董欣睿，趙鑫磊, ，楊崳茜，江連州，于殿宇，包怡紅,3,

（1.東北林業(yè)大學林學院，黑龍江哈爾濱 150040；2.東北農(nóng)業(yè)大學食品學院，黑龍江哈爾濱 150030；3.黑龍江省森林食品資源利用重點實驗室，黑龍江哈爾濱 150040）

米糠是稻谷碾磨加工形成精米過程中留下的種皮和胚芽的混合物質(zhì)，是稻谷加工過程中的主要副產(chǎn)物之一，占稻谷總質(zhì)量的5%～8%[1]。米糠含有多種營養(yǎng)物質(zhì)及功能性化合物，其中粗蛋白質(zhì)含量為11%～13%，纖維含量約為11%，油脂含量約為20%，還含有多種礦物質(zhì)，如鐵、磷、鎂等[2-3]。有研究表明米糠油具有降低低密度脂蛋白和總血清膽固醇的功效[4]。米糠多用于化肥、動物飼料生產(chǎn)以及化妝品行業(yè)。目前，很多學者將米糠作為發(fā)酵底物，通過微生物代謝活動產(chǎn)生更多對人體有益的化合物，例如酶、抗氧化劑、生物表面活性劑、有機酸、多不飽和脂肪酸（PUFA）等，進而提高營養(yǎng)物質(zhì)總含量[5-6]。

酵素一詞起源于日本，本意指酶，隨著酵素食品種類的增多，其含義延伸為植物通過接種乳酸菌或酵母菌進行發(fā)酵所獲得的發(fā)酵食品。酵素包涵有機酸、蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶、超氧化物歧化酶等多種活性成分，具有抗氧化、抑菌、凈化血液、消炎、促進細胞新生等作用[7]。米糠中含有豐富的多糖及脂肪酸，但其無法直接食用，因此發(fā)酵制備米糠酵素成為利用米糠的新途徑[2]。

超聲、微波、焙烤是常見的食品處理技術(shù)，三者分別通過空化作用、微波震蕩生熱、焙烤熱效應對物質(zhì)結(jié)構(gòu)或組成產(chǎn)生影響。王振斌等[8]利用超聲波輔助多菌種發(fā)酵技術(shù)制備葛根酵素，提高酵素中蛋白酶與脂肪酶活力，而尚未見微波與焙烤對酵素品質(zhì)影響的文獻。目前，關(guān)于三種預處理方式對米糠酵素品質(zhì)的影響鮮有報道。pH可反映發(fā)酵液中微生物生長代謝情況，液態(tài)酵素的pH一般在3～4之間[9]，因此，pH可作為判斷發(fā)酵是否正常進行的參考指標。由于米糠酵素中蛋白酶的存在，可以水解米糠蛋白生成一定量的L-谷氨酸，L-谷氨酸再經(jīng)乳酸菌、酵母代謝產(chǎn)生的L-谷氨酸脫羧酶催化轉(zhuǎn)化為GABA，而GABA因其多種生理功能成為植物酵素質(zhì)量品質(zhì)的主要標志物之一，并可作為衡量酵素成熟度的主要指標。因此，本文以米糠為原料，經(jīng)預實驗篩選確定的乳酸菌和酵母菌為發(fā)酵菌種，γ-氨基丁酸（GABA）含量和pH作為檢測指標，首先通過正交試驗獲得制備米糠酵素最優(yōu)條件；然后通過單因素實驗分別優(yōu)化不同預處理方式的工藝條件，最后各自在最優(yōu)處理參數(shù)下，比較不同預處理方式對米糠酵素的影響，以期為米糠酵素的制備工藝及米糠資源的開發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

米糠、γ-氨基丁酸、蜂蜜、乳酸菌（植物乳桿菌Lactobacillus plantarum） 東北林業(yè)大食品微生物實驗室保存；酵母菌（釀酒酵母Saccharomyces cerevisiae）安琪酵母股份有限公司。

H/T20MM型臺式高速離心機 湖南赫西儀器裝備有限公司；722型可見分光光度計 上海光譜儀器有限公司；DH6000A型電熱恒溫培養(yǎng)箱 天津市泰斯特儀器有限公司；pHS-3E型pH計 上海儀電科學儀器股份有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 米糠酵素制備工藝流程

1.2.2 培養(yǎng)基配制

1.2.2.1 種子培養(yǎng)基 MRS（g/L）：蛋白胨10 g，牛肉浸粉5.0 g，酵母浸粉4.0 g，葡萄糖20.0 g，吐溫80 1.0 mL，七水磷酸氫二鉀2.0 g，三水醋酸鈉5.0 g，檸檬酸三銨2.0 g，七水硫酸鎂0.2 g，四水硫酸錳0.05 g，溶于1000 mL蒸餾水中，調(diào)pH 6.2±0.2，121 ℃高壓蒸汽滅菌15 min。YPD（g/L）: 10 g酵母膏，20 g蛋白胨，20 g葡萄糖，溶于1000 mL蒸餾水中，121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。

1.2.2.2 發(fā)酵培養(yǎng)基 將米糠與蒸餾水按料水比1:15（g/mL）混勻，煮沸90 min，5000 r/min離心10 min后取上清液，每50 mL發(fā)酵液中添加2.5 g紅糖和1.5 g蜂蜜，調(diào)pH至6.0，121 ℃滅菌20 min，得米糠發(fā)酵液備用。

1.2.3 米糠發(fā)酵工藝單因素實驗1.2.3.1 發(fā)酵時間對米糠酵素GABA含量及pH的影響 在發(fā)酵培養(yǎng)基中接入3%復合發(fā)酵菌種（植物乳桿菌與釀酒酵母體積比為1:1；植物乳桿菌約為1.1 ×109CFU/mL，釀酒酵母約為1.5×107CFU/mL），在28 ℃的溫度下分別靜置培養(yǎng)12、24、36、48、60 h，測定GABA含量及pH的變化。

1.2.3.2 發(fā)酵溫度對米糠酵素GABA含量及pH的影響 在發(fā)酵培養(yǎng)基中接入3%復合發(fā)酵菌種（植物乳桿菌與釀酒酵母體積比為1:1；植物乳桿菌約為1.1×109CFU/mL，釀酒酵母約為1.5×107CFU/mL），分別在28、30、32、34、36 ℃條件下靜置培養(yǎng)24 h后，測定GABA含量及pH的變化。

1.2.3.3 植物乳桿菌與釀酒酵母接種體積比對米糠酵素GABA含量及pH的影響 配制米糠酵素培養(yǎng)基，接種3%復合發(fā)酵菌種（植物乳桿菌約為1.1 × 109CFU/mL，釀酒酵母約為1.5×107CFU/mL），如表1所示，分別向發(fā)酵液中接入不同比例的乳桿菌與酵母，在溫度為28 ℃的條件下靜置培養(yǎng)24 h，測定GABA含量及pH的變化。

表1 植物乳桿菌與釀酒酵母接種體積比Table 1 Inoculation volume ratio of Lactobacillus plantarum and Saccharomyces cerevisiae

1.2.4 正交試驗 為得到制備米糠酵素的最優(yōu)發(fā)酵工藝，在單因素實驗基礎(chǔ)上，選擇發(fā)酵時間（h）、發(fā)酵溫度（℃）、植物乳桿菌與釀酒酵母接種比例3個因素，以米糠酵素中GABA含量為評價指標，采用L9（34）正交試驗確定最佳發(fā)酵工藝條件，正交試驗因素水平表如表2。

表2 發(fā)酵條件優(yōu)化的正交試驗因素水平表Table 2 Factors and levels table of optimization for fermentation conditions

1.2.5 預處理米糠的方法

1.2.5.1 超聲預處理米糠的條件 分別在超聲功率為180、210、240、270、300 W條件下（此時超聲時間為20 min），超聲時間為5、10、15、20、25 min（超聲功率為240 W），超聲處理后的米糠配制發(fā)酵培養(yǎng)基，將乳桿菌與酵母按照1:2比例接入發(fā)酵液，在30 ℃下培養(yǎng)24 h，測其GABA含量和pH。

1.2.5.2 微波預處理米糠的條件 對米糠原料進行微波預處理，微波功率設為300、400、500、600、700 W（此時微波時間為60 s），微波時間30、60、90、120、150 s（此時微波功率為600 W），微波處理后的米糠配制發(fā)酵培養(yǎng)基，將乳桿菌與酵母按照1:2比例接入發(fā)酵液，在30 ℃下培養(yǎng)24 h,測其GABA含量和pH。

1.2.5.3 焙烤預處理米糠的條件 對米糠原料進行焙烤預處理，焙烤溫度設為180、190、200、210、220 ℃（此時焙烤時間為15 min），焙烤時間為5、15、25、35、45 min（焙烤溫度為210 ℃），焙烤處理后的米糠配制發(fā)酵培養(yǎng)基，將乳桿菌與酵母按1:2比例接入發(fā)酵液，在30 ℃下培養(yǎng)24 h，測其GABA含量和pH。

1.2.6 γ-氨基丁酸的檢測 參考趙宏飛[10]等檢測γ-氨基丁酸的方法。

1.2.7 谷胱甘肽檢測 參考賈貞[11]檢測谷胱甘肽的方法。

1.2.8 pH檢測 采用pH計測定發(fā)酵液的pH,按照說明書操作。

1.2.9 蛋白酶檢測 參考楊旭等[12]等方法測定米糠酵素中蛋白酶活力。

1.2.10 乳酸菌菌落數(shù)的測定 參照GB 4789.35-2016《食品微生物學檢驗乳酸菌檢驗》[13]方法，用10倍稀釋法，將體積分數(shù)分別為10-2～10-8稀釋菌液涂布于MRS培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)48 h后計數(shù)。

1.2.11 酵母菌菌落數(shù)的測定 參照GB 4789.15-2016 《食品微生物學檢驗霉菌和酵母計數(shù)》[14]方法，用10倍稀釋法，將體積分數(shù)分別為10-2～10-7稀釋菌液涂布于YPD培養(yǎng)基上，28 ℃培養(yǎng)48 h后計數(shù)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有試驗平行測定3次，運用SPSS18.0與Graphpad Prism 7.0軟件進行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析以及相關(guān)圖表的繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 米糠發(fā)酵條件單因素實驗結(jié)果

2.1.1 發(fā)酵時間對米糠發(fā)酵的影響 圖1可知，不同發(fā)酵時間對應的發(fā)酵液pH均在3.43～3.71范圍內(nèi)，且在發(fā)酵時間12～60 h范圍內(nèi)，pH呈現(xiàn)逐漸降低趨勢。當發(fā)酵時間為12 h時，米糠酵素中GABA含量為0.93 g/L；隨著發(fā)酵時間延長，酶產(chǎn)物的增加，當發(fā)酵時間為24 h時，米糠酵素中GABA含量達到最大0.95 g/L。隨著發(fā)酵繼續(xù)進行，相關(guān)酶的活性受到體系各因素的影響（如米糠培養(yǎng)基底物消耗）而降低[15]，導致米糠酵素中GABA含量降低。

2.1.2 發(fā)酵溫度對米糠發(fā)酵的影響 從圖2可知，實驗溫度范圍內(nèi)，發(fā)酵24 h，發(fā)酵液pH在3.41～3.69之間，發(fā)酵溫度從28 ℃升高到30 ℃時，pH下降較快，超過30 ℃以后pH下降緩慢，當達到34 ℃還略有上升。米糠酵素中GABA含量隨溫度升高，呈先上升后降低的趨勢。當發(fā)酵溫度升高至30 ℃時，米糠酵素中GABA含量達到最大值為0.88 g/L，隨后GABA含量降低。胡超等[16]用高產(chǎn)GABA的酵母發(fā)酵生產(chǎn)GABA的最適溫度也是30 ℃，溫度偏低或者偏高對菌株的生長和代謝會有影響，從而影響GABA的產(chǎn)量及發(fā)酵液pH。

圖1 發(fā)酵時間對米糠酵素產(chǎn)γ-氨基丁酸與pH的影響Fig.1 Effect of fermentation time on GABA and pH of rice bran ferment

圖2 發(fā)酵溫度對米糠酵素產(chǎn)γ-氨基丁酸與pH的影響Fig.2 Effect of fermentation temperature on GABA and pH of rice bran ferment

2.1.3 植物乳桿菌與釀酒酵母接種比例對米糠發(fā)酵的影響 如表3所示，當發(fā)酵培養(yǎng)基中只接種乳酸菌或者酵母菌時，米糠酵素中GABA含量均不如混菌發(fā)酵時產(chǎn)量高，且pH均在3.5左右，因此混菌發(fā)酵要好于單菌發(fā)酵。當乳酸菌與酵母菌接種比例為1:2時（6號組），米糠酵素中GABA含量最高，為1.17 g/L。張旭普等[17]研究發(fā)現(xiàn)，植物乳桿菌與釀酒酵母混合發(fā)酵相比于單菌發(fā)酵在菌體代謝方面更有潛力，這可能是由于兩種菌的代謝產(chǎn)物在一定生長階段存在某種互生關(guān)系，同時也有相關(guān)釀酒酵母及乳酸協(xié)同發(fā)酵研究佐證[18-19]。

表3 不同接種比例米糠酵素中GABA含量及pH檢測結(jié)果Table 3 Detection results of GABA and pH in rice bran ferment with different inoculation ratios

2.2 米糠酵素發(fā)酵條件正交實驗優(yōu)化結(jié)果

在單因素實驗基礎(chǔ)上，選擇發(fā)酵時間（A）、發(fā)酵溫度（B）、乳酸菌與酵母接種體積比（C）三個因素，以發(fā)酵液中GABA含量為評價指標，確定制備米糠酵素的最優(yōu)發(fā)酵工藝條件。

米糠酵素發(fā)酵工藝的正交試驗結(jié)果見表4，方差分析結(jié)果見表5。由表5可知，三個因素對GABA產(chǎn)量影響的極差順序大小為B＞A＞C，方差分析表明，發(fā)酵溫度對米糠酵素發(fā)酵具有顯著影響（P＜0.05），發(fā)酵時間和乳酸菌與酵母菌接種比對發(fā)酵無顯著影響（P＞0.05）。直觀分析可知，最優(yōu)發(fā)酵工藝條件為A2B2C2，即發(fā)酵溫度為30 ℃，發(fā)酵時間為24 h，乳酸菌與酵母菌接種比為1:2，但此工藝條件不在正交表的9組實驗中，需對正交試驗優(yōu)化結(jié)果進行驗證。

表4 米糠酵素發(fā)酵工藝條件優(yōu)化正交試驗結(jié)果（n = 3）Table 4 Result of orthogonal test for rice bran ferment fermentation conditions optimization (n = 3)

表5 以米糠酵素中GABA含量為評價指標的方差分析Table 5 Analysis of variance using GABA content in rice bran ferment as an evaluation index

2.3 發(fā)酵工藝驗證試驗

為驗證正交試驗優(yōu)化結(jié)果的準確性，以發(fā)酵溫度30 ℃，發(fā)酵時間24 h，乳酸菌與酵母菌接種比為1:2時，測得GABA含量為1.41 g/L，此GABA產(chǎn)量高于正交表9組實驗中的最優(yōu)實驗組（第5組A2B2C3結(jié)果為1.21 g/L）。因此，米糠酵素最優(yōu)發(fā)酵工藝為發(fā)酵溫度為30 ℃，發(fā)酵時間為24 h，乳酸菌與酵母菌接種比為1:2。

2.4 米糠預處理工藝條件對酵素的影響

2.4.1 超聲預處理條件對米糠酵素的影響 由圖3可知，米糠酵素中GABA產(chǎn)量會隨著超聲功率的增大呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，而pH呈現(xiàn)先降低后升高的趨勢。在超聲功率為240 W時，GABA產(chǎn)量達到最大值為2.61 g/L，此時pH為最低值3.18（圖3a）。米糠酵素中GABA產(chǎn)量與pH隨著超聲時間延長所呈現(xiàn)趨勢與超聲功率增大的趨勢相同，當超聲時間為20 min時，GABA產(chǎn)量達到最大值2.59 g/L，此時發(fā)酵液pH為3.14（圖3b）。因此，超聲米糠的條件為超聲功率240 W，超聲時間20 min。超聲處理后的米糠經(jīng)發(fā)酵制得米糠酵素GABA含量（2.61 g/L）高于未處理的米糠（1.41 g/L），分析其原因可能是由于超聲波的空化作用改變了米糠蛋白的四級結(jié)構(gòu)，生成小分子的亞基和肽[20]，當發(fā)酵液中有蛋白酶產(chǎn)生時，促進米糠蛋白水解，從而影響米糠酵素中pH及GABA產(chǎn)量。

2.4.2 微波預處理條件對米糠酵素的影響 由圖4可知，當微波功率為300 W時，米糠酵素中GABA產(chǎn)量為1.08 g/L，pH為3.56。當微波功率增大至600 W時，GABA產(chǎn)量達到最大值1.47 g/L，pH為3.36。隨著微波功率繼續(xù)增大，GABA產(chǎn)量有降低趨勢，pH變化不明顯（圖4a）。GABA產(chǎn)量隨著微波時間延長呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，而pH呈現(xiàn)先降低后升高的變化趨勢。當微波時間為60 s時，GABA產(chǎn)量達到最大值1.45 g/L，此時發(fā)酵液pH為3.32（圖4b）。因此，微波處理米糠的條件為微波功率600 W，超聲時間60 s。經(jīng)微波米糠制得的米糠酵素GABA含量（1.47 g/L）大于未經(jīng)處理的米糠酵素中GABA（1.41 g/L）含量，因為微波使米糠蛋白的空間結(jié)構(gòu)受到破壞，蛋白二級結(jié)構(gòu)螺旋和折疊發(fā)生變化，從而增加米糠蛋白溶解性，進而提高發(fā)酵液中GABA的產(chǎn)量[21]。然而，微波功率過大及微波時間過長，微波的熱作用使蛋白質(zhì)的球形結(jié)構(gòu)變?yōu)榘魻罱Y(jié)構(gòu), 疏水基團暴露, 疏水殘基相互作用形成網(wǎng)絡, 又會使蛋白的溶解性降低，不利于發(fā)酵菌種利用，因此pH會呈現(xiàn)先降低后升高的趨勢[22]。

圖3 超聲預處理米糠對米糠酵素產(chǎn)γ-氨基丁酸產(chǎn)量與pH的影響Fig.3 Effects of ultrasonic treatment of rice bran on r-aminobutyric acid production and pH of rice bran ferment

圖4 微波預處理米糠對米糠酵素產(chǎn)γ-氨基丁酸產(chǎn)量與pH的影響Fig.4 Effect of microwave treatment of rice bran on r-aminobutyric acid production and pH of rice bran ferment

圖5 烘烤預處理米糠對米糠酵素產(chǎn)γ-氨基丁酸產(chǎn)量與pH的影響Fig.5 Effect of baking treatment of rice bran on r-aminobutyric acid production and pH of rice bran ferment

2.4.3 焙烤預處理條件對米糠酵素的影響 由圖5可知，隨著焙烤溫度的升高，GABA產(chǎn)量呈先升高后降低趨勢，pH呈先降低后升高的趨勢。當焙烤溫度達到210 ℃時，GABA產(chǎn)量為最大值0.91 g/L，pH為3.37（圖5a）。隨著焙烤時間的延長，GABA產(chǎn)量同樣呈先升高后降低的趨勢，pH呈先降低后升高再略有降低的趨勢。當處理米糠的焙烤時間為15 min時，GABA產(chǎn)量達到最大值0.91 g/L，pH為3.32（圖5b）。因此，焙烤米糠的溫度為210 ℃，焙烤時間為15 min，但經(jīng)焙烤米糠發(fā)酵的米糠酵素GABA含量（0.91 g/L）小于未經(jīng)處理的米糠制得米糠酵素中GABA含量（1.41 g/L），分析其原因可能為焙烤使米糠中蛋白質(zhì)在高溫加熱時，引起蛋白質(zhì)化學結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，氨基酸被氧化，氧化后的氨基酸鍵可以阻止酶的水解反應，從而影響了米糠酵素中pH及GABA產(chǎn)量。

表6 不同條件處理米糠對米糠酵素各指標的影響Table 6 Effects of different conditions on rice bran treatment on various indexes of rice bran ferment

2.5 不同預處理方式對米糠酵素品質(zhì)的影響

將米糠分別在超聲（240 W、20 min）、微波(600 W、60 s)及焙烤（210 ℃、15 min）條件下預處理后，進行發(fā)酵制備米糠酵素，米糠酵素中GABA、谷胱甘肽含量、蛋白酶活力、pH、乳酸菌及酵母菌菌落數(shù)等各指標檢測結(jié)果如表6所示。

由表6可知，預處理米糠對米糠酵素各指標的大小有影響。超聲處理米糠組的GABA含量及乳酸菌菌落數(shù)均為最高，且pH最低，分別為2.61 g/L、3.17 × 108CFU/mL和3.18。未處理米糠組的發(fā)酵液中蛋白酶活力高于其他各組，但與超聲處理米糠組的差異不顯著（P＞0.05）。焙烤處理米糠組的發(fā)酵液中谷胱甘肽含量最高為126.28 μmol/L，但其它指標數(shù)據(jù)顯著低于超聲處理組（P＜0.05），因此三種預處理方式中，最優(yōu)處理方式為超聲處理。

3 結(jié)論

以米糠為原料，以乳酸菌和酵母菌為發(fā)酵菌株，通過單因素及正交試驗確定制備米糠酵素的最優(yōu)發(fā)酵工藝條件為：發(fā)酵溫度30 ℃，發(fā)酵時間24 h，乳酸菌與酵母菌接種比例為1:2。經(jīng)超聲（240 W、20 min）、微波（600 W、60 s）及焙烤（210 ℃、15 min）預處理米糠制備米糠酵素中GABA、谷胱甘肽含量、蛋白酶活力、pH、乳酸菌及酵母菌菌落數(shù)等各指標之間存在差異，其中經(jīng)超聲（240 W、24 h）預處理制備米糠酵素的GABA含量顯著高于其他組（P＜0.05）。本文通過三種預處理方式制備米糠酵素，發(fā)現(xiàn)制得的米糠酵素各指標之間存在差異，希望為后續(xù)米糠酵素的制備提供一種新思路。