徐 鵬，趙建珍，閆偉偉，陳佳琛，羅慧玉，劉 慧

（張家口市食品藥品檢驗中心，河北張家口 075000）

蔬菜在種植生長過程中容易受到病蟲、雜草的影響，因此，為了提高產(chǎn)品產(chǎn)量和質(zhì)量，農(nóng)藥的使用不可避免[1]。近年來，農(nóng)藥殘留問題成為最受關注的食品安全問題之一，世界主要國家和組織都規(guī)定了多種農(nóng)藥的最大殘留限量以保證消費者的身體健康[2-3]。為了監(jiān)控蔬菜中的農(nóng)藥殘留，我國在GB 2763-2019《食品安全國家標準 食品中農(nóng)藥最大殘留限量》[4]中全文規(guī)定了食品中483種農(nóng)藥7107項最大殘留限量，該標準大大豐富了農(nóng)藥殘留的涵蓋范圍，對規(guī)范農(nóng)藥的使用發(fā)揮了積極作用。

甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑是一類廣譜、高效、促生的新型仿生型殺菌劑，對子囊菌綱、半知菌綱和卵菌綱等真菌引起的病害有高效的殺菌活性，被大量用于防治果蔬病害，已成為繼苯丙咪唑類和三唑類殺菌劑之后極具市場的一類殺菌劑[5-6]。從近幾年全球甲氧基丙烯酸酯類農(nóng)藥的銷售額以及農(nóng)藥單位面積施用量來看，排在前三位的藥物分別為嘧菌酯、吡唑醚菌酯以及肟菌酯[7]。目前蔬菜中農(nóng)藥殘留檢測的樣品前處理方法有固相萃取法[8]、固相微萃取法[9]、QuEChERS方法[10-12]、GPC法等，其中QuEChERS方法相對固相萃取、固相微萃取、GPC等方法具有快速、簡單、廉價、有效、可靠、安全等特點。關于甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑的殘留檢測方法有氣相色譜法、氣相色譜-質(zhì)譜法和液相色譜-質(zhì)譜法[13-18]。GB23200.54-2016也使用氣相色譜-質(zhì)譜法測定了11種甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑[19]。但該方法前處理采用GPC提取凈化，前處理時間較長，有機溶劑使用量大，成本高，環(huán)境不友好，不適合大批量樣品的定性和定量分析。

本研究以QuEChERS前處理方法為基礎，通過正交試驗優(yōu)選N-丙基乙二胺（PSA）、C18以及石墨化炭黑（GCB）的組合用量，既達到良好的凈化效果，又保證目標化合物的較高提取效率，同時結(jié)合UPLC-MS/MS建立一種簡單、快速、靈敏度較高的檢測蔬菜中9種甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑的方法，以期為評估蔬菜中甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑的殘留量提供可靠的技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

蔬菜樣品 25批，結(jié)球甘藍6批、芹菜5批、土豆6批、菠菜4批、甜椒4批 均購自本地超市；甲酸、乙腈 HPLC級，賽默飛世爾科技有限公司；N-丙基乙二胺（PSA，40～60 mm）、C18（40 mm）、石墨化碳黑（GCB，38～120 μm） 天津博納艾杰爾科技公司；9種甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑標準品（純度均大于99%） 德國Dr. Ehrenstorfer公司。

LC-30AD超高效液相色譜儀 日本島津公司；SCIEX Triple QuadTM5500質(zhì)譜聯(lián)用儀 美國AB SCIEX；Shim-PackC18色譜柱（2.1 mm×50 mm，2 μm）日本島津公司；MEGAFUGE-8R型高速冷凍離心機 美國Thermo Fisher公司；LPVERTEXMIXERG-4KT18003型漩渦振蕩器 上海一恒科學儀器有限公司；HSC-B型氮吹濃縮儀 天津恒奧科技發(fā)展有限公司；CPA225D精密分析電子天平 德國賽多利斯公司；移液器 美國Thermo Fisher公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 標準溶液的配制 分別準確稱取9種甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑標準品各10.0 mg，用乙腈定容至100 mL，配制成濃度均為100 μg/mL的儲備液，密封后避光儲存于4 ℃冰箱中，備用。

1.2.2 樣品的制備、提取和凈化 取蔬菜樣品，切碎，用搗碎機搗碎成漿狀，混勻，裝入樣品袋，標記，密封備用。準確稱取樣品10 g（精確至0.001 g），置于50 mL離心管中，加入10 mL乙腈、4 g硫酸鎂、1 g氯化鈉、1 g檸檬酸鈉、0.5 g檸檬酸氫二鈉，立即旋渦混勻1 min后超聲提取10 min，以8000 r/min離心10 min，取5 mL上清液于含有900 mg硫酸鎂，200 mg PSA，150 mg C18，15 mg石墨化炭黑的15 mL離心管中，漩渦凈化1 min后以5000 r/min離心5 min，取上清液過0.22 μm微孔濾膜，待上機測定。

1.2.3 超高效液相色譜-質(zhì)譜條件 超高效液相色譜：島津Shim-PackC18色譜柱（2.1 mm × 50 mm，2 μm）；柱溫：40 ℃；進樣體積：2 μL；流速：0.3 mL/min；流動相A為0.05%（v/v）甲酸水溶液，流動相B為0.05%（v/v）甲酸乙腈溶液；梯度洗脫程序：0～0.9 min，5%B；1～10.9 min，95%B；11～12.5 min，95%B；12.6～13 min，5%B。

質(zhì)譜條件：離子源：電噴霧離子源（electron spray ionization，ESI）；監(jiān)測掃描方式：多反應監(jiān)測模式（multiple reaction monitoring mode，MRM），掃描模式：正離子掃描；離子源溫度：600 ℃；噴霧電壓為5500 V；氣簾氣、霧化氣、碰撞氣和輔助氣均為氮氣；壓力分別為35、8、55、50 Psi。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用統(tǒng)計軟件SPSS 24.0和AB5500超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀配備的定量分析軟件對檢測結(jié)果進行數(shù)據(jù)處理分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 超高效液相色譜-質(zhì)譜條件的優(yōu)化

2.1.1 超高效液相色譜條件優(yōu)化 本實驗比較了水-甲醇、水-乙腈、0.1%甲酸水-乙腈和0.05%甲酸水-0.05%甲酸乙腈做為流動相洗脫系統(tǒng)時，對各目標化合物的分離效果的影響。結(jié)果顯示在正離子掃描模式下，當流動相系統(tǒng)為0.1%甲酸水-乙腈和0.05%甲酸水-0.05%甲酸乙腈時，各目標化合物分離效果及響應值較好；而當選取0.05%甲酸水-0.05%甲酸乙腈做為流動相時，在梯度洗脫過程中，流動相系統(tǒng)pH變化相對較小，同時因為甲酸的作用，增加了正離子目標化合物的響應值，改善了峰型，故選用0.05%甲酸水-0.05%甲酸乙腈作為流動相。9種甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑混和標準品溶液總離子流圖如圖1所示。

2.1.2 質(zhì)譜條件優(yōu)化 在質(zhì)譜模式下，采用針泵進樣，對每種目標化合物單一標準溶液進行一級質(zhì)譜全掃描，確定各分子離子，然后以分子離子為母離子進行二級質(zhì)譜全掃描，選擇質(zhì)荷比較大、強度較高、干擾較小的兩個離子分別作為子離子，其中強度較高的子離子作為定量離子，并優(yōu)化各目標化合物的分子離子和子離子所需的最佳去簇電壓和碰撞能量。質(zhì)譜參數(shù)見表1。

圖1 9種甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑標準物質(zhì)離子流色譜圖Fig.1 Ion current chromatogram of 9 strobilurin fungicides standard solution

表1 9種甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑質(zhì)譜檢測參數(shù)Table 1 Mass spectrum parameters of 9 strobilurin fungicides

2.2 凈化條件優(yōu)化單因素實驗

蔬菜中含有大量的葉綠素、葉黃素等天然色素，不僅會影響被測化合物的峰型產(chǎn)生基質(zhì)干擾，也會影響儀器的使用壽命，因此有效地去除天然色素是蔬菜樣品前處理過程中的重要環(huán)節(jié)。目前，QuEChERS方法的吸附凈化劑主要包括：PSA、C18和石墨化炭黑[20]。PSA可有效去除極性色素、有機酸、脂肪酸以及一些糖類物質(zhì)的干擾，同時能起到螯合劑的作用。C18可去除一些非極性干擾物，如花青素、酯類等。而石墨化炭黑可有效去除天然色素，但由于其平面六元環(huán)狀片層結(jié)構(gòu)，會對一些平面及對稱結(jié)構(gòu)的物質(zhì)產(chǎn)生吸附作用，故石墨化炭黑的用量成為去除色素和提高回收率的關鍵[21]。本文以結(jié)球甘藍作為研究對象，選取無水硫酸鎂900 mg，分別對石墨化炭黑、PSA和C18的加入量進行單因素實驗，以空白基質(zhì)加標回收率為指標，選取最佳的試劑使用量。當固定PSA為100 mg與C18為100 mg時，考察石墨化碳黑用量，結(jié)果如圖2所示：九種化合物加標回收率在石墨化炭黑加入量為15 mg時均出現(xiàn)最大值；在固定石墨化炭黑為15 mg，C18為100 mg時，考察PSA用量，結(jié)果如圖3所示：嘧菌酯等七種化合物在PSA加入量為200 mg時出現(xiàn)最大值，而E -苯氧菌酯和肟醚菌胺加標回收率在PSA加入量為250 mg時出現(xiàn)最大值，但其回收率與200 mg相比變化不大，考慮到節(jié)省資源，減少污染，故最終確定PSA加入量為200 mg為最佳單因素實驗條件；在固定石墨化炭黑為15 mg，PSA加入量為200 mg后考察C18的最佳加入量，試驗結(jié)果如圖4所示：除嘧螨酯外其余八種化合物加標回收率均在C18的加入量為200 mg時達到最佳，而嘧螨酯在150和200 mg時加標回收率變化不是很明顯，綜合考慮確定最佳單因素實驗條件為加入C18200 mg。

2.3 正交試驗優(yōu)化吸附凈化劑的用量

正交試驗可在單因素實驗的基礎上，綜合有效地評估各凈化吸附劑之間的交互作用的大小，優(yōu)化吸附劑用量，提高回收率[22]。本試驗以結(jié)球甘藍空白基質(zhì)加標回收率為指標，對石墨化炭黑添加量（A）、C18添加量（B）、PSA添加量（C）3個因素進行考察，各因素均確定3個水平，因素與水平見表2，正交試驗結(jié)果見表3。由表3可知，Z-苯氧菌酯的最優(yōu)凈化組合為A3B3C3；吡唑醚菌酯的最優(yōu)凈化組合為A2B1C3；其余七種化合物的最優(yōu)凈化條件均為A2B1C2，故綜合考慮，確定最優(yōu)凈化組合為A2B1C2，即凈化劑的配比為石墨化炭黑的質(zhì)量為15 mg，C18的質(zhì)量為150 mg，PSA的質(zhì)量為200 mg。

圖2 石墨化炭黑添加量對加標回收率的影響Fig.2 Effect of GCB addition on recovery rate of standard addition

圖3 PSA添加量對加標回收率的影響Fig.3 Effect of PSA addition on recovery rate of standard addition

2.4 基質(zhì)效應

基質(zhì)效應（ME）指樣品處理過程中除目標化合物外，其他組分對定量分析準確性和重現(xiàn)性的影響[23]。本研究采用提取后加入法和絕對基質(zhì)相應法來評價基質(zhì)效應[24-25]，通過測定各目標化合物在基質(zhì)匹配校準溶液中的斜率Km及其在溶劑校準曲線中的斜率K采用公式：

當0＜ME≤20%時，為弱基質(zhì)效應，當20%＜ME≤50%時，為中等基質(zhì)效應，當ME＞50%時，為強基質(zhì)效應。由于不同蔬菜基質(zhì)不同，因此可能呈現(xiàn)不同的基質(zhì)效應。本試驗選擇蕓薹屬類蔬菜中的結(jié)球甘藍，葉菜類蔬菜中的芹菜、菠菜，茄果類蔬菜中的甜椒，根莖類蔬菜中的土豆為代表物，對待測物的基質(zhì)效應做進一步評價。參照1.2.2中樣品提取和凈化條件，分別提取空白基質(zhì)溶液。用丙酮和空白基質(zhì)溶液分別配制相同濃度的工作液，照1.2.3中的條件進行分析測定。以濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標，繪制基質(zhì)匹配校準曲線和溶劑校準曲線，并計算基質(zhì)效應。結(jié)果表明對于五種蔬菜，9種目標化合物的基質(zhì)效應均在0.48%～10.32%之間，見表4，表明本方法抗基質(zhì)干擾能力強，具有良好的適用性。

圖4 C18添加量對加標回收率的影響Fig.4 Effect of C18 addition on recovery rate of standard addition

表2 正交試驗因素水平表Table 2 Factors and levels table of orthogonal experiment

表3 L9（34）正交試驗設計與結(jié)果Table 3 L9 (34) Design and results of orthogonal test

2.5 方法的線性范圍和檢出限

采用優(yōu)化后的提取和凈化方法，將配制的工作液用處理后的空白結(jié)球甘藍基質(zhì)逐級稀釋，配制成系列曲線工作液（1、5、10、30、50、80、100 ng/mL）。以濃度為橫坐標，相應的峰面積為縱坐標，繪制基質(zhì)匹配校準曲線，如表5所示。9種殺菌劑在1～100 ng/mL范圍內(nèi)線性關系良好，決定系數(shù)（R2）為0.9942～0.9995。在空白結(jié)球甘藍基質(zhì)樣品中進行低濃度加標試驗，直到目標化合物濃度添加量至信噪比為3和10，獲得方法檢出限（LOD）為0.05～0.3 μg/kg，定量限（LOQ）0.2～0.9 μg/kg。

表4 五種蔬菜基質(zhì)中目標化合物的基質(zhì)效應Table 4 Matrix effects of target compounds in five vegetable matrices

表5 9種化合物線性方程，決定系數(shù)（R2），檢出限（LOD）和定量限（LOQ）Table 5 Linear equations, coefficient of determination (R2)，LODs and LOQs of 9 compounds

表6 平均回收率和平均相對標準偏差(n=7)Table 6 Average recovery rates and RSDs (n=7)

2.6 加標回收率和精密度

以空白基質(zhì)加標回收率表示方法的準確度，以回收率的相對標準偏差（RSD）表示方法的精密度。從市場采集多份蔬菜樣品，用建立的方法篩選未檢出9種目標化合物的結(jié)球甘藍、芹菜、土豆、菠菜和甜椒為空白基質(zhì)，選擇三個不同添加水平測定，按1.2.2條件進行樣品制備，按1.2.3條件分析測定，并將峰面積帶入工作曲線方程計算回收率和相對標準偏差。如表6所示，在2、10和20 μg/kg三個添加水平下，五種蔬菜的空白基質(zhì)加標回收率在77.26%～111.73%之間，相對標準偏差在0.46%～6.59%之間。

2.7 實際樣品測定

參照1.2.2樣品制備、提取和凈化的方法，對市售的25批蔬菜（結(jié)球甘藍6批、芹菜5批、土豆6批、菠菜4批、甜椒4批）進行了檢測，未發(fā)現(xiàn)相關甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑。

3 結(jié)論

本文通過正交試驗優(yōu)選QuEChERS最佳提取凈化劑組合，并分析了基質(zhì)效應對目標化合物的影響。確定以石墨化炭黑的質(zhì)量為15 mg，C18的質(zhì)量為150 mg，PSA的質(zhì)量為200 mg為最佳提取凈化劑組合，結(jié)合超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（UPLCMS/MS）方法檢測，建立了蔬菜中9種甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑殘留量的測定方法。使用本方法對市售蔬菜進行檢測，未檢出相關甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑。該方法操作簡單、快速、成本低廉，具有較好的準確度、靈敏度和精密度，減少了有機溶劑的使用，同時降低了方法檢出限和定量限，為蔬菜中甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑殘留的快速篩查和定量分析檢測提供了可靠的技術(shù)支持。