張楠馳，茍小蘭，王 利

（西南民族大學(xué)，青藏高原動物遺傳資源保護與利用國家教育部重點實驗室，動物科學(xué)國家民委重點實驗室，四川成都 610041）

小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌（Yersinia enterocolitica）屬于腸桿菌科、耶爾森氏菌屬[1]。小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌是一種人畜共患病原菌，也是一種重要的食源性致病菌，很多國家都已將該菌列為進出口食品的常規(guī)檢測項目[2]。小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌可導(dǎo)致人和動物患急性腹瀉、腦膜炎、心肌炎等臨床疾病，極易感染免疫力低下的初生動物和嬰兒，對人和動物機體健康造成一定的威脅[3-4]。該菌具有廣泛的宿主性，傳播范圍廣、感染頻率高，可感染家畜、家禽、鳥類及昆蟲等[5]。該菌廣泛分布于自然界，在水、土壤、動物以及食物中均可被檢測出，可通過人、動物、食物、水源等介質(zhì)進行傳播，也是少數(shù)能在冷藏溫度下生長的腸道致病菌之一[4,6-8]。致病性小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌可能含有ystA、ystB、yadA和virF等多個毒力基因[9]。檢測位于染色體上的黏附侵襲位點基因ail可鑒定食品中致病性小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌，該方法被ISO/TS18867:2015等標準所采用[9]。intB基因是耶爾森氏菌屬所攜帶的耶爾森氏菌強毒力島（High-pathogenicity island，HPI）毒力基因中的一段基因，耶爾森氏菌侵襲蛋白（Invasin，inv）在致病性小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌中表達[10]。因此同時檢測ail、intB和inv基因可鑒定樣品中是否含有致病性小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌。

我國目前檢測動物和食品中致病菌的方法主要是傳統(tǒng)的微生物學(xué)檢測方法，雖然結(jié)果較為可靠，但具有檢測速度慢、程序復(fù)雜和成本高等缺點。因此，需要建立一種快速、準確、有效地檢測小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌的方法。快速檢測細菌的分子生物學(xué)檢測技術(shù)主要有常規(guī)PCR技術(shù)、多重PCR技術(shù)等。常規(guī)PCR技術(shù)主要是擴增細菌的一條特異性基因，而不同細菌間16S rDNA基因、23S rDNA基因序列具有一定同源性，這將對該檢測方法的特異性產(chǎn)生一定的影響[11-12]。多重PCR技術(shù)具有高效性、系統(tǒng)性、經(jīng)濟簡便性等特點，與常規(guī)PCR技術(shù)相比具有更高的特異性，被應(yīng)用于病原微生物的檢測和基因分型鑒定等方面，在細菌快速檢測方面也有著重要的臨床意義和廣泛的應(yīng)用前景[13-14]。本實驗室從病鯽魚心臟中鑒定出菌株fsznc-10，設(shè)計并建立一種可以快速、準確、有效的鑒定該菌的多重PCR方法，以期為防治和檢測由該菌引起的人和動物共患疾病的研究提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

患病魚 來源于四川省某養(yǎng)殖場發(fā)現(xiàn)的一批腹部輕微出血、腫脹、肛門紅腫的鯽魚；營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基 北京奧博星生物技術(shù)有限責任公司；CIN-1培養(yǎng)基及配套試劑、改良Y培養(yǎng)基 杭州微生物試劑有限公司；PremixTaq（TaKaRa Taq Ver.2.0 plus dye）、核酸分子量標準品（DL2000 Marker） 大連寶生生物有限公司；細菌基因組DNA提取試劑盒 天根生物有限公司；細菌生化鑒定管 杭州微生物試劑有限公司；標準革蘭氏染色試劑盒 北京雷根生物技術(shù)有限公司；假結(jié)核耶爾森氏菌（Yersinia pseudotuberculosis）、維氏氣單胞菌（Aeromonas veronii）、哈維氏弧菌（Vibrio harveyi）、門多薩假單胞菌（Pseudomonas mendocina）、霍亂弧菌（Vibrio cholerae）、嗜水氣單胞菌（Aeromonas hydrophila）、弗勞地枸櫞酸桿菌（Citrobacter freundii）、中間氣單胞菌（Aeromonas media）、糞腸球菌（Enterococcus faecalis）、大腸埃希氏菌（Escherichia coli）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、類志賀鄰單胞菌（Plesiomonas shigelloides）、霍氏腸桿菌（Enterobacter hormaechei）和無丙二酸枸櫞酸桿菌（Citrobacter amalonaticus） 均保藏于西南民族大學(xué)動物科學(xué)國家民委重點實驗室；85條健康成年鯽魚（516.05±20.04 g） 購自成都某市場。

ESJ200-4電子天平 沈陽龍騰電子有限公司；HZQ-X100恒溫振蕩培養(yǎng)箱 四川新科儀器有限公司；SteriLGARD IIIADVANCE生物安全柜 Baker公司；DHP-9052電熱恒溫培養(yǎng)箱 上海齊欣科學(xué)儀器有限公司；DHG-9203A高溫鼓風干燥箱 上海一恒科技有限公司；WGZ-2XJ細菌濁度計 上海昕瑞儀器儀表有限公司；DYY-6B穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀 北京市六一儀器廠；13395H2X生物顯微鏡 Leica公司；KW-1000DC恒溫水浴鍋 金壇市科析儀器有限公司；S1000 Thermal Cycler基因擴增儀、GEL DOC2000凝膠成像系統(tǒng) 伯樂公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 病料及處理 接種環(huán)無菌處理后，在病魚心臟取樣并接種于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基中，28 ℃恒溫培養(yǎng)18 h觀察。

1.2.2 菌株分離和生理生化鑒定 挑取1.2.1中外觀一致的單菌落，并對其進行細菌純化培養(yǎng)后轉(zhuǎn)入營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基培養(yǎng)，28 ℃、180 r/min培養(yǎng)18 h。采用革蘭氏染色法對細菌菌體進行染色，顯微鏡下觀察其顏色和形狀。采用細菌生化鑒定管進行生化鑒定，鑒定標準參照《伯杰細菌鑒定手冊》和《魚類及其他水生動物細菌實用鑒定指南》[15]。

1.2.3 細菌基因組DNA提取及16S rDNA序列分析

根據(jù)細菌基因組DNA提取試劑盒說明書，提取分離細菌總DNA。采用本實驗室使用的16S rDNA通用引物（F：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3' /R：5'-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3'），以提取的分離菌DNA作為模板進行PCR擴增，PCR產(chǎn)物純化回收后由生工生物工程（上海）股份有限公司進行雙向測序并拼接。將分離菌命名為fsznc-10，拼接后的16S rDNA序列提交至GenBank獲取登錄號，并在GenBank上進行BLAST序列比對，選取相似度較高的細菌16S rDNA基因序列，利用Mega 5.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。

1.2.4 分離菌毒力基因擴增 采用文獻[10]設(shè)計的ail、ystB、virF、yadA、intB5對毒力基因引物，由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。以提取的菌株fsznc-10 DNA作為模板進行PCR擴增。PCR產(chǎn)物經(jīng)2.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2.5 分離菌藥敏試驗 采用KB紙片擴散法，培養(yǎng)后的菌液用細菌濁度儀測量細菌濃度后無菌水調(diào)至到0.5麥氏，取100 μL涂布于Mueller-Hinton Agar培養(yǎng)基，35 ℃培養(yǎng)18 h后測量結(jié)果。藥物藥敏紙片規(guī)格及敏感程度判斷標準數(shù)據(jù)參照第28版CLSI標準。

1.2.6 分離菌致病性能驗證 將分離菌分別制備成濃度為3×103～3×108CFU/mL的菌懸液作為試驗組，10倍等比稀釋，共6個濃度梯度。選取60尾健康鯽魚，每濃度梯度10尾，分別腹腔注射0.1 mL菌懸液，另選取10尾健康鯽魚腹腔注射0.1 mL生理鹽水作對照，飼養(yǎng)7 d觀察發(fā)病和死亡情況，參照文獻[16]計算分離菌的半數(shù)致死量（LD50）。致病菌的再次分離采用改良Y選擇性培養(yǎng)基。

1.2.7 特異性引物設(shè)計及三重PCR擴增 利用表1中ail和intB毒力基因引物，并根據(jù)GenBank公布的小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌inv毒力基因設(shè)計的一對特異性引物（詳見表1）建立檢測分離菌（小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌）的三重PCR方法。取1.2.3中提取的fsznc-10細菌基因組DNA作為模板，用表1中的ail、intB和inv三對引物分別擴增。反應(yīng)總體系為25 μL，PremixTaq12.5 μL，上下游引物各1 μL，DNA模板1.0 μL，ddH2O9.5 μL。單重PCR反應(yīng)條件為94 ℃ 4 min；94 ℃ 45 s、（45～64 ℃）45 s、72 ℃ 40 s，30個循環(huán)；72 ℃ 5 min，確定三對引物的共同最佳退火溫度。三對引物按照1:1:1的比例進行三重PCR擴增，通過觀察目的條帶的亮度，調(diào)節(jié)對應(yīng)引物對的添加比例，以優(yōu)化各引物在三重PCR總反應(yīng)體系中的濃度。三重PCR退火溫度在45～64 ℃范圍的16個溫度梯度進行篩選，以確定三重PCR的最佳退火溫度。PCR均采用2.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2.8 特異性和敏感性試驗 采用細菌基因組DNA提取1.1中保存的各菌種的基因組作為模板，按照優(yōu)化后的反應(yīng)條件和反應(yīng)體系進行三重PCR擴增，以檢測該方法的特異性。測定菌株fsznc-10基因組DNA濃度后，用無菌去離子水對DNA樣品進行10倍倍比稀釋（100～109倍）后作為模板，按照優(yōu)化后的反應(yīng)條件進行三重PCR擴增。

1.2.9 三重PCR檢測法的臨床應(yīng)用 隨機選擇15個1.2.1中采集的發(fā)病和死亡鯽魚的心臟組織樣品，勻漿后進行細菌基因組DNA提取，采用本研究建立的三重PCR擴增，同時利用CIN-1培養(yǎng)基和改良Y培養(yǎng)基對各心臟組織中的細菌進行分離培養(yǎng)并進行16S rDNA序列分析，比較檢測結(jié)果。

表1 小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌毒力基因引物序列Table 1 Primers of the virulence genes in the Y. enterocolitic strains

1.3 數(shù)據(jù)處理

PCR擴增圖譜均有BioradChemiDoc MP凝膠成像系統(tǒng)產(chǎn)生，后由Adobe Photoshop 13.0處理。系統(tǒng)發(fā)育樹圖片由Mega 5.0軟件構(gòu)建，Adobe Photoshop 13.0處理。菌株生化鑒定和耐藥表型試驗均為三個重復(fù)組。

2 結(jié)果與分析

2.1 分離菌形態(tài)學(xué)和理化特性鑒定

將分離菌fsznc-10在營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基中28 ℃恒溫培養(yǎng)18 h后，菌落呈現(xiàn)為圓形，直徑1.0～3.2 mm，乳白色隆起，邊緣整齊，表面光滑濕潤。經(jīng)革蘭氏染色后，菌株為革蘭氏陰性短桿菌，多單個散在分布或排列成堆。分離菌fsznc-10的主要生理生化試驗結(jié)果表明分離菌株具有動力性，V-P試驗、β-半乳糖苷酶、過氧化氫酶實驗結(jié)果呈陽性，不利用枸椽酸鹽，不分解蔗糖、葡萄糖，不發(fā)酵鼠李糖、棉籽糖，還原硝酸鹽為亞硝酸鹽，不產(chǎn)H2S，部分菌株分解肌醇、七葉苷。參照《伯杰氏系統(tǒng)細菌鑒定手冊》[1]和《魚類及其他水生動物細菌實用鑒定指南》[15]，基本符合小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌的生化特性。

2.2 分離菌16S rDNA序列分析

分離菌16S rDNA的PCR擴增產(chǎn)物顯示其片段約為1500 bp（圖1）。測序結(jié)果顯示，分離菌株16S rDNA片段長度為1424 bp。將分離菌株16S rDNA基因序列提交到GenBank中獲得登錄號MN416303。16S rDNA基因的系統(tǒng)發(fā)育樹結(jié)果顯示，菌株fsznc-10與Yersinia enterocoliticaGM2402聚為一支（圖2），置信度為100。結(jié)合分離菌株形態(tài)學(xué)和理化特性，綜合判定菌株fsznc-10為小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌（Yersinia enterocolitica）。

圖1 分離菌16S rDNA基因PCR擴增結(jié)果Fig.1 PCR amplification results of 16S rDNA gene of the isolate strain

2.3 分離菌毒力基因擴增

經(jīng)PCR擴增的方法檢測分離菌株毒力基因結(jié)果顯示，菌株fsznc-10擴增出長度分別約為351、200、561和714 bp的條帶（圖3）。表明菌株fsznc-10攜帶ail、ystB、virF、intB毒力基因。

2.4 分離菌藥敏試驗

菌株fsznc-10對諾氟沙星、慶大霉素、多粘菌素B、阿米卡星和鏈霉素敏感，對頭孢曲松和復(fù)方新諾明中度敏感，對氨芐青霉素、呋喃唑酮和頭孢噻吩耐藥（表2）。表明可采用諾氟沙星、慶大霉素、多粘菌素、阿米卡星和鏈霉素防治由小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌引起的鯽魚疾病。

圖2 菌株fsznc-10 16S rDNA基因序列的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic tree of strain fsznc-10 16S rDNA gene sequence

2.5 分離菌致病性能驗證

經(jīng)腹部注射最高濃度（3 × 108CFU/mL）分離菌株的鯽魚，1 d后出現(xiàn)游動緩慢、反應(yīng)遲鈍的癥狀，部分病魚魚鰭基部、上下顎、眼球等部位略有出血點，約36 h開始出現(xiàn)死亡現(xiàn)象，72 h內(nèi)全部死亡，對照組未見異常或死亡魚。參照文獻[16]計算得出菌株fsznc-10的LD50為7.54×104CFU，表明菌株fsznc-10對鯽魚具有較強的致病性。從感染死魚的心臟中分離出的細菌在改良Y平板上呈現(xiàn)粉紅色、向上隆起、表面濕潤的特征菌落，經(jīng)16S rDNA序列分析鑒定為小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌。

圖3 毒力基因的PCR擴增結(jié)果Fig.3 PCR amplification of virulence gene

表2 藥敏實驗結(jié)果Table 2 Results of antibiotic sensitivity test

2.6 單一PCR和三重PCR擴增

3對毒力基因的單一PCR擴增結(jié)果顯示，分別擴增出了約300、500和700 bp的目的條帶，測序結(jié)果顯示各基因片段大小均與預(yù)期結(jié)果基本一致（圖4）。經(jīng)優(yōu)化，確定三重PCR最優(yōu)反應(yīng)體系為：Premix Taq 12.5 μL，ail上下游引物各1.5 μL，inv上下游引物各1.0 μL，intB上下游引物各0.5 μL，DNA模板2.0 μL，ddH2O 4.5 μL，總體系為25 μL。三重PCR最優(yōu)反應(yīng)條件為：94 ℃ 4 min；94 ℃ 45 s，50 ℃ 45 s，72 ℃ 40 s，共30個循環(huán)；72 ℃ 5 min。三重PCR擴增結(jié)果顯示，出現(xiàn)三條清晰條帶，且無其他雜帶，三對引物之間無干擾，擴增準確。

圖4 單一PCR與多重PCR擴增結(jié)果Fig.4 Results of single PCR and multiplex PCR amplifications

2.7 特異性和敏感性試驗結(jié)果

特異性試驗結(jié)果顯示，僅fsznc-10三重PCR擴增結(jié)果出現(xiàn)3條清晰目的條帶，片段大小分別約為351、520和714 bp，其他菌株均未擴增出三條目的條帶（圖5），表明所建立的三重PCR方法特異性較強。敏感性試驗結(jié)果顯示（圖6），菌株fsznc-10 DNA模板稀釋前的濃度為170.40 ng/μL，所建立的多重PCR檢測法檢測fsznc-10的最低模板濃度為1.704 × 10-6ng/μL，表明該方法敏感性較高。

圖5 三重PCR的特異性檢測Fig.5 Specificity detection of triple PCR

圖6 三重PCR的敏感性試驗結(jié)果Fig.6 Sensitivity test results of triple PCR

圖7 臨床樣品三重PCR檢測結(jié)果Fig.7 Triple PCR results of clinical samples

2.8 三重PCR檢測法的臨床應(yīng)用

采用本試驗建立的三重PCR方法對15個發(fā)病鯽魚心臟組織樣品進行檢測，結(jié)果顯示13個樣品呈陽性（圖7），陽性檢測率約為86.67%。另外，采用CIN-1培養(yǎng)基和改良Y培養(yǎng)基對上述各心臟組織中的細菌進行分離培養(yǎng)并進行16S rDNA序列分析，均得到了相同的結(jié)果。表明本試驗建立的三重PCR方法適合應(yīng)用于臨床樣品的檢測。

3 討論與結(jié)論

小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌作為一種食源性人畜共患致病菌，該菌的檢測具有重要的公共衛(wèi)生意義[17-18]。由該菌引起的臨床癥狀主要表現(xiàn)為急性腹痛、腹瀉、嘔吐等胃腸現(xiàn)象及結(jié)節(jié)性紅斑、關(guān)節(jié)炎、骨髓炎、肝炎、敗血癥等并發(fā)癥[19]。目前，已有研究人員從糞便、肉類食品等分離到小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌并檢測到一些毒力基因。許文炯等[20]、姜曉梅等[21]分別檢測到鮮肉樣品、人糞便中小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌均攜帶ail、ystA、ystB、yadA、virF等毒力因子。YadA、ail、intB、virF和inv毒力因子可介導(dǎo)膠原蛋白、纖粘蛋白和層粘連蛋白等結(jié)合從而增加細菌的粘附作用，還能減弱抗菌多肽對細菌的殺傷作用。YstB毒力因子是耶爾森氏菌引起腹瀉的重要原因之一。本試驗檢測到菌株fsznc-10攜帶ail、ystB、virF、intB毒力基因，未檢測到y(tǒng)adA，這與茍小蘭等[22]的檢測結(jié)果基本一致。結(jié)合毒力基因檢測和致病性能驗證試驗結(jié)果，表明該菌具有較強的致病性。

傳統(tǒng)檢測小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌的方法需通過中溫增菌培養(yǎng)、理化鑒定、血清學(xué)分析等一系列復(fù)雜過程，存在費時費力、操作繁瑣等特點，而且檢出率不高，不利于及時準確診斷小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌。目前報道的小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌檢測方法主要有熒光定量及酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)，這些方法不僅需要昂貴的儀器設(shè)備，而且對實驗人員的操作技能要求也較高，不利于普及運用[23]。隨著分子生物學(xué)的迅速發(fā)展，相關(guān)學(xué)者對小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌的毒力基因及致病機制有了更加深入細致的了解，這為從分子水平上鑒定小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌及評估菌株的毒力提供了理論基礎(chǔ)與技術(shù)支持。影響多重PCR檢測的效果的因素有很多，模板濃度、引物特異性和穩(wěn)定性等均可影響檢測效果。在目前的研究中，有多種形式的多重PCR檢測方法，如利用一條或多條保守基因的方法檢測一種或多種細菌、利用數(shù)條特異性基因同時檢測數(shù)種細菌等，此類方法通過一條特異性基因或多條非特異性基因（如16S rDNA和23S rDNA序列）來判斷樣品中是否含有目的細菌，但檢測方法的特異性和準確性欠佳[24-26]。本試驗采用三條毒力基因檢測一種細菌的方法，以提高所建立檢測法的特異性和準確性，在臨床應(yīng)用實驗中可檢測出100%含有小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌的樣品。該檢測方法具有特異性高、敏感性高、準確可靠的特點，并且可在2 h內(nèi)檢測出菌樣是否含有小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌，同時降低了鑒定細菌的成本。

綜上所述，本試驗從病鯽魚中分離出小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌，檢測該菌攜帶ail、ystB、virF、intB毒力基因，經(jīng)分離菌致病性能驗證試驗驗證了該菌為病原菌。利用ail、inv和intB三條毒力基因建立了一種快速、準確地檢測小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌的三重PCR方法，并檢測出該菌對諾氟沙星和慶大霉素等5種抗生素敏感。這為小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌的快速檢測及防控提供了科學(xué)資料。