張 悅,田錫煒,莊英萍,3

(1.華東理工大學(xué)生物工程學(xué)院,上海 200237; 2.華東理工大學(xué)發(fā)酵工程實驗教學(xué)示范中心,上海 200237; 3.華東理工大學(xué)生物反應(yīng)器工程國家重點實驗室,上海 200237)

乳酸是一種天然存在的有機(jī)酸,其廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、化工、化妝品、材料等眾多行業(yè)[1-2]。由于乳酸的分子結(jié)構(gòu)中有一個手性的碳原子,因此乳酸有兩種光學(xué)結(jié)構(gòu),其中L-乳酸被認(rèn)為是安全無害的[3-4]。目前,有80%以上的乳酸作為風(fēng)味劑、pH調(diào)節(jié)劑、酸化劑以及防腐劑等被用于食品工業(yè)中,這也大大增加了食品市場對L-乳酸的需求,因此,如何實現(xiàn)L-乳酸發(fā)酵過程的高效生產(chǎn)一直是研究的熱點。

雖然已有報道多種微生物能夠生產(chǎn)乳酸[5-8],但是商業(yè)乳酸生產(chǎn)主要通過乳酸菌發(fā)酵來實現(xiàn)[9]。擬干酪乳桿菌是一種潛在的工業(yè)乳酸生產(chǎn)菌,其具有良好的乳酸生產(chǎn)能力,能夠在高初始葡萄糖濃度的條件下高效生產(chǎn)L-乳酸[10-12]。通過Luedeking-Piret模型對乳酸發(fā)酵過程進(jìn)行模擬后發(fā)現(xiàn),其產(chǎn)物合成與生長相關(guān)系數(shù)要大于非生長相關(guān)系數(shù),因此乳酸菌代謝葡萄糖生產(chǎn)乳酸的過程被認(rèn)為是一個與細(xì)胞生長非常相關(guān)的過程[13-15]。批發(fā)酵模式是最常用的乳酸生產(chǎn)方式,但是在實際乳酸發(fā)酵過程中往往會出現(xiàn)發(fā)酵結(jié)束時菌體代謝活力仍很高的情況,因此這也就為后續(xù)較高密度細(xì)胞再發(fā)酵提供了可行性。高密度發(fā)酵能夠有效增加細(xì)胞對底物的轉(zhuǎn)化,同時在消耗少量營養(yǎng)物質(zhì)的情況下,提高底物轉(zhuǎn)化率,并減少發(fā)酵罐清洗、種子制備、細(xì)胞生長等一系列輔助時間,從而提升發(fā)酵罐的體積產(chǎn)率和生產(chǎn)效率[16-20]。因此,在乳酸發(fā)酵過程中,可以利用批發(fā)酵結(jié)束時細(xì)胞高活性的特點,形成靜息細(xì)胞的高密度發(fā)酵策略,從而實現(xiàn)乳酸生產(chǎn)效率的提高。

本研究通過考察擬干酪乳桿菌非生長狀態(tài)下細(xì)胞代謝葡萄糖生產(chǎn)乳酸的能力,以及利用高細(xì)胞密度開發(fā)偶聯(lián)細(xì)胞生長和細(xì)胞非生長相關(guān)的乳酸組合生產(chǎn)新模式,從而提高產(chǎn)物生成速率以及底物利用速率、轉(zhuǎn)化率,實現(xiàn)乳酸高效生產(chǎn)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

擬干酪乳桿菌(LactobacillusparacaseiNCBIO-01) 國家生化工程技術(shù)研究中心(上海)保藏菌株;葡萄糖 上海泰坦科技股份有限公司;蛋白胨(Peptone)、酵母提取物(Yeast Extract) Oxoid;牛肉提取物(Beef Extract) 生工生物工程(上海)股份有限公司;其他試劑 來源于國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

5 L攪拌式生物反應(yīng)器 上海國強(qiáng)生化工程裝備有限公司;pH和溶氧(DO)電極 美國梅特勒-托利多公司;752紫外可見分光光度計 上海菁華科技儀器有限公司;SBA-40D生化分析儀 山東省科學(xué)院;FM-8P全自動冰點滲透壓計 上海醫(yī)大儀器廠;高效液相色譜柱(Metacarb H柱)、安捷倫1100高效液相色譜儀 美國安捷倫公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 培養(yǎng)基成分 種子培養(yǎng)基(g/L):蛋白胨10,牛肉提取物10,酵母提取物10,檸檬酸氫二銨2,磷酸氫二鈉2,無水乙酸鈉4,硫酸鎂0.2,硫酸錳0.2,氯化鈉0.03,硫酸鐵0.01,碳酸鈣25,吐溫-80 1 mL/L,氫氧化鈉調(diào)節(jié)初始培養(yǎng)基pH為6.0,115 ℃滅菌20 min,葡萄糖溶液(40 g/L)與其他成分分開配制,115 ℃滅菌20 min。發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L):蛋白胨 13.33,酵母提取物 13.33,無水乙酸鈉 0.67,硫酸鎂 0.0133,硫酸錳 0.0133,氯化鈉 0.0133,硫酸鐵 0.0133,115 ℃滅菌20 min。葡萄糖溶液與其他成分分開配制,115 ℃滅菌20 min。

1.2.2 培養(yǎng)條件 種子培養(yǎng):用50 mL無菌水將新鮮茄子瓶斜面中的菌體懸浮,取15 mL懸浮液接種于85 mL種子培養(yǎng)基中,在37 ℃,110 r/min培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h;搖瓶發(fā)酵培養(yǎng):將20 mL種子培養(yǎng)液接種于80 mL發(fā)酵培養(yǎng)基中,接種量為20%,250 mL三角搖瓶置于37 ℃,110 r/min培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h,發(fā)酵初始加入25 g/L碳酸鈣調(diào)節(jié)過程pH;5 L罐發(fā)酵培養(yǎng):發(fā)酵過程中工作體積為4 L,接種量為20%,溫度和轉(zhuǎn)速分別為37 ℃和150 r/min,通氣量為0.125 vvm。發(fā)酵過程通過自動反饋不斷補入25%(w/w)氨水溶液作為中和劑維持過程pH為6.0。

1.2.3 不同初糖濃度下L-乳酸生產(chǎn) 在5 L發(fā)酵罐中配制不同濃度初始葡萄糖(100、120、140、160、180 g/L),進(jìn)行擬干酪乳桿菌L-乳酸生產(chǎn)發(fā)酵,考察細(xì)胞生長、葡萄糖消耗和L-乳酸生產(chǎn)情況。

1.2.4 不同靜息細(xì)胞濃度下L-乳酸生產(chǎn) 將擬干酪乳桿菌細(xì)胞在5 L發(fā)酵罐中培養(yǎng)14 h后,離心(0 ℃,10000 r/min)3 min,獲得穩(wěn)定期靜息細(xì)胞菌體。菌體用葡萄糖溶液進(jìn)行重懸,使得溶液中細(xì)胞濃度分別為2.35、4.69、7.43、9.36、11.94、14.12、16.47、18.55 g/L。在100 mL搖瓶考察中,配制初始葡萄糖濃度為60 g/L;在5 L發(fā)酵罐考察中,初始葡萄糖濃度分別配制為80、100、120、140 g/L。搖瓶中添加10 g/L碳酸鈣作為中和劑,發(fā)酵罐中通過不斷補入25%(w/w)氨水溶液維持pH在6.0。

1.2.5 高滲條件下靜息細(xì)胞生產(chǎn)L-乳酸 在5 L發(fā)酵罐中(60 g/L初始葡萄糖),以1 mol/L NaCl作為高滲條件,考察穩(wěn)定期(發(fā)酵14 h后)靜息細(xì)胞(4.36 g/L)在添加高滲條件和未添加高滲條件下,細(xì)胞葡萄糖消耗和L-乳酸生產(chǎn)的情況。培養(yǎng)過程中,通過自動反饋不斷補入25%(w/w)氫氧化鈣溶液維持pH在6.0。

1.2.6 細(xì)胞生長和非生長相關(guān)組合的L-乳酸高效生產(chǎn) 同時在兩個5 L發(fā)酵罐中(140 g/L初始葡萄糖)進(jìn)行擬干酪乳桿菌生產(chǎn)L-乳酸批發(fā)酵(第一階段)。待批發(fā)酵結(jié)束后,通過離心(0 ℃,10000 r/min,3 min),用100 g/L葡萄糖溶液將菌體重懸并合并在一起,繼續(xù)進(jìn)行靜息細(xì)胞的L-乳酸生產(chǎn)(第二階段),直至葡萄糖降零后結(jié)束。

1.2.7 細(xì)胞生物量測定 用稀鹽酸稀釋發(fā)酵液至一定濃度,以稀鹽酸作為對照,在紫外可見分光光度計下測定620 nm 波長時的吸光值,使得測定的光密度值(OD)處于0.2～0.8之間。細(xì)胞生物量通過細(xì)胞干重(DCW)來表示,兩者關(guān)系為:1 OD相當(dāng)于0.41 g/L DCW。

1.2.8 發(fā)酵液L-乳酸和葡萄糖測定 取一定量發(fā)酵液在5000 r/min條件下離心10 min,棄去菌體,稀釋上清液使得葡萄糖和L-乳酸濃度分別處于1和0.5 g/L以下。L-乳酸和葡萄糖濃度通過SBA-40C生物傳感分析儀進(jìn)行測定。

1.2.9 發(fā)酵液滲透壓測定 將發(fā)酵液稀釋一定倍數(shù),使得測定樣品的滲透壓處于300～800 mOsm/kg之間,再通過FM-8P全自動冰點滲透壓計進(jìn)行發(fā)酵液滲透壓的測定。

1.2.10 葡萄糖消耗速率計算方法 根據(jù)一定時間內(nèi)發(fā)酵液中葡萄糖濃度的變化量計算得到此時間內(nèi)葡萄糖消耗速率,具體公式如下:

rs=(S1-S2)/(t2-t1)

式中:rs表示葡萄糖消耗速率,g/L/h;S1和S2分別表示t1和t2時刻發(fā)酵液中葡萄糖濃度,g/L。

1.2.11 L-乳酸生產(chǎn)速率計算方法 根據(jù)一定時間內(nèi)發(fā)酵液中L-乳酸的含量計算得到此時間內(nèi)L-乳酸生產(chǎn)速率,具體公式如下:

rp=(P2-P1)/(t2-t1)

式中:rp表示L-乳酸生產(chǎn)速率,g/L/h;P1和P2分別表示t1和t2時刻發(fā)酵液中L-乳酸濃度,g/L。

1.2.12 L-乳酸比生產(chǎn)速率計算方法 根據(jù)一定時間內(nèi)細(xì)胞生產(chǎn)L-乳酸的量以及菌體的濃度計算得到此時間內(nèi)L-乳酸比生產(chǎn)速率,具體公式如下:

Qp=(P2-P1)/(t2-t1)/X

式中:Qp表示比生產(chǎn)速率,g/g/h;P1和P2分別表示t1和t2時刻發(fā)酵液中L-乳酸濃度,g/L;X表示菌體濃度,g/L。

1.2.13 L-乳酸轉(zhuǎn)化率計算方法 根據(jù)一定時間內(nèi)發(fā)酵液中葡萄糖濃度和L-乳酸濃度的變化計算得到此時間內(nèi)L-乳酸轉(zhuǎn)化率,具體公式如下:

Yp=(P2-P1)/(S1-S2)

式中:Yp表示L-乳酸轉(zhuǎn)化率,g/g;P1、P2、S1和S2分別表示t1和t2時刻發(fā)酵液中L-乳酸濃度和葡萄糖濃度,g/L。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同初始葡萄糖濃度下擬干酪乳桿菌生產(chǎn)L-乳酸

葡萄糖作為擬干酪乳桿菌生產(chǎn)L-乳酸的底物,其濃度的高低決定著最終L-乳酸的產(chǎn)量以及整體發(fā)酵過程的生產(chǎn)效率[21-22]。從圖1A可以看出,雖然初始葡萄糖濃度從100 g/L增加到180 g/L,但是細(xì)胞的生長并未受到葡萄糖濃度的影響,生長期均為12 h左右,而且最大生物量也相差不大。從L-乳酸合成以及葡萄糖的消耗變化圖來看(圖1B和C),發(fā)現(xiàn)只有當(dāng)初始葡萄糖濃度在140 g/L以下時,菌體能夠在較短時間內(nèi)完全耗盡葡萄糖,并生成L-乳酸,且整體生產(chǎn)效率相差不大。當(dāng)初始葡萄糖濃度為160 g/L時,雖然菌體在發(fā)酵前中期表現(xiàn)出近似低初始葡萄糖濃度下的生產(chǎn)能力,但是在發(fā)酵后期無法完全耗盡葡萄糖(圖1B和C),這是因為氨水作為中和劑時,高初始葡萄糖濃度條件下發(fā)酵后期菌體會受到嚴(yán)重的高滲應(yīng)激,因此影響葡萄糖代謝和L-乳酸生產(chǎn);此外,180 g/L初始葡萄糖濃度條件下,菌體不但在發(fā)酵后期受到強(qiáng)烈的高滲應(yīng)激,其中前期發(fā)酵可能也受限于高底物濃度抑制,呈現(xiàn)出相對緩慢的生產(chǎn)能力(圖1B和C)。另一方面,雖然乳酸菌生產(chǎn)乳酸過程被認(rèn)為是一個與生長非常相關(guān)的過程,但是從生產(chǎn)速率來看,初始葡萄糖濃度低于140 g/L條件下,發(fā)酵結(jié)束時,菌體仍表現(xiàn)出非常強(qiáng)的代謝活性,因此,在接下來的實驗中,考察了不同穩(wěn)定期靜息細(xì)胞濃度生產(chǎn)L-乳酸的能力,為后續(xù)進(jìn)一步開發(fā)偶聯(lián)細(xì)胞生長和細(xì)胞非生長相關(guān)的乳酸組合生產(chǎn)新模式提供理論和數(shù)據(jù)支撐。

圖1 初始葡萄糖濃度對擬干酪乳桿菌生長(A)、 L-乳酸生產(chǎn)(B)和葡萄糖消耗(C)的影響Fig.1 Effects of different initial glucose concentrations on cell growth(A),L-lactic acid production(B) and glucose consumption(C)of L. paracasei

2.2 不同穩(wěn)定期靜息細(xì)胞濃度生產(chǎn)L-乳酸能力

通過在5 L發(fā)酵罐(140 g/L初始葡萄糖濃度)中培養(yǎng)細(xì)胞至穩(wěn)定期(14 h),冷凍離心獲取菌體后,在搖瓶(60 g/L初始葡萄糖濃度)中配制成不同細(xì)胞濃度(2.35、4.69、7.43、9.36、11.94、14.12、16.47、18.55 g/L)進(jìn)行L-乳酸生產(chǎn)能力考察。從圖2A和C可以看出,在起始的2 h內(nèi),L-乳酸產(chǎn)量與細(xì)胞濃度呈線性關(guān)系,這也說明此階段內(nèi)菌體比生產(chǎn)速率基本維持不變,但是隨著時間的增加,較低細(xì)胞濃度仍能維持與初始階段一致的比生產(chǎn)速率,而高細(xì)胞濃度的比生產(chǎn)速率則明顯下降,這更有可能是由于高細(xì)胞濃度在前期會產(chǎn)生高濃度的乳酸[23],因此發(fā)酵液中高濃度產(chǎn)物會明顯抑制菌體的代謝,而不是隨著時間的增加,細(xì)胞代謝活性下降[24-25]。在接下來的實驗中,將在5 L發(fā)酵罐中對高細(xì)胞濃度(18.55 g/L)進(jìn)行L-乳酸生產(chǎn)能力考察,確定影響菌體代謝能力的時間范圍。

在圖2B中,初始葡萄糖濃度為80和100 g/L時,菌體能夠非?？焖俚叵耐晁械钠咸烟?5和6.4 h),并生成L-乳酸,其葡萄糖消耗速率和L-乳酸生成速率分別為16.0、15.8 g/(L·h)和15.6、15.3 g/(L·h)。雖然初始葡萄糖濃度120和140 g/L條件下菌體也能完全耗盡所有葡萄糖(9和15 h),但是其葡萄糖消耗速率和L-乳酸生成速率分別較100 g/L條件時下降15.8%、41.8%和17.0%、43.3%。這些實驗結(jié)果表明穩(wěn)定期靜息細(xì)胞能夠在6 h左右內(nèi)仍維持很高的代謝活性,而且完全耗盡100 g/L的初始葡萄糖,生成98 g/L的L-乳酸。

圖2 不同濃度靜息細(xì)胞在搖瓶(A)和5 L發(fā)酵罐(B)中 代謝能力的考察以及搖瓶中比生產(chǎn)速率的比較(C)Fig.2 Study of metabolic capacity of resting cells in shake flask(A)and 5 L bioreactor(B),and comparison of specific L-lactic acid productivity in shake flask(C)

2.3 高滲條件對穩(wěn)定期靜息細(xì)胞生產(chǎn)L-乳酸的影響

為了進(jìn)一步探索6 h以后細(xì)胞代謝活性下降的原因,在搖瓶中考察了高滲環(huán)境對穩(wěn)定期靜息細(xì)胞生產(chǎn)L-乳酸的能力(圖3)。從圖3B中可以看出,高滲條件下環(huán)境滲透壓為2200 mOsm/kg左右,與上述100 g/L初始葡萄糖濃度條件下發(fā)酵結(jié)束時環(huán)境滲透壓相當(dāng),而圖3A則表明高滲條件并不會對穩(wěn)定期靜息細(xì)胞量以及初期細(xì)胞代謝產(chǎn)生影響,但是隨著發(fā)酵的進(jìn)行(6 h以后),細(xì)胞的代謝能力明顯下降。因此,在后續(xù)開發(fā)偶聯(lián)細(xì)胞生長和細(xì)胞非生長相關(guān)的乳酸組合生產(chǎn)新模式過程中,將在第一階段采用140 g/L初始葡萄糖濃度進(jìn)行兩個平行罐的發(fā)酵,當(dāng)其發(fā)酵結(jié)束后,將兩個罐細(xì)胞通過離心收集后繼續(xù)進(jìn)行第二階段發(fā)酵(100 g/L初始葡萄糖濃度),從而減少一系列發(fā)酵輔助時間,提高生產(chǎn)效率和生產(chǎn)能力。

圖3 高滲環(huán)境對靜息細(xì)胞代謝能力的影響Fig.3 Effect of high osmolality on metabolic capacity of resting cells

2.4 細(xì)胞生長和非生長相關(guān)組合的L-乳酸高效生產(chǎn)

在擬干酪乳桿菌發(fā)酵生產(chǎn)L-乳酸過程中,只要調(diào)節(jié)初始葡萄糖濃度在140 g/L范圍內(nèi),細(xì)胞就能快速地耗完所有葡萄糖,并且發(fā)酵結(jié)束時細(xì)胞在一定時間范圍內(nèi)(6～7 h)仍有很強(qiáng)的代謝活性,因此可用于穩(wěn)定期靜息細(xì)胞的發(fā)酵,從而提高發(fā)酵過程整體生產(chǎn)效率。從圖4中可以看出,在第一階段,兩批平行發(fā)酵能夠很快地耗盡140 g/L左右初始葡萄糖,產(chǎn)生近126 g/L的L-乳酸,其葡萄糖消耗速率和L-乳酸生產(chǎn)速率分別為6.3 g/(L·h)和5.9 g/(L·h),L-乳酸轉(zhuǎn)化率為0.940 g/g。當(dāng)?shù)谝浑A段結(jié)束后,將兩批平行發(fā)酵罐菌體通過離心合并繼續(xù)進(jìn)行靜息細(xì)胞發(fā)酵,此時初始葡萄糖濃度為102 g/L。由于此時細(xì)胞濃度為第一階段單個發(fā)酵罐生物量的1.7倍左右,菌體能夠在7 h內(nèi)耗盡所有的葡萄糖,生成98 g/L的L-乳酸,其葡萄糖消耗速率、L-乳酸生產(chǎn)速率和L-乳酸轉(zhuǎn)化率分別達(dá)到了14.6、14.4 g/(L·h)和0.985 g/g。由此可知,雖然處理穩(wěn)定期靜息細(xì)胞的時間可能需要1 h左右,但是在第二階段的生產(chǎn)速率要遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于第一階段,而且需要指出的是,第二階段由于不存在細(xì)胞生長的原因,其L-乳酸轉(zhuǎn)化率也要明顯高于第一階段,從而能夠進(jìn)一步提高生產(chǎn)效率。

圖4 擬干酪乳桿菌細(xì)胞生長 和非生長相關(guān)組合的L-乳酸高效生產(chǎn)Fig.4 Efficient L-lactic acid production based on the combination of cell growth related and unrelated modes by L. paracasei注:空心圖標(biāo)表示常規(guī)批發(fā)酵條件下細(xì)胞生長、 L-乳酸生產(chǎn)和葡萄糖消耗的變化;實心圖標(biāo) 表示細(xì)胞生長和非生長相關(guān)組合下細(xì)胞生長、 L-乳酸生產(chǎn)和葡萄糖消耗的變化; 相同形狀的空、實心圖標(biāo)所代表的測定指標(biāo)相同。

3 結(jié)論

擬干酪乳桿菌在140 g/L初始葡萄糖濃度條件下,能夠快速生長并代謝葡萄糖生成L-乳酸,同時在發(fā)酵結(jié)束后,其穩(wěn)定期靜息細(xì)胞能夠在一定時間范圍內(nèi)(6～7 h)仍保持非常高的細(xì)胞代謝活性。因此,通過開發(fā)基于細(xì)胞生長和非生長相關(guān)組合的高細(xì)胞密度L-乳酸生產(chǎn)策略,能夠使得擬干酪乳桿菌細(xì)胞在常規(guī)發(fā)酵結(jié)束后繼續(xù)高密度高效生產(chǎn)L-乳酸,其生產(chǎn)速率是常規(guī)發(fā)酵階段的2.4倍,而且L-乳酸轉(zhuǎn)化率也表現(xiàn)出明顯的提升,達(dá)到0.985 g/g,非常接近理論值(1.0 g/g)。本研究開發(fā)的發(fā)酵過程策略最終實現(xiàn)了生產(chǎn)效率提升的目的,同時也能為工業(yè)乳酸生產(chǎn)過程提供借鑒。