羅鐵梅 于潔 安曦洲

（重慶醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院血液腫瘤科/國(guó)家兒童健康與疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心/兒童發(fā)育疾病研究教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/兒科學(xué)重慶市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶 401122）

急性巨核細(xì)胞白血?。╝cute megakaryocytic leukemia，AMKL） 是急性髓系白血病（acute myeloid leukemia，AML）的一個(gè)亞型，F(xiàn)AB分型為AML-M7型［1］，約占兒童AML 5%～15%［2-4］，發(fā)病中位年齡為1.4～2歲［2-3，5］。AMKL骨髓巨核細(xì)胞在光鏡下較難辨認(rèn)，可伴骨髓纖維化等原因易誤診［6］。根據(jù)患兒是否伴有唐氏綜合征（Down syndrome，DS），將AMKL分為DS-AMKL及非DSAMKL［7］。DS-AMKL患兒采用較低強(qiáng)度的單純化療即可實(shí)現(xiàn)持續(xù)完全緩解（complete remission，CR），其總生存（overall survival，OS） 率可達(dá)79%～91%［7-8］，而非DS-AMKL對(duì)標(biāo)準(zhǔn)化療反應(yīng)不佳，復(fù)發(fā)率高，OS率僅為53%～70%［2，5，9-11］。本研究根據(jù)白血病細(xì)胞形態(tài)學(xué)、免疫學(xué)、細(xì)胞遺傳學(xué)和分子生 物 學(xué) （morphology，immunology，cytogenetics，molecular biology，MICM）分型及微小殘留病（minimal resident disease，MRD）作為危險(xiǎn)度分級(jí)指標(biāo)，參考美國(guó)兒童腫瘤協(xié)作組AML方案［12］制定AML03方案，旨在分析AMKL患兒的臨床特點(diǎn)、療效及預(yù)后影響因素。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象

選取2011年5月至2019年12月間在我院診治的47例AMKL患兒為研究對(duì)象。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）年齡0～18歲，新診斷AMKL，外院未行化療治療；（2）經(jīng)骨髓涂片、骨髓活檢、免疫分型確診為AMKL，診斷標(biāo)準(zhǔn)為：骨髓原始細(xì)胞≥20%，其中50%以上為巨核細(xì)胞系或者原始細(xì)胞通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)和/或免疫組織化學(xué)染色至少表達(dá)一種血小板糖蛋白（CD41、CD61或CD42）［1］；（3）本研究經(jīng)重慶醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審查并批準(zhǔn)［（2015）年倫審（研）第（28-1）號(hào)］，治療前所有入組患兒家長(zhǎng)均簽署知情同意書。

1.2 臨床資料收集

對(duì)診斷為AMKL患兒自確診之日起進(jìn)行病歷資料收集及電話隨訪，隨訪終點(diǎn)時(shí)間為2020年6月1日。根據(jù)入組患兒年齡、性別，是否有肝脾、淋巴結(jié)腫大，初診血常規(guī)，MICM分型，早期治療反應(yīng)（骨髓細(xì)胞學(xué)及MRD結(jié)果），是否行異基因造血干細(xì)胞移植（allogeneic hematopoietic stem cell transplant，allo-HSCT）等因素進(jìn)行分組。

1.3 治療方案

AML03方案（中高危組）：

（1）誘導(dǎo)Ⅰ：ADE（10+3+5）方案：阿糖胞苷（cytosine arabinoside，Ara-C）200 mg/（m·2d）×10 d靜脈滴注；柔紅霉素 （daunorubicin，DNR）50 mg/（m·2d）×3 d靜脈滴注；依托泊苷（etoposide，VP16）100 mg/（m2·d）×5 d靜脈滴注。

（2）誘導(dǎo)Ⅱ：AM/AI方案：Ara-C 2 g/（m·2d）×4 d靜脈滴注；米托蒽醌12 mg/（m2·d）×4 d或伊達(dá)比星10 mg/（m2·d）×2 d靜脈滴注。

（3） 強(qiáng)化I：AE方案：Ara-C 2 g/（m2·d） ×5 d靜脈滴注；VP16 150 mg/（m2·d） ×5 d靜脈滴注。

（4） 強(qiáng)化II：AL方案：Ara-C 6 g/（m2·d）×4 d靜脈滴注；左旋門冬酰胺酶（L-asparaginase，L-Asp）：6 000 U/m2×2 d肌肉注射。

（5）神經(jīng)系統(tǒng)白血病防治：甲氨蝶呤（methotrexate，MTX）、地塞米松（dexamethasone，Dex）、Ara-C三聯(lián)鞘內(nèi)注射共4次（年齡＜1歲：MTX 6 mg、Dex 2.5 mg、Ara-C 15 mg； 年 齡1～＜3歲：MTX 9 mg、Dex 2.5 mg、Ara-C 25 mg；年齡≥3歲：MTX 12.5 mg、Dex 5 mg、Ara-C 35 mg）。

（6）造血干細(xì)胞移植：5例患兒獲CR后行allo-HSCT，其中1例為DS-AMKL患兒。3例行親緣人類白細(xì)胞抗原（human leukocyte antigen，HLA）不全相合allo-HSCT，1例行同胞HLA全相合allo-HSCT，1例行無(wú)關(guān)供者HLA全相合allo-HSCT。

1.4 療效及隨訪評(píng)估

骨髓檢查為治療評(píng)價(jià)主要指標(biāo)，在四療程化療前和/或化療后完善骨髓細(xì)胞學(xué)及MRD監(jiān)測(cè)。骨髓CR定義為：骨髓增生活躍或明顯活躍，骨髓白血病細(xì)胞＜5%。復(fù)發(fā)定義為：CR后任何時(shí)候外周血出現(xiàn)原始幼稚細(xì)胞或骨髓白血病細(xì)胞＞5%或出現(xiàn)髓外白血病。OS期定義為從確診之日開始到死亡或末次隨訪；無(wú)事件生存（event-free survival，EFS）期定義為從確診之日開始到發(fā)生任何事件（事件包括復(fù)發(fā)、死亡或發(fā)生二次腫瘤）。

1.5 MRD

初診時(shí)即采集骨髓使用流式細(xì)胞術(shù)對(duì)AML-MRD篩查標(biāo)記，化療后再采集骨髓送檢MRD（北京康圣環(huán)球公司），MRD陰性定義為：MRD＜0.1%。

1.6 MICM分型檢測(cè)

初診時(shí)需完善MICM分型檢查，具體方法如下：

（1）骨髓細(xì)胞形態(tài)學(xué)：骨髓細(xì)胞涂片行常規(guī)瑞氏染色，分析細(xì)胞形態(tài)及細(xì)胞化學(xué)染色特點(diǎn)。

（2）免疫分型檢測(cè)：采用流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行免疫分型檢測(cè)。

（3）染色體核型檢測(cè)：采用G顯帶技術(shù)進(jìn)行核型分析。

（4）融合基因檢測(cè)：抽取骨髓用乙二胺四乙酸抗凝后行多重巢式逆轉(zhuǎn)錄-聚核酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（reverse transcription-polymerase chain reaction，RTPCR）檢測(cè)。

（5）基因突變檢測(cè)：采用RT-PCR、PCR和/或二代測(cè)序技術(shù)，篩選并記錄與白血病發(fā)病或預(yù)后相關(guān)的突變基因。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 25.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，正態(tài)分布計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，非正態(tài)分布計(jì)量資料以中位數(shù)（范圍）表示；計(jì)數(shù)資料使用百分率（%）表示。采用Kaplan-Meier生存分析及l(fā)og-rank檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般臨床資料

47例AMKL患兒中，男21例，女26例，男女比例為1∶1.2。發(fā)病中位年齡為22.2（4.6～104.8）個(gè)月?；純撼踉\臨床癥狀和體征：出血為87%（41/47），發(fā)熱為64%（30/47），貧血為96%（45/47），肝臟腫大（≥2 cm）為64%（30/47），脾臟腫大為45%（21/47），淋巴結(jié)腫大為38%（18/47），骨浸潤(rùn)為19%（9/47），有3例患兒伴骨髓纖維化。血常規(guī)提示血紅蛋白（Hb）為79（24～118）g/L， 白 細(xì) 胞 （WBC） 計(jì) 數(shù) 為13.5（2.3～153.8） ×109/L，血小板 （PLT） 計(jì)數(shù)為23（7～271）×109/L，31例患兒外周血發(fā)現(xiàn)幼稚細(xì)胞，幼稚細(xì)胞的百分比為16%（0%～77%）。

2.2 MICM結(jié)果

47例AMKL患兒的骨髓涂片結(jié)果顯示原始及幼稚巨核細(xì)胞/原始細(xì)胞的中位數(shù)為55.5%（7.0%～86.5%）。幼稚巨核細(xì)胞形態(tài)特點(diǎn)為：胞體大小不等，邊緣不齊，呈云霧狀或粗毛刺狀，胞漿呈深藍(lán)色不透明，著色不均，可見(jiàn)偽足樣突起，部分可見(jiàn)少許顆粒，核染色質(zhì)疏松網(wǎng)狀，核仁不清，部分原巨核細(xì)胞邊緣有產(chǎn)生PLT現(xiàn)象，或伴有網(wǎng)狀纖維增生。95.3%過(guò)氧化物酶染色為陰性。

31例患兒白血病免疫分型結(jié)果分析：CD41陽(yáng)性占81%（25/31），CD61陽(yáng)性占50%（15/30），CD42陽(yáng)性占62%（13/21），CD36陽(yáng)性占68%（21/31），CD117陽(yáng)性占68%（21/31），CD13陽(yáng)性占52%（16/31），CD33陽(yáng) 性占77%（24/31），CD56陽(yáng)性占32%（10/31），HLA-DR陽(yáng)性占52%（16/31）。

35例患兒初診時(shí)染色體核型結(jié)果分析：正常核型11例（31%）、超二倍體12例（34%）、假二倍體9例（26%）、低二倍體3例（9%）。常見(jiàn)染色體數(shù)目異常有：伴+21染色體核型9例（26%），伴+8染色體、+19染色體核型各4例（11%），伴+10染色體、+22染色體、-16染色體核型各3例（9%）。有3種以上染色體異常的復(fù)雜核型9例（26%）。

29例患兒行RT-PCR檢查顯示，僅EVI1融合基因陽(yáng)性13例（45%），EVI1合并MLL融合基因、TLS-ERG融合基因各1例（3%）。24例患兒完善與AML相關(guān)突變基因檢測(cè)，13例患兒結(jié)果提示異常，常合并多個(gè)基因突變。攜帶ASXL1突變基因10例（41.7%），攜帶WT1突變基因、TET突變基因各5例（20.8%），攜帶TP53突變基因4例（16.7%），其余突變基因有：CEBPA、GATA、JKA2、NRAS、DNMT3A、RUNX1、CTCF、KMT2C、SF3B1基因。

2.3 治療結(jié)果

47例患兒中，診斷后23例未接受AML03方案治療，余24例患兒的中位隨訪時(shí)間為11.6（0.4～45.0）個(gè)月，其中2例中途放棄治療，2例失訪；2例為DS-AMKL患兒，其中1例移植后存活38.0個(gè)月，另1例完成化療16.5個(gè)月后復(fù)發(fā)死亡。22例非DS-AMKL患兒行AML03方案（中高危組）化療，2例在誘導(dǎo)緩解Ⅰ階段死亡，未行骨髓細(xì)胞學(xué)、MRD檢查，誘導(dǎo)Ⅰ、Ⅱ后骨髓細(xì)胞學(xué)緩解率分別為70%（14/20）、85%（17/20）；3例患兒誘導(dǎo)Ⅰ后未行MRD檢查，1例誘導(dǎo)Ⅱ后未行MRD檢查，誘導(dǎo)Ⅰ、Ⅱ后MRD陰性率分別為41%（7/17）、79%（15/19）。22例非DS-AMKL患兒2年OS率為50%±13%，2年EFS率為40%±12%（圖1）；截至隨訪終點(diǎn)時(shí)間，2例失訪，8例復(fù)發(fā)，復(fù)發(fā)率為36%（8/22），復(fù)發(fā)中位時(shí)間為9.3（5.9～15.0）個(gè)月，其中7例骨髓復(fù)發(fā)，1例髓外復(fù)發(fā)；9例患兒死亡，病死率為41%（9/22），其中5例為疾病進(jìn)展死亡，4例為治療相關(guān)死亡。

2.4 預(yù)后危險(xiǎn)因素

生存分析發(fā)現(xiàn)，非DS-AMKL患兒性別、年齡、淋巴結(jié)腫大、肝脾大及初診WBC計(jì)數(shù)對(duì)OS率及EFS率的影響差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）?；純盒衋llo-HSCT與單純化療相比，2年OS率和EFS率更低，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)表1。

圖1 AML03方案治療22例非DS-AMKL患兒的生存曲線

表1 22例非DS-AMKL患兒遠(yuǎn)期生存的危險(xiǎn)因素分析

對(duì)細(xì)胞免疫分型進(jìn)行生存分析結(jié)果顯示，CD56陽(yáng)性患兒2年的OS率（P=0.008）和EFS率（P=0.003）低于陰性患兒（表2、圖2）。染色體核型（包括高二倍體、假二倍體、正常核型、伴+21染色體、復(fù)雜核型），EVI1融合基因、TET2突變基因、AXSL1突變基因、WT1突變基因?qū)S率及EFS率影響差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)表2。

對(duì)早期治療反應(yīng)情況進(jìn)行生存分析：誘導(dǎo)Ⅰ后骨髓細(xì)胞學(xué)及MRD結(jié)果對(duì)OS率及EFS率影響差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。誘導(dǎo)Ⅱ后骨髓細(xì)胞學(xué)緩解與未緩解相比，患兒2年OS率（P=0.011）和EFS率（P=0.005）更高；誘導(dǎo)Ⅱ后MRD陰性與陽(yáng)性相比，患兒2年EFS率（P=0.007）更高。見(jiàn)表3和圖3。

表2 22例非DS-AMKL患兒MICM分型對(duì)遠(yuǎn)期生存的危險(xiǎn)因素分析

表3 22例非DS-AMKL患兒早期治療反應(yīng)對(duì)遠(yuǎn)期生存的危險(xiǎn)因素分析

圖2 CD56陽(yáng)性與陰性非DS-AMKL患兒的生存曲線

圖3 誘導(dǎo)Ⅱ后骨髓細(xì)胞學(xué)及MRD對(duì)非DS-AMKL患兒生存曲線的影響

3 討論

兒童AMKL發(fā)病年齡多小于3歲，女童稍多，我院AMKL約占AML（除外急性早幼粒細(xì)胞白血?。?0.1%［13］。臨床以發(fā)熱、貧血、出血及肝大為主要表現(xiàn)，淋巴結(jié)腫大和脾大比例不高，初診時(shí)PLT計(jì)數(shù)低于其他急性白血病亞型，結(jié)果與其他研究報(bào)道相似［2-3，10］。AML03方案治療非DS-AMKL結(jié)果提示91例患兒3年OS率和EFS率分別為70%±6%、54%±7%［13］，相比之下，AMKL預(yù)后稍差。國(guó)內(nèi)有研究結(jié)果顯示非DS-AMKL患兒（n=22）治療后2年OS率及EFS率分別僅為36%±13%、22%±11%［14］，國(guó)外近幾年研究結(jié)果顯示非DS-AMKL患兒OS率可達(dá)52.6%～70.0%，EFS率為30.9%～57.0%［2，5，9-11］，提示本研究應(yīng)用AML03方案治療非DS-AMKL療效接近國(guó)際水平。

AMKL患兒可伴骨髓纖維化，導(dǎo)致部分患兒骨髓涂片原始細(xì)胞比例不足20%，且部分細(xì)胞形態(tài)難以辨別，利用MICM分型及其特異性免疫表型標(biāo)志物協(xié)助診斷尤為重要。目前國(guó)內(nèi)外報(bào)道伴CD36陽(yáng)性患兒預(yù)后更好［14-15］，本研究顯示CD36陽(yáng)性與陰性患兒預(yù)后無(wú)差異。有研究表示AML患兒CD56表達(dá)水平高于成人［16］，體外實(shí)驗(yàn)顯示CD56陽(yáng)性與CBFA2T3-GLIS2融合基因相關(guān)［17］，攜帶該融合基因在非DS-AMKL患兒中復(fù)發(fā)率高、預(yù)后差［4，11］。本研究未檢測(cè)該融合基因，但CD56陽(yáng)性患兒OS率及EFS率也明顯低于陰性患兒，提示CD56陽(yáng)性可能與預(yù)后不良相關(guān)。

遺傳細(xì)胞學(xué)對(duì)AMKL預(yù)后的影響是目前國(guó)內(nèi)外研究熱點(diǎn)，DS患兒患AMKL的風(fēng)險(xiǎn)是非DS患兒的500倍，但預(yù)后好［7-8］。本研究中有2例DS-AMKL患兒，占8.3%（2/24），樣本量少未做進(jìn)一步分析。也有研究報(bào)道伴+21染色體核型是非DS-AMKL預(yù)后的良好因素［2］，本研究中6例伴+21染色體核型患兒OS率及EFS率卻低于不伴+21染色體核型患兒，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，可能由于樣本量少引起結(jié)果偏差。

患兒早期的治療反應(yīng)也與預(yù)后效果密切相關(guān)，非DS-AMKL患兒骨髓細(xì)胞學(xué)緩解率較其他AML亞型稍差［2，13，18］。BFM98及BFM04方案結(jié)果顯示誘導(dǎo)緩解后骨髓細(xì)胞學(xué)緩解患兒的預(yù)后明顯優(yōu)于未緩解患兒，其5年OS率分別為66%±6%vs 35%±11%［2］，而本研究中誘導(dǎo)Ⅱ后骨髓細(xì)胞學(xué)緩解患兒2年EFS率、OS率也明顯高于未緩解組，提示早期治療反應(yīng)的骨髓細(xì)胞學(xué)結(jié)果與預(yù)后密切相關(guān)。AML患兒誘導(dǎo)化療后骨髓MRD＜0.1%的預(yù)后顯著優(yōu)于MRD≥0.1%［9，19］，但國(guó)外 研究結(jié)果未 顯示MRD對(duì)非DS-AMKL預(yù)后有顯著差異［5］。本研究結(jié)果不僅顯示誘導(dǎo)Ⅱ后MRD陰性患兒的OS率及EFS率更好，也為MRD預(yù)測(cè)遠(yuǎn)期預(yù)后提供重要依據(jù)。

近年來(lái)隨著化療方案的優(yōu)化，CR后行allo-HSCT與單純化療相比，兩者的遠(yuǎn)期預(yù)后是否存在差異仍有爭(zhēng)議［2，11，14，20］，本研究結(jié)果雖顯示OS率及EFS率均無(wú)差異，但allo-HSCT的OS率及EFS率更低是由于4例非DS-AMKL移植患兒中，1例復(fù)發(fā)死亡，1例因感染性休克死亡，分析認(rèn)為雖然allo-HSCT具有比化療更強(qiáng)的抗白血病潛能，但是治療相關(guān)死亡可能部分抵消其療效。這些研究結(jié)果受到allo-HSCT樣本量較少的影響，結(jié)論有待于進(jìn)一步證實(shí)。

本研究作為回顧性研究，且隨訪時(shí)間較短，結(jié)果可能存在偏差，未來(lái)需進(jìn)一步行大樣本、多中心、長(zhǎng)時(shí)間的前瞻性研究，從而才能更加深入對(duì)兒童AMKL的認(rèn)識(shí)。

利益沖突聲明：所有作者均聲明不存在利益沖突。