竇銀花 田懷香 鄭小平

摘要 [目的]優(yōu)化河蝦中4種硝基呋喃的前處理方法。[方法]以標準方法中37℃的衍生溫度下衍生17.0 h為對照，優(yōu)化衍生溫度和衍生時間，在陰性河蝦中加入酸性提取液和衍生試劑2-硝基苯甲醛。[結果]在80℃的衍生溫度下衍生2.0 h，提取效率和標準方法接近，反復試驗6次，相對標準偏差都小于10%，除了呋喃妥因（AHD）響應偏小，相對偏差值較大。4種硝基呋喃代謝物的檢出限為0.25 μg/kg，定量限為0.50 μg/kg，在標準曲線范圍內(nèi)線性良好，3個水平的回收率在90%～110%。[結論]該方法簡單、快速、準確、可重復且靈敏，可以滿足河蝦中硝基呋喃殘留量的監(jiān)測要求。

關鍵詞 硝基呋喃代謝物;河蝦;衍生溫度;衍生時間;前處理方法;優(yōu)化

中圖分類號 TS254.7文獻標識碼 A

文章編號 0517-6611（2021）02-0189-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2021.02.051

開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

Optimization of Pretreatment Detection Methods for Four Nitrofurans in Shrimp

DOU Yinhua1，TIAN Huaixiang2，ZHENG Xiaoping1 （1.Shanghai Bino Testing Technology Service Co.，Ltd.，Shanghai 200101;2.Shanghai Institute of Technology，Shanghai 201418）

Abstract [Objective] To optimize the pretreatment methods of 4 kinds of nitrofurans in river shrimp.[Method]Taking the derivatization temperature of 37℃ in the standard method for 17.0 h as the control，the derivative temperature and time were optimized.Acid extract and derivative reagent 2nitrobenzaldehyde were added to the negative shrimp.[Result] The derivative temperature was 80℃ and the derivative time was 2.0 h， the extraction efficiency was close to the standard method，and the relative standard deviation was less than 10% after 6 times of repeated experiments，except that the response of nitrofurantoin （AHD） was smaller and the relative deviation was larger.At the same time，the experiment found that the detection limit of the four nitrofuran metabolites was 0.25 μg/kg，and the limit of quantification was 0.50 μg/kg，the linearity was good in the range of standard curve，and the recoveries of three levels were between 90% and 110%.[Conclusion]The method has the advantages of simple and fast operation，accurate results，good repeatability and high sensitivity，and can meet the monitoring requirements of nitrofuran drugs in shrimp.

Key words Nitrofuran metabolites; Shrimp; Derivative temperature; Derivative time;Pretreatment method;Optimization

硝基呋喃類藥物對大多數(shù)革蘭氏菌、真菌和原蟲等病原體均有預防和控制的作用，是一種合成型廣譜抗生素，生產(chǎn)成本低、藥效顯著、耐藥性差、應用廣泛，大量用于河蝦和畜牧業(yè)[1-3]。硝基呋喃代謝物主要包括呋喃唑酮（AOZ）、呋喃它酮（AMOZ）、呋喃妥因（AHD）、呋喃西林（SEM），是一類帶有5-硝基呋喃環(huán)結構化合物[4-5]，長期食用此類藥物，會誘導有機體發(fā)生突變和癌變[6-7]。從21世紀初開始，中華人民共和國農(nóng)業(yè)部公告第235號明確規(guī)定動物食品中獸藥的最大殘留限量，禁止在動物食品中檢出硝基呋喃類獸藥[8-9]。 歐盟和亞洲等許多國家也規(guī)定，硝基呋喃代謝產(chǎn)物在動物食品中不得檢出。

截至目前，硝基呋喃代謝物的檢測方法有酶聯(lián)免疫吸附分析技術（ELISA）[10]、免疫膠體金技術（GICT）[11]、快速檢測法-酶聯(lián)免疫法[12]、光譜分析法-分光光度法[13]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（LC-MS/MS）[14]，其中液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法應用最為廣泛，并制定了相關方法的測定標準。該研究通過優(yōu)化樣品前處理方法，包括提高衍生溫度、縮短衍生時間，建立了硝基呋喃代謝物的殘留檢測方法，并將3種不同濃度的硝基呋喃代謝物添加到河蝦空白樣品中，為測定河蝦中的硝基呋喃代謝產(chǎn)物提供快速、高效和準確的方法[15]。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 儀器。安捷倫1290-6470超高壓液相色譜-三重四級桿串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀（Agilent ），配備大氣壓電噴霧電離源（ESI）; 電子天平（梅特勒-托利多）;渦旋振蕩器（TALBOYS）;高速勻漿機（FLUKO）;高溫恒溫干燥箱（上海一恒科學儀器有限公司）。

1.1.2 試材。乙腈、乙酸乙酯和正己烷均為色譜純。 鹽酸、二甲基亞砜、2-硝基苯甲醛、磷酸二氫鉀和氫氧化鈉均為優(yōu)級純，試驗前稱取75.0 mg 2-硝基苯甲醛溶于5 mL 二甲亞砜中，現(xiàn)配現(xiàn)用;實驗室水取自PURELAB超純水儀。

標準品包括氨基脲（SEM）、5-甲基嗎琳-3-氨基-2-惡唑烷基酮（AMOZ）、3-氨基-2-噁唑烷基酮（AOZ）和1-氨基-乙丙酰脲（AHD），均為德國 Dr.Ehrenstorfer 公司產(chǎn)品，純度≥99%。內(nèi)標物包括5-甲基嗎啉-3-氨基-2-噁唑烷基酮的同位素內(nèi)標物 （AMOZ-D5）、1-氨基-2-內(nèi)酰脲的同位素內(nèi)標物 （AHD-13C3）、3-氨基-2-噁唑烷基酮的同位素內(nèi)標物 （AOZ-D4）、氨基脲的同位素內(nèi)標物 （SEM-13C15N2），均為德國 Witega 公司產(chǎn)品，純度≥99%。樣品河蝦購自超市。

1.2 試驗方法

1.2.1 樣品前處理。

于50 mL離心管中稱入2.00 g樣品，加入4種硝基呋喃內(nèi)標，加入10 mL萃取溶液 0.2 mol/L鹽酸勻漿，加入150 μL 衍生試劑2-硝基苯甲醛，并充分振蕩。在恒溫干燥箱中，將溫度分別設置為37、60、70、80和90℃，并將衍生時間分別設置為1、2、3、4、5和17 h，其中只有37℃時的衍生物需衍生17 h[15]。取出離心管，冷卻至室溫，加入適量的磷酸氫二鉀，充分混合，加入15 mL 乙酸乙酯，渦旋振蕩2 min后，然后在-4.0 ℃時，于10 000 r/min的轉(zhuǎn)速下離心 3 min 后，取出乙酸乙酯至另一個50 mL 離心管中，再重復提取一次，合并上層乙酸乙酯，在50℃下氮吹至近干，加入乙腈和水（1+9）1.0 mL復溶，過0.22 μm 濾膜上機待測。

1.2.2 標準曲線溶液的配制。

將100 ng/mL混合標準溶液分別準確地移取100、200、500 μL到3個50 mL離心管中，將10 ng/mL混合標準溶液分別準確地移取50、100、500 μL到3個50 mL離心管中，并添加50 μL、100 ng/mL的混合內(nèi)標溶液到6個離心管中。同樣品一起衍生，標準曲線的工作濃度分別為0.5、1.0、5.0、10.0、20.0、50.0 ng/mL，內(nèi)標濃度為5.0 ng/mL。

1.2.3 儀器條件。

液相條件：色譜柱為Poroshell 120（3.0 mm×100 mm，2.7 μm）;流動相為乙腈和2.0 mmol/L乙酸銨甲酸水溶液（含0.1%甲酸）;進樣量為5.0 μL。梯度洗脫條件如表1所示。質(zhì)譜參數(shù)（ESI）：干燥氣溫度350℃，干燥氣流量為10.0 mL/min，毛細管電壓3 500 V，MRM多反應監(jiān)測，具體參數(shù)見表2。

1.2.4 回收率的測定。

4種硝基呋喃代謝物設置1.0、2.0、5.0 ng/mL 3個添加水平，按照“1.2.1”方法預處理樣品，通過“1.2.3”儀器條件檢測，并由峰面積來定量，算出回收率和標準偏差。

2 結果與分析

2.1 質(zhì)譜條件優(yōu)化 將4種濃度為10 ng/mL的硝基呋喃代謝物于37℃恒溫干燥箱中衍生17 h后進行測定，只有在較高濃度條件下優(yōu)化目標藥物的質(zhì)譜條件，目標化合物才有較高的響應值。根據(jù)農(nóng)業(yè)部783號公告-1-2006《河蝦中硝基呋喃代謝物殘留量的測定 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法》中給出的定量離子和定性離子，優(yōu)化了傳輸電壓和碰撞能量，確定最佳質(zhì)譜條件見表2，標準工作液的質(zhì)譜圖見圖1。

2.2 色譜條件優(yōu)化 試驗表明，甲酸在正離子模式下可以提高離子化效率，但峰形不對稱，會拖尾，在流動相中加入乙酸銨緩沖鹽，可以改善峰形，提高了化合物在C18柱上的保留效果，從而提高了化合物的響應值和靈敏度，所以水相采用2.0 mmol/L 乙酸銨甲酸水溶液（含0.1%甲酸）。試驗表明，與甲醇相比，乙腈作為有機相時峰形較對稱尖銳，靈敏度更高。

對各物質(zhì)的峰形和響應值會產(chǎn)生影響的還有流速和洗脫梯度。 調(diào)整流動相的洗脫程序和改變流速，觀察峰形和響應值的變化。試驗表明在0.4 mL/min的流速下，使用表1中的洗脫梯度，具有理想的峰形，無拖尾和良好的對稱性。4種硝基呋喃代謝物保留時間均在4 min之內(nèi)（圖2），且將乙腈比例調(diào)至95%，并保持1 min，將殘留在色譜柱中的樣品雜質(zhì)沖洗干凈，使得保持儀器的靈敏度，降低儀器的信噪比、保證保留時間的重現(xiàn)性好，再將流動相比例恢復至初始化比例，提高靈敏度，降低噪音。

2.3 前處理方法的優(yōu)化

河蝦中蛋白質(zhì)和脂肪含量較高，衍生時加入過量的鹽酸，不僅提供有利的衍生環(huán)境，還能提高水解速率，釋放出脂肪中的目標物，也利于提高衍生效率。衍生試劑的量太少，衍生不完全，衍生試劑的量太多，導致浪費，添加150 μL的衍生試劑不僅可以使反應充分，還可以節(jié)省成本。加入適量的磷酸氫二鉀緩沖鹽，可以中和多余的鹽酸，調(diào)節(jié)pH至中性偏堿，不用精確調(diào)節(jié)每個樣品的酸堿度，大大提高大批量樣品處理的效率。冷凍離心，取上層乙酸乙酯吹干，既可以不用有機溶劑，保護環(huán)境，也可以節(jié)約成本，提高效率。

試驗研究了衍生化的時間和溫度與硝基呋喃代謝物響應值之間的變化關系。以37℃恒溫衍生17 h為對照，比較了其他幾種溫度和時間下的衍生效果，結果表明（表3），4種代謝物的響應值隨著溫度增加和時間延長而增大，在80℃ 下衍生2 h時的響應值和37℃下衍生17 h時的響應值接近，在80℃的衍生溫度下衍生更長時間響應變化不大，或在90℃的衍生溫度下衍生2 h或更長時間響應值不變或略微下降。因此，選擇在80℃恒溫下反應2 h作為河蝦中硝基呋喃代謝物的衍生條件。

2.4 方法驗證

2.4.1 方法的線性關系、檢出限和定量限。根據(jù)上述“1.2.2”方法，采用內(nèi)標法進行定量分析，繪制標準曲線并進行線性回歸分析，結果見表4。將4種待測組分分別添加到空白試劑和陰性河蝦中，信噪比（S/N）為3時計算檢出限，S/N為10時計算定量限，從表4可以看出，4種硝基呋喃代謝物線性相關性較好，檢出限為0.25 μg/kg，定量限為0.50 μg/kg。

2.4.2 回收率和精密度。

向陰性的河蝦中加入標準物測定回收率和精密度，樣品前處理與“1.2.1”相同。加入1.0、2.0、5.0 ng/mL的含量，重復試驗6次，然后計算加標回收率和RSD，結果見表5。從表5可以看出，3個水平的添加回收率在90.2%～109.2%，RSD在1.2%～7.6%。因此該方法滿足4種硝基呋喃代謝物在河蝦中殘留量的測定。

3 結論

該試驗優(yōu)化了河蝦中4種硝基呋喃代謝物的前處理方法。通過對衍生時間和衍生溫度的優(yōu)化，確定在80℃溫度下衍生2 h，也能達到檢測方法要求，同時確定和驗證該方法的檢出限為0.25 μg/kg，定量限為0.50 μg/kg ，在0.50～50.00 ng/mL 范圍內(nèi)線性關系好，回收率高，相對標準偏差小。該方法具有快速、方便、準確、高效、回收率高、重復性好的優(yōu)勢，大大地縮短了前處理時間，提高工作效率，降低檢驗成本，又可以對河蝦中4種硝基呋喃代謝物進行精準的定性和定量，滿足河蝦中硝基呋喃代謝物殘留量的監(jiān)控要求，保障食品安全，守住食品安全的最后一道防線。

參考文獻

[1]

宋興興.LC-MS/MS法檢測雞肉中硝基呋喃類代謝物的殘留量[J].食品工業(yè)，2019，40（1）：308-310.

[2] 王傳現(xiàn)，黃帆，王敏，等.液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測水產(chǎn)品中殘留的硝基呋喃類藥物的代謝物[J].色譜，2013，31（3）：206-210.

[3] 馬駿，羅華明，張玲茜.液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜測定水產(chǎn)品中硝基呋喃類代謝物殘留[J].浙江農(nóng)業(yè)科學，2016，57（4）：558-562，610.

[4] 鄭百芹，宋蓀陽，張建民，等.液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測定水產(chǎn)品中硝基呋喃類代謝物殘留量[J].食品工業(yè)，2014，35（2）：230-233.

[5] 蒙君麗，周鑫，鄭百芹，等.UPLC-MS/MS檢測牛奶中硝基呋喃類代謝物殘留[J].食品工業(yè)，2016，37（7）：278-280.

[6] LI Z H，LI Z M，XU D K.Simultaneous detection of four nitrofuran metabolites in honey by using a visualized microarray screen assay[J].Food Chem，2017，221：1813-1821.

[7] 陳煜玲，陳劍元，區(qū)麗華.LC-MS法快速檢測動物源性食品中硝基呋喃類代謝物[J].廣東化工，2017，44（20）：46-48.

[8] 楊婷婷，易路遙，熊雯，等.QuEChERS-四極桿飛行時間串聯(lián)質(zhì)譜法測定7種蛋及蛋制品中硝基呋喃代謝物殘留的基質(zhì)效應[J].肉類工業(yè)，2018（4）：45-50.

[9] 高月明，馮笑軍，李倩瑩.超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定淡水魚中硝基呋喃類代謝物殘留[J].食品安全質(zhì)量檢測學報，2017，8（8）：3231-3236.

[10] 葛懷禮，蒙君麗，宋蓀陽，等.酶聯(lián)免疫法測定水產(chǎn)品中呋喃唑酮代謝物殘留量[J].河北漁業(yè)，2014（8）：25-27，32.

[11] 董雪，王麗雯，袁建，等.雞蛋中呋喃唑酮代謝物金標試紙條快速分析[J].生物加工過程，2018，16（2）：69-73.

[12] 蔣宏偉.酶聯(lián)免疫技術在動物產(chǎn)品中硝基呋喃類藥物殘留檢測的應用[J].陜西農(nóng)業(yè)科學，2006，52（5）：53-55.

[13] 景立新，孫武平，楊欽德，等.分光光度法快速測定海蝦中呋喃唑酮殘留量[J].光譜實驗室，2006，23（3）：547-550.

[14] 徐英江，任傳博，田秀慧，等.海產(chǎn)品中硝基呋喃類原藥的超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜測定[J].分析測試學報，2010，29（4）：327-330，335.

[15] 成強，陳京都，吳紅軍，等.超高壓液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定漁業(yè)養(yǎng)殖環(huán)境中硝基呋喃代謝物[J].中國漁業(yè)質(zhì)量與標準，2016，6（4）：37-43.