.2 儀器 熒光顯微鏡(OLYMPUS-CX31)、超凈工作臺、電子天平、立式自動電熱壓力蒸汽滅菌器(LDZX-40Ⅱ型)、隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱(PYX-OHS-40X-0)、分光光度計、數(shù)顯恒溫水浴振蕩器(SHA-C)及常規(guī)實驗用具。

1.2 方法

1.2.1 培養(yǎng)基的制備 營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基：蛋白胨10 g，牛肉膏3 g，NaCl5 g，瓊脂15 g，加蒸餾水至1 000 mL，pH7.2-7.4，滅菌備用。

無機磷培養(yǎng)基：葡萄糖10 g，瓊脂20 g，NaCl 0.3 g，MgSO40.3 g，KCl0.3 g，MnSO4·4H2O 0.03 g，Ca3(PO4)212 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.03 g，(NH4)2SO40.5 g，加蒸餾水至1 000 mL,pH7.2，滅菌備用。

有機磷液體培養(yǎng)基(蒙金娜培養(yǎng)基)(g·L-1)：葡萄糖10.00 g，(NH4)2SO40.5g，MgSO4·7H2O 0.3 g，NaCl 0.3 g，KCl 0.3g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.03 g，MnSO4·H2O 0.03 g，CaCO35 g，加蒸餾水至1 000 mL，pH7.0～7.5，滅菌。將培養(yǎng)基融化冷卻至50°C后，立即加入蛋黃液(蛋黃液為0.8%無菌生理鹽水與雞蛋黃1∶1配制)，每100 mL的基礎(chǔ)培養(yǎng)基加卵黃稀釋液3～4 mL作為有機磷源，混勻后分裝于培養(yǎng)皿內(nèi)凝固。

1.2.2 菌種的初篩和純化 稱取10 g土樣過100目篩，置入90 mL無菌水中，于室溫?fù)u床上100 rpm搖動30 min,得10倍稀釋懸液；稀釋制備10-3，10-5倍土壤懸液；用無菌管分別吸取10，10-1，10-3，10-5倍稀釋土壤懸液各0.1 mL，置于無機磷平板培養(yǎng)基，在30℃下培養(yǎng)3～7 d后，對產(chǎn)生了溶磷圈的單菌落進(jìn)行分離純化；鏡檢并編號，4℃保藏備用。

1.2.3 透明圈法菌種的復(fù)篩 將初篩出來的菌株接種于無機磷固體培養(yǎng)基平板，置于28℃培養(yǎng)3 d，將產(chǎn)生透明圈的菌株用直尺測量溶磷圈直徑(D)和菌落直徑(d)，并根據(jù)是否產(chǎn)生溶磷圈以及D/d值得大小確定菌株的解磷能力。

1.2.4 鉬銻抗比色法測定RQ3-01菌株可溶性磷含量 將RQ3-01菌株以3%～6%的接種量接入150 mL液體磷發(fā)酵培養(yǎng)基，以空白種子液為對照，置于30℃、180 rpm培養(yǎng)5～7 d；再制備鉬銻貯存溶液、鉬銻抗顯色劑、5 mg·L-1磷標(biāo)準(zhǔn)溶液備用；按照鉬銻抗比色法繪制磷標(biāo)準(zhǔn)曲線。對RQ3-01菌株的可溶性磷含量進(jìn)行測定，以空白種子參比液調(diào)節(jié)儀器零點，進(jìn)行比色測定，讀取OD700nm吸光度,計算含量[3]。

1.2.5 RQ3-01菌株的形態(tài)學(xué)和生化鑒定 將篩選出來的菌株RQ3-01在營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上培養(yǎng)，觀察菌落生長特征，記錄其形狀、大小、顏色、透明度、邊緣特征等[4]；常規(guī)方法進(jìn)行革蘭氏染色，吖啶橙染色；直接將配置好的1%鹽酸四甲基對苯二胺滴加于被檢菌落上，采用菌落法進(jìn)行氧化酶試驗，觀察菌落的變化[5～7]。

1.2.6 RQ3-01菌株的分子生物學(xué)鑒定 將RQ3-01菌株送到上海生工生物工程股份有限公司進(jìn)行16SrDNA的擴增與測序。

2 結(jié)果

2.1 菌種的初篩和純化結(jié)果

通過在無機磷培養(yǎng)基上培養(yǎng)篩選出9株解無機磷能力比較強的菌株，分別為：RQ3-01、RQ1-01、RQ1-02、RQ2-02、RQ2-03、RQ3-02、RQ3-03、RQ4-01、RQ4-02。

2.2 菌種解磷能力的復(fù)篩和鑒定

用透明圈法進(jìn)行復(fù)篩，產(chǎn)生透明圈的菌株為解無機磷細(xì)菌，用直尺測量溶磷圈直徑(D)和菌落直徑(d),計算9株菌株的D/d值大小，結(jié)果如表1所示，RQ3-01菌株溶磷圈最大，D/d值達(dá)到1.78，故其解無機磷能力最強。

表1 透明圈法測定各種菌株的解磷能力

2.3 RQ3-01菌株的可溶性磷含量測定

用鉬銻抗比色法測定RQ3-01菌株的可溶性磷含量，確定其解無機磷能力。繪制的磷標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1和圖2，得到公式y(tǒng)=0.5731x(R2=0.9992)，y=0.5417x(R2=0.9958)，計算出發(fā)酵液中的有效磷含量。與磷標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行對照分析可知，RQ3-01菌株解無機磷能力達(dá)到22.313 mg·L-1，有機磷能力達(dá)到：20.266 mg·L-1。

圖1 無機磷標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.4 RQ3-01菌株的形態(tài)學(xué)和生化鑒定結(jié)果

RQ3-01菌株在無機磷培養(yǎng)基上呈白色，黏稠狀，菌落周圍有透明圈，形狀不規(guī)則，邊緣平滑。革蘭氏染色后RQ3-01菌株為紅色，為革蘭氏陰性菌。經(jīng)過吖啶橙染色在熒光顯微鏡下可以觀察到RQ3-01菌株為無核細(xì)菌，呈桿狀，不形成芽孢，分泌黃綠色熒光色素并發(fā)出熒光。氧化酶試驗中菌株由白色變?yōu)樽仙?，呈陽性?/p>

圖2 有機磷標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖3 RQ3-01菌株在熒光顯微鏡(40x)下的形態(tài)

2.5 RQ3-01菌株的分子生物學(xué)鑒定

對RQ3-01菌株進(jìn)行16SrDNA的擴增和測序，檢測表明其堿基對為1391bp(圖4)；經(jīng)核糖體數(shù)據(jù)庫比對顯示，RQ3-01菌株與熒光假單胞菌相似度為100%。故RQ3-01菌株是熒光假單胞菌。

圖4 RQ3-01菌株的測序結(jié)果

3 討論

土壤中的微生物是土壤肥力的核心，其不僅數(shù)量巨大，且種類極多，部分種類對土壤氮、磷和鉀等養(yǎng)分的轉(zhuǎn)化和供給起到非常重要的作用。因此，對土壤中解鉀菌、解磷菌和固氮菌的研究越來越得到學(xué)者們的重視。實驗經(jīng)過多級篩選從土壤中分離得到熒光假單胞菌RQ3-01，其解無機磷和有機磷能力分別達(dá)到22.313 mg·L-1和20.266 mg·L-1，實驗證明，RQ3-01有較強的無機和有機磷耐受力。

在已知的植物根際有益微生物中，熒光假單胞菌是種群數(shù)量較多的細(xì)菌種類之一。研究表明，熒光假單胞菌營養(yǎng)需要相對簡單，能夠利用植物根系分泌物中的營養(yǎng)迅速定殖，其菌劑對多種植物病原菌有很強的拮抗作用，具有繁殖速度快，適應(yīng)能力強，易于人工培養(yǎng)等優(yōu)點，更適合現(xiàn)代社會對農(nóng)業(yè)生產(chǎn)及有害生物防治的需求[8～9]。本實驗分離得到的熒光假單胞菌RQ3-01，不僅本身具有繁殖速度快，適應(yīng)能力強，易于人工培養(yǎng)等優(yōu)點，且具有良好的解磷效果，但其對有機磷農(nóng)藥的耐受性和其遺傳穩(wěn)定性有待作更深入的研究。