譚 莉，孟繁磊，范 宏，ANNA Nowacka，魏春雁,

（1.吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測(cè)技術(shù)研究所/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估實(shí)驗(yàn)室（長(zhǎng)春），吉林長(zhǎng)春 130033；2.波蘭國(guó)立植物保護(hù)研究所，波茲南 60-318）

真菌毒素（Mycotoxin）又稱(chēng)霉菌毒素，是真菌在適宜的環(huán)境條件下產(chǎn)生的有毒次級(jí)代謝產(chǎn)物[1]，糧食在生長(zhǎng)期、收獲期和儲(chǔ)存期都可能被真菌毒素污染，直接或間接進(jìn)入人類(lèi)食物鏈中，威脅人類(lèi)健康[2-3]。黃曲霉毒素（Aflatoxins，AFT）是迄今發(fā)現(xiàn)的毒性最強(qiáng)的一類(lèi)真菌毒素，主要由黃曲霉和寄生曲霉產(chǎn)生，AFTB1、AFTB2、AFTG1和AFTG2四種是其重要的代表性成分，其中，AFTB1的毒性最強(qiáng)[4]。伏馬毒素（Fumonisins, FB）主要是由串珠鐮刀菌屬真菌產(chǎn)生的一類(lèi)強(qiáng)毒和致癌性的真菌毒素，F(xiàn)B1、FB2、FB3是其代表性成分，其中，毒性最強(qiáng)的FB1是其主要成分[5]。嘔吐毒素（又名脫氧雪腐鐮刀菌烯醇Deoxynivalenol, DON）和玉米赤霉烯酮（Zearalenone，ZEN）主要由鐮刀菌屬真菌產(chǎn)生，是目前為止對(duì)糧食污染最普遍的毒素[6-7]。真菌毒素污染是全球性問(wèn)題，有研究對(duì)來(lái)自全球72個(gè)國(guó)家的18757個(gè)農(nóng)產(chǎn)品樣品進(jìn)行篩查，發(fā)現(xiàn)部分樣品受到不同程度的真菌污染，其中，我國(guó)樣品中FB、AFTB、ZEN和DON等檢出率均超過(guò)25%，并且存在混合污染現(xiàn)象[8-9]。嚴(yán)格控制這些真菌對(duì)玉米等糧油作物及其他農(nóng)產(chǎn)品的污染，是保障人類(lèi)健康的必然要求[10]。

開(kāi)發(fā)玉米等農(nóng)產(chǎn)品中真菌毒素高效檢測(cè)技術(shù)，是掌握玉米等農(nóng)產(chǎn)品中真菌毒素污染水平的重要手段，是為玉米等農(nóng)產(chǎn)品生產(chǎn)中疫情監(jiān)測(cè)和適宜防疫措施的建立提供的一種有力技術(shù)支持，對(duì)玉米等產(chǎn)業(yè)持續(xù)健康發(fā)展具有重要作用。目前，真菌毒素的檢測(cè)方法主要有液相色譜法[11-12]、熒光光度法[13-14]、酶聯(lián)免疫吸附法[15-16]、薄層色譜法[17-18]和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[19-20]等。樣品中真菌毒素凈化方法一般用免疫親和柱等凈化柱進(jìn)行固相萃取，不僅存在過(guò)程繁瑣，成本較高等問(wèn)題，并且在檢測(cè)過(guò)程中同時(shí)測(cè)定毒素種類(lèi)較少；而本文綜合利用UPLC-MS/MS和QuEChERS法的優(yōu)勢(shì)，在相關(guān)研究的基礎(chǔ)上，建立了快速準(zhǔn)確的測(cè)定玉米中9種真菌毒素的方法。

本文借助超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀，通過(guò)對(duì)提取方法的改進(jìn)，以及對(duì)色譜、質(zhì)譜條件優(yōu)化降低基質(zhì)干擾，旨在建立玉米中AFTB1、AFTB2、FB1、FB2、FB3、DON、15-ADON、3-ADON和ZEN 9種真菌毒素同時(shí)檢測(cè)的一種高效方法，為玉米等農(nóng)產(chǎn)品中真菌毒素的檢測(cè)、污染監(jiān)測(cè)及風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

待測(cè)玉米樣品 2019年秋收時(shí)節(jié)采集自吉林省，共240份；空白玉米樣品 本實(shí)驗(yàn)室2018年檢測(cè)并留存的無(wú)生物毒素污染的玉米樣品1份；標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)AFTB1（2.02 μg/mL）、AFTB2（0.502 μg/mL）、ZEN（100.2 μg/mL）、FB1（50.1 μg/mL）、FB2（50.0 μg/mL）、FB3（50.3 μg/mL）、DON（100.0 μg/mL）、15-ADON（100.1 μg/mL）和3-ADON（100.3 μg/mL）ROMER公司；乙腈、甲醇、甲酸 色譜級(jí)，美國(guó)Thermo Fisher公司；萃取包填料為4 g無(wú)水硫酸鎂、1 g氯化鈉、1 g檸檬酸鈉二水合物和0.5 g檸檬酸二鈉 美國(guó)Agilent公司。

QTRAP 5500質(zhì)譜儀 美國(guó)AB Sciex公司；LC-30A超高效液相色譜儀 日本Shimadzu公司；GENIUS 3渦旋混勻器 德國(guó)IKA公司；MULTIFUGE X3R離心機(jī) 美國(guó)Thermo Fisher公司；HZQ-C空氣浴振蕩器 東聯(lián)電子技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司；FW-100高速萬(wàn)能粉碎機(jī) 北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣品前處理 取玉米試樣，高速粉碎機(jī)粉碎過(guò)18目篩子，混勻，稱(chēng)取2.00 g于50 mL離心管內(nèi)，加入20 mL 80%乙腈-0.1%甲酸水溶液，恒溫振蕩器內(nèi)振蕩提取30 min，加入萃取包，振搖2 min凈化，10000 r/min離心5 min，取上清液2.0 mL于試管內(nèi)，50 ℃水浴氮吹至近干，用1.0 mL甲醇-水溶液（v/v=1:1）溶解，渦旋1 min，過(guò)0.22 μm濾膜于樣品瓶?jī)?nèi)，待上機(jī)。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

1.2.2.1 單標(biāo)溶液的配制 移取FB1、FB2、FB3標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)各10 μL，DON、15-ADON、3-ADON和ZEN標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)各5 μL分別用甲醇定容到10 mL容量瓶?jī)?nèi)，移取AFTB1標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)120 μL用甲醇定容到5 mL容量瓶?jī)?nèi)，移取AFTB2標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)200 μL用甲醇定容到2 mL容量瓶?jī)?nèi)，即：將9種真菌毒素分別配制成50 μg/L的單標(biāo)溶液。

1.2.2.2 混合標(biāo)準(zhǔn)中間液的配制 取10 mL容量瓶1只，分別準(zhǔn)確移入FB1、FB2和FB3標(biāo)準(zhǔn)品溶液各100 μL，配制濃度為0.50100、0.50000、0.50300 μg/mL；移入DON、15-ADON、3-ADON和ZEN標(biāo)準(zhǔn)品溶液各50 μL，配制濃度為0.50020、0.50020、0.50060 μg/mL；移入AFTB1標(biāo)準(zhǔn)品溶液200 μL，配制濃度為0.04004 μg/mL；AFTB2標(biāo)準(zhǔn)品溶液400 μL，配制濃度為0.02008 μg/mL；用甲醇定容至刻度，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2.3 混合標(biāo)準(zhǔn)工作液的配制 取空白玉米樣品，按照1.2.1項(xiàng)處理，得到空白玉米基質(zhì)提取液，根據(jù)9種毒素在質(zhì)譜中的響應(yīng)值，用空白基質(zhì)配制FB1、FB2、FB3、DON、15-ADON、3-ADON和ZEN質(zhì)量濃度為6.25、31.25、62.5、125、250 μg/L，AFTB1質(zhì)量濃度為0.5、2.5、5、10、20 μg/L，AFTB2質(zhì)量濃度為0.25、1.25、2.5、5、10 μg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.2.2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 采用空白玉米樣品提取溶液分別配制成系列基質(zhì)對(duì)照品溶液。其中FB1、FB2、FB3、DON、15-ADON、3-ADON和ZEN濃度為6.25～250 μg/L，AFTB1濃度為0.5～20 μg/L，AFTB2濃度為0.25～10 μg/L，以毒素濃度（X）為橫坐標(biāo)，峰面積（Y）為縱坐標(biāo)，擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.3 儀器條件

1.2.3.1 色譜條件 色譜柱：C18（2.1 mm × 100 mm，1.7 μm；）；柱溫：40 ℃；流速：0.3 mL/min；進(jìn)樣量：3 μL；流動(dòng)相：A-0.1%甲酸+5 mmol/L甲酸銨水溶液，B-甲醇；梯度洗脫模式見(jiàn)表1。

表1 梯度洗脫程序Table 1 Gradient elution procedures

1.2.3.2 質(zhì)譜條件 離子源為ESI源；掃描方式：Scheduled MRMTM采集模式，正負(fù)離子同時(shí)掃描；離子化電壓：正模式5500 V，負(fù)模式-4500 V；氣簾氣30 Psi；霧化溫度：550 ℃；霧化氣：55 Psi；輔助氣：55 Psi。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Analyst Softwaer軟件進(jìn)行采集數(shù)據(jù)；用MultiQuant 3.0.2軟件進(jìn)行處理，本文所用數(shù)據(jù)平行及重復(fù)次數(shù)、數(shù)據(jù)表示形式、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析方法、顯著性水平均采用Excel辦公軟件；繪圖軟件采用Orign8.0軟件處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 儀器條件優(yōu)化

2.1.1 質(zhì)譜條件優(yōu)化 將9種真菌毒素單標(biāo)溶液，分別通過(guò)針泵直接注射進(jìn)入質(zhì)譜中，測(cè)定其正負(fù)模式下質(zhì)譜信號(hào)強(qiáng)度，確定各個(gè)毒素的母離子質(zhì)量數(shù)。通過(guò)優(yōu)化可知，AFTB1、AFTB2、FB1、FB2、FB3、DON、3-ADON和15-ADON在正模式下[M+H]+靈敏度最高，而ZEN在正模式下[M-H]-離子響應(yīng)值大。確定母離子后，對(duì)母離子進(jìn)行全掃描分析二級(jí)質(zhì)譜圖，確定其子離子，最后對(duì)碰撞能量（CE）和去簇電壓（DP）優(yōu)化，確定9種真菌毒素質(zhì)譜條件如表2。

在一次進(jìn)樣過(guò)程中，為了監(jiān)測(cè)更多的離子對(duì)，采用Scheduled MRMTM采集模式，預(yù)設(shè)保留時(shí)間，在短時(shí)間窗口內(nèi)采集單個(gè)離子對(duì)，使每個(gè)分析物的占空比大大增加，結(jié)合快速級(jí)性轉(zhuǎn)換，實(shí)現(xiàn)了一次進(jìn)樣，正負(fù)模式同時(shí)采集，縮短了樣品的分析時(shí)間。

2.1.2 色譜條件優(yōu)化 選擇C18色譜柱為分離柱；通過(guò)對(duì)比等度洗脫和梯度洗脫模式，最終優(yōu)化出在梯度洗脫模式下，使色譜峰分離效果好；并分別使用甲醇和乙腈分離這9種真菌毒素，結(jié)果顯示，在甲醇溶液中加入0.1%甲酸和5 mmol/L甲酸銨，有利于被分析組分離子化；3-ADON和15-ADON在色譜中保留時(shí)間相同，但質(zhì)譜條件不同，不影響定性定量分析，而FB2和FB3在質(zhì)譜中的母離子和子離子相同，在色譜中卻得到很好分離，因而也不影響定性定量分析（圖1）。

2.2 方法學(xué)考察

2.2.1 方法的線性范圍、檢出限及定量限 以毒素質(zhì)量濃度（X）為橫坐標(biāo)，峰面積（Y）為縱坐標(biāo)，擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線，列于表3。9種真菌毒素在相對(duì)應(yīng)的線性范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)均大于0.9999。

表2 質(zhì)譜條件Table 2 Mass spectrum conditions

當(dāng)信噪比S/N=3時(shí)確定檢出限（LOD），信噪比S/N=10時(shí)確定定量限（LOQ），ZEN檢出限為0.73 μg/kg，定量限為2.4 μg/kg；AFTB2和AFTB1的檢出限分別為0.079、0.14 μg/kg，定量限為0.26和0.48 μg/kg；FB1、FB2、FB3的檢出限依次為1.3、0.26、1.8 μg/kg，定量限為4.3、0.86、6.0 μg/kg；DON、3-ADON和15-ADON的檢出限為1.4、1.1、1.1 μg/kg，定量限為4.6、3.8、3.8 μg/kg，結(jié)果見(jiàn)表3。

圖1 9種真菌毒素離子流圖Fig.1 Ion flow diagram of 9 fungal toxins

表3 方法的線性范圍、檢出限及定量限Table 3 Linear range, detection limit and quantitative limit of the method

2.2.2 方法的準(zhǔn)確度及精密度 取空白玉米基質(zhì)，加入不同濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，平行測(cè)定6次，計(jì)算平均回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，結(jié)果見(jiàn)表4。9種真菌毒素平均回收率在80.2%～113.8%之間，RSD在0.2%～7.7%之間，表明該方法準(zhǔn)確度和精密度均較好，達(dá)到歐盟法規(guī)要求[21]。

2.2.3 基質(zhì)效應(yīng) 分別測(cè)定空白玉米基質(zhì)提取液配制的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液和50%甲醇水溶液配制的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，計(jì)算峰面積比可得到9種真菌毒素的基質(zhì)效應(yīng)值。計(jì)算公式如下：

表4 9種真菌毒素平均回收率和精密度（n = 6）Table 4 Average recovery and precision of 9 mycotoxins (n = 6)

式中：ME：基質(zhì)效應(yīng)（%）；Am：空白基質(zhì)配制的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜峰面積；As：50%甲醇水溶液配制的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜峰面積。

當(dāng)ME=100%時(shí)，沒(méi)有基質(zhì)效應(yīng)；當(dāng)ME＜100%時(shí)，為基質(zhì)抑制效應(yīng)；ME＞100%時(shí)，為基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)。實(shí)際檢測(cè)過(guò)程中，很難存在ME=100%的理想狀態(tài)，ME在85%～115%之間時(shí)，即認(rèn)定為基質(zhì)效應(yīng)不明顯。

圖2給出的是9種真菌毒素基質(zhì)效應(yīng)結(jié)果。由圖2可知，9種真菌毒素均具有基質(zhì)效應(yīng)，其中FB1、FB2、FB3和15-ADON基質(zhì)效應(yīng)分別為110.05%、106.96%、107.67%和89.29%均在85%～115%之間，表明基質(zhì)效應(yīng)不明顯；DON基質(zhì)效應(yīng)為125.57%，只有DON為基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)，而ZEN、AFTB1、AFTB2、3-ADON基質(zhì)效應(yīng)分別為63.87%、71.34%、56.68%和83.85%，基質(zhì)效應(yīng)均小于85%，表現(xiàn)基質(zhì)抑制效應(yīng)，AFTB2的抑制效應(yīng)最強(qiáng)。在實(shí)際檢測(cè)過(guò)程中，應(yīng)選用空白玉米基質(zhì)提取液配制標(biāo)準(zhǔn)溶液，外標(biāo)法定量來(lái)降低基質(zhì)抑制效應(yīng)的影響。

圖2 9種真菌毒素基質(zhì)效應(yīng)散點(diǎn)圖Fig.2 Scatter plots of matrix effects of 9 mycotoxins

2.2.4 與國(guó)標(biāo)儀器方法對(duì)比 取空白玉米基質(zhì)溶液，按25 μg/kg加標(biāo)，制成陽(yáng)性樣品，分別按照GB 5009.240-2016《食品中伏馬毒素的測(cè)定》[22]、GB 5009.22-2016《食品中黃曲霉毒素B族和G族的測(cè)定》[23]、GB 5009.209-2016《食品中玉米赤霉烯酮的測(cè)定》[24]、GB 5009.111-2016《食品中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇及其乙?；苌锏臏y(cè)定》[25]中的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法和本法進(jìn)行測(cè)定，平行測(cè)定6次。結(jié)果見(jiàn)表5。比較發(fā)現(xiàn)，本方法與國(guó)標(biāo)方法檢測(cè)結(jié)果沒(méi)有顯著性差異（P＞0.05），表明本方法既準(zhǔn)確可靠，切實(shí)可行，又操作更簡(jiǎn)單、用時(shí)更短、效率更高（同時(shí)檢測(cè)9種成分）。

2.2.5 樣品檢測(cè) 應(yīng)用本法對(duì)吉林省產(chǎn)240份玉米樣品進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，240份樣品中，AFTB1和AFTB2未有檢出，但不同程度檢出ZEN、DON、3-ADON、15-ADON、FB1、FB2和FB3，其中ZEN檢出率為14.6%，含量為9.9～13530.5 μg/kg；DON檢出率為52.9%，含量為9.5～1806.3 μg/kg；3-ADON檢出率為30.4%，含量為10.1～205.6 μg/kg；15-ADON檢出率為45.1%，含量為11.0～1472.2 μg/kg；伏馬毒素檢出率最高，F(xiàn)B1檢出率達(dá)到96.7%，含量為14.5～23270.1 μg/kg；FB2檢出率為98.3%，含量為29.8～5877.1 μg/kg；FB3檢出率為85.8%，含量為17.3～3365.5 μg/kg；具體結(jié)果見(jiàn)表6。而且一個(gè)樣品中同時(shí)檢出幾種毒素現(xiàn)象較多，表7給出樣品中同時(shí)檢測(cè)出5種毒素情況，表明吉林省玉米存在真菌毒素混合污染問(wèn)題。

表5 本方法與國(guó)標(biāo)方法對(duì)比結(jié)果（n = 6）Table 5 Comparison results between this method and GB method (n = 6)

表6 240份玉米樣品中各毒素含量的最大值、最小值及檢出率Table 6 Maximum and minimum values and detection rates of each toxin content in 240 maize samples

3 結(jié)論

采用QuEChERS技術(shù)建立UPLC-MS/MS同時(shí)測(cè)定玉米中9種真菌毒素的方法，優(yōu)化了質(zhì)譜色譜條件，并通過(guò)優(yōu)化提取步驟及凈化方法等條件有效減少玉米樣品的基質(zhì)干擾。在0.25～250 μg/L濃度范圍內(nèi)9種真菌毒素相關(guān)系數(shù)均在0.9999以上，檢出限在0.079～1.8 μg/kg之間，定量限在0.26～6.0 μg/kg之間，回收率在80.2%～113.8%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差≤7.7%，駐留時(shí)間10 min內(nèi)，9種真菌毒素得到很好分離，該方法操作簡(jiǎn)單、精密度好、靈敏度高、分析速度快，適用于玉米中9種真菌毒素同時(shí)檢測(cè)，可為農(nóng)產(chǎn)品中多組分真菌毒素污染風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估提供參考依據(jù)。將優(yōu)化后方法對(duì)240份玉米樣品進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明，該批樣品中AFTB1和AFTB2未有檢出，但不同程度檢出ZEN、DON、3-ADON、15-ADON、FB1、FB2。其中FB2檢出率最高，達(dá)到98.3%。表明吉林省玉米存在真菌毒素混合污染問(wèn)題。

表7 同時(shí)檢測(cè)出5種毒素的玉米樣品Table 7 Maize samples with 5 toxins detected simultaneously