高兆建,王秋芬,胡鑫強(qiáng),宋玉林,趙宜峰,陳 騰,*

(1.徐州工程學(xué)院食品與生物工程學(xué)院,江蘇徐州 221018; 2.河北省秦皇島市海濱林場(chǎng),河北秦皇島 066100; 3.長(zhǎng)江桂柳食品睢寧有限公司,江蘇徐州 221000)

隨著社會(huì)經(jīng)濟(jì)發(fā)展,人們生活質(zhì)量不斷提高,對(duì)食品的外觀、質(zhì)地、風(fēng)味等的期望值也越來越高。食品工業(yè)發(fā)展迅速,據(jù)統(tǒng)計(jì),截至2018年已有超過2500種各種各樣的添加劑用于食品工業(yè)[1]。其中化學(xué)合成食品防腐劑,如硝酸鹽、苯甲酸鈉、山梨酸鉀、山梨酸、苯甲酸、丙酸和對(duì)羥基苯甲酸等,可有效防止食品腐敗變質(zhì)、延長(zhǎng)食品保質(zhì)期,但對(duì)人體健康有潛在危害[2]。所以天然、安全、高效、廣譜天然防腐劑成為研究熱點(diǎn)和發(fā)展趨勢(shì)。微生物是天然防腐劑的重要來源,以枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)、地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis)和解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)為代表的芽孢桿菌屬微生物可產(chǎn)生超過20多種抗菌化合物[3],如枯草芽孢桿菌產(chǎn)生的subtilin和subtilosin A抗菌肽對(duì)多種細(xì)菌有抑制作用[4]。這些抗菌化合物中有潛力應(yīng)用于食品防腐的主要有兩類,一類為細(xì)菌素,但目前已經(jīng)商業(yè)化生產(chǎn)的僅有乳酸乳球菌(Lactococcuslactis)產(chǎn)生的乳酸鏈球菌素和多粘類芽孢桿菌(Paenibacilluspolymyxa)產(chǎn)生的片球菌素(pediocin PA-1)[5];另一類是抗菌脂肽,是芽孢桿菌屬細(xì)菌經(jīng)非核糖體途徑合成的由親水肽鍵和親油脂肪烴鏈組成的化合物[6],與細(xì)菌素相比,抗菌脂肽具有更強(qiáng)的耐熱性和抗蛋白酶降解能力[7]。此外,脂肽還表現(xiàn)出抗細(xì)菌、抗真菌、抗腫瘤、抗病毒、抗支原體等能強(qiáng)大的生物活性[8],因此抗菌脂肽有希望成為替代傳統(tǒng)化學(xué)防腐劑的新的抗菌劑。另外,也因其具有廣譜、高效、安全無毒、不易產(chǎn)生耐藥性、易被生物降解等特點(diǎn)使得其在農(nóng)業(yè)、食品、醫(yī)藥、化妝品、環(huán)保、畜牧業(yè)等領(lǐng)域備受關(guān)注,成為應(yīng)用研究的熱點(diǎn)。

芽胞桿菌是自然界分布廣泛的一類細(xì)菌,具有極強(qiáng)的抗逆能力和抗菌活性。研究表明芽胞桿菌能分泌多種抗菌物質(zhì),包括大分子抗菌蛋白、小分子抗菌脂肽、磷脂類、類噬菌體顆粒、細(xì)菌素和揮發(fā)性抑菌物質(zhì)等。其中抗菌脂肽更具有開發(fā)應(yīng)用潛力。芽孢桿菌中的脂肽主要包括表面活性素(Surfactin)、伊枯草菌素(Iturins)和芬芥素(Fengycin)3大類[9]。其中Surfactin對(duì)G+和G-細(xì)菌有顯著的抑制作用[10],同時(shí)也具有抑制炎癥因子的表達(dá)、抗病毒、抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)等功能[11];伊枯草菌素具有溶血性和強(qiáng)大的體外抗真菌功能,對(duì)多種植物病原菌都有較強(qiáng)的防治作用,但抑制細(xì)菌的能力較弱;芬芥素有強(qiáng)的抗真菌活性,無抗細(xì)菌活性[12]。不同種類脂肽抗菌特異性不同,Balan等[13]從庫爾勒海洋桿菌SBK-47(Pontibacterkorlensis)菌種中分離的脂肽對(duì)滕黃微球菌(Micrococcusluteus)和傷寒沙門氏菌(Salmonellatyphi)等有強(qiáng)烈的抑制作用,但未見其對(duì)真菌的抑菌報(bào)道;Rodríguez-Chávez等[14]從枯草芽孢桿菌Q11(Bacillussubtilis)分離的脂肽對(duì)索氏根霉菌(Rhizoctoniasolani)及膨脹性青霉菌(Penicilliumexpansum)等病原真菌有抑制作用,但對(duì)銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)等細(xì)菌沒有抑制效果。雖然國內(nèi)外對(duì)脂肽的研究較多,但主要圍繞脂肽用作表面活性劑或植物病蟲害防治方面;近年來脂肽在食品防腐領(lǐng)域也有一些報(bào)道,但存在抗菌譜窄、穩(wěn)定性差、產(chǎn)量低等各種缺陷,限制了脂肽在食品防腐領(lǐng)域的應(yīng)用。脂肽在芽孢桿菌屬細(xì)菌中廣泛存在,不同的芽孢桿菌所產(chǎn)生的脂肽其結(jié)構(gòu)和抑菌特性往往不同,故深入挖掘產(chǎn)脂肽菌種資源,尋找新的脂肽并研究其特性對(duì)開發(fā)天然安全健康的食品防腐劑具有重要意義。

課題組前期從山東傳統(tǒng)發(fā)酵大豆食品豆豉中分離出一株芽孢桿菌XZ15,對(duì)多種常見食品腐敗菌有明顯抑制作用,經(jīng)過生理生化及分子鑒定確定菌株XZ15為凝結(jié)芽孢桿菌。為提高菌株所產(chǎn)抑菌物質(zhì)產(chǎn)量,經(jīng)紫外與化學(xué)誘變選育得到B.coagulans誘變菌株XZQ-16,該菌株抗菌活性較野生菌株提高1.2倍且抗菌譜廣。本研究以誘變菌株XZQ-16為出發(fā)菌株,分離純化菌株發(fā)酵液中抗菌物質(zhì)、分析鑒定抗菌物質(zhì)組成、研究抗菌特性,為利用芽孢桿菌及其脂肽類抑菌物質(zhì)、進(jìn)一步開發(fā)新型天然食品防腐劑提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

實(shí)驗(yàn)菌株 為經(jīng)誘變的凝結(jié)芽孢桿菌(Bacilluscoagulans)XZQ-16;供試指示菌見表1;LB培養(yǎng)基、PDA培養(yǎng)基 參考向亞萍等[15]方法配制;TSA-YE 按照蒲月華等[16]的方法配制;NA培養(yǎng)基 按照李全勝等[17]的方法配制;發(fā)酵培養(yǎng)基(w/v) 蔗糖2%,蛋白胨1%,酵母粉0.5%,NH4NO30.2%,KH2PO40.3%,MgSO40.02%,CaCl20.02%,MnSO40.02%,pH7.0～7.2;Sephadex LH-20葡聚糖凝膠 美國GE公司;脂肽色譜純標(biāo)準(zhǔn)品iturin、Surfactin 美國Sigma公司;高效液相色譜分析柱Zorbax SB-C18(4.6 mm×150 mm,5 μm) 美國安捷倫公司;柱層析硅膠 青島海洋化工廠;蛋白酶K(30 U/mg)、胃蛋白酶(3000 U/mg)、胰蛋白酶(2500 U/mg)、胰凝乳蛋白酶(1500 U/mg)、脂肪酶(500 U/mg) 上海源葉生物科技有限公司。

3K30型臺(tái)式冷凍離心機(jī) 德國Sigma公司;1100series高效液相色譜儀 美國Agilent公司;冷凍干燥機(jī) 美國GOLD-SIM公司;AKTA蛋白純化系統(tǒng) 美國GE Healthcare公司;Nicolet 380型傅里葉變換紅外光譜儀 美國Thermo Fisher Scientific公司;SHB-Ⅲ型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 脂肽粗提物制備 將B.coagulansXZQ-16菌株接種到LB培養(yǎng)基中,250 mL三角瓶裝培養(yǎng)基50 mL,37 ℃于180 r/min振蕩搖床中培養(yǎng)18～24 h;按照8%接種量接種到裝有100 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中,37 ℃,180 r/min振蕩發(fā)酵60 h;發(fā)酵液8000 r/min,離心15 min,收集上清;用6 mol/L鹽酸調(diào)節(jié)pH至2.0,4 ℃冰箱靜置過夜;8000 r/min,離心20 min,倒掉上清液保留沉淀,用pH2.0的鹽酸洗滌沉淀兩次后,少量甲醇多次萃取,萃取液合并再于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中35 ℃減壓濃縮,得到的糊狀粗提物冷凍干燥,即為脂肽粗提物。

1.2.2 脂肽純化

1.2.2.1 快速硅膠柱色譜層析 參考文獻(xiàn)[18-19]報(bào)道的方法,并結(jié)合前期研究基礎(chǔ)采用快速硅膠柱色譜法對(duì)活性粗脂肽分段層析。色譜柱規(guī)格:77 mm×93 mm。柱料:硅膠。洗脫液:二氯甲烷和甲醇按如下體積比配制8種洗脫液各300 mL。二氯甲烷/甲醇(v/v)=100∶0、50∶1、25∶1、10∶1、5∶1、2∶1、1∶1和0∶100。采用瓊脂孔擴(kuò)散法測(cè)定各流分的抑菌活性[20]。

1.2.2.2 Sephadex LH-20柱層析 參照文獻(xiàn)[21]報(bào)道的方法,并稍作改動(dòng)?？焖俟枘z柱得到的活性組分進(jìn)一步用Sephadex LH-20(60 cm×2.9 cm)層析柱分離,以50%甲醇為流動(dòng)相,洗脫速度為1.5 mL/min,按照3 mL/管收集。蛋白純化系統(tǒng)自動(dòng)檢測(cè)280 nm處的吸光值。洗脫結(jié)束后對(duì)洗脫峰收集管檢測(cè)抑菌活性。多次循環(huán)洗脫后,將有活性的組分合并,并用吹氮器50 ℃吹干。

抑菌活性測(cè)定采用瓊脂孔擴(kuò)散法。吸取培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期的蠟狀芽孢桿菌菌液200 μL涂布于LB固體培養(yǎng)基,晾干后打孔,取洗脫峰樣品150 μL注入孔中,37 ℃培養(yǎng)24 h,觀察抑菌活性。

1.2.3 反相高效液相色譜 采用分析型高效液相色譜檢測(cè)活性組分化學(xué)組成。液相色譜條件:Zorbax SB-C18分析柱(4.6 mm×150 mm,5 μm),進(jìn)樣量:20 μL,柱溫25 ℃,檢測(cè)波長(zhǎng):220 nm,梯度洗脫:流動(dòng)相A:甲醇;B:含0.01%三氟乙酸(Trifluoroacetic acid,TFA)水溶液,30 min內(nèi)A由80%升至100%,流速:0.3 mL/min。

1.2.4 傅立葉紅外變換光譜分析 采用KBr壓片法。將200 mg在瑪瑙研缽研細(xì)至2 μm左右的KBr粉末在110～150 ℃烘箱中充分烘干(約需48 h),并與2 mg樣品充分研磨均勻。在真空下加壓成直徑為5或13 mm的半透明薄片。以空白KBr片為對(duì)照,采用傅里葉變換紅外光譜儀在500～4000 cm-1區(qū)域?qū)悠愤M(jìn)行紅外吸收光譜掃描分析。

1.2.5 脂肽抗菌譜測(cè)定 吸取150 μL稀釋至1×106CFU/mL的指示菌孢子或菌體懸液涂布于對(duì)應(yīng)培養(yǎng)基上;表面晾干后用6 mm的打孔器打孔;注入經(jīng)Sephadex LH-20層析分離的脂肽100 μL(300 μg/mL),以無菌水為陰性對(duì)照,28 ℃培養(yǎng)2～3 d(細(xì)菌37 ℃培養(yǎng)18～24 h),測(cè)抑菌圈直徑。

1.2.6 脂肽抗菌特性 溫度對(duì)脂肽抑菌活性的影響:將溶于100 mmol/L的磷酸緩沖溶液(pH7.5)抗菌脂肽分別置于50、60、70、80、100、110、120 ℃溫度下保溫30 min(110和120 ℃均以高壓滅菌鍋保溫處理)后抑菌活性。

pH對(duì)脂肽抑菌活性的影響:使用50 mmol/L不同pH的緩沖液將脂肽調(diào)節(jié)其pH為2.0～12.0,在25 ℃下作用2 h后將pH調(diào)回7.5,測(cè)定抑菌活性。

脂肽酶降解酶穩(wěn)定性:在脂肽溶液中分別加入終濃度為2 mg/mL的胃蛋白酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、蛋白酶K和脂肪酶,并調(diào)節(jié)至其最適pH,在各自適宜溫度下孵育2 h,再在80 ℃下處理5 min滅活酶,將pH調(diào)回到pH7.5,測(cè)定抑菌活性。

以上脂肽抑菌特性實(shí)驗(yàn)均以培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期的蠟狀芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌為指示菌,瓊脂孔擴(kuò)散法檢測(cè)抑菌活性,抑菌圈直徑表示活性大小。以室溫保存并未經(jīng)任何處理的脂肽為空白對(duì)照。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有檢測(cè)實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次,結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。原始數(shù)據(jù)用Excel 2010整理后,采用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS 19.0進(jìn)行試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行差異顯著性分析,比較試驗(yàn)中不同處理間差異。P小于0.05認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 脂肽的分離純化

菌株XZQ-16發(fā)酵液經(jīng)離心去菌體、發(fā)酵液上清酸沉淀、甲醇萃取、低壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮、冷凍干燥得到黃褐色的粗脂肽,得率為589.85 mg/L。粗脂肽進(jìn)一步硅膠柱分離,得到14個(gè)流分,分別收集每個(gè)流分并以蠟樣芽孢桿菌為指示菌檢測(cè)其抑菌活性,如圖1A所示,具有明顯抑菌活性的有:流分G8(二氯甲烷∶甲醇=5∶1,洗脫)、流分G9和流分G10(二氯甲烷∶甲醇=2∶1,洗脫)?；钚粤鞣趾喜⒑骃ephadex LH-20凝膠層析純化,得到Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ四個(gè)洗脫峰(圖2),分別檢測(cè)抑菌活性,如圖1B所示,洗脫峰III有較強(qiáng)抑菌活性,但與蛋白洗脫峰不完全對(duì)應(yīng),初步估計(jì)發(fā)酵液中可能存在兩種不同類型的抗菌物質(zhì)。將活性收集管合并進(jìn)一步高效液相色譜分析。

圖1 B. coagulans XZQ-16脂肽分離組分的抑菌活性Fig.1 Antibacterial activity of the isolated components of lipopeptide from B. coagulans XZQ-16注:A:硅膠柱層析;B:Sephadex LH-20凝膠層析。

圖2 B. coagulans XZQ-16脂肽Sephadex LH-20凝膠層析Fig.2 Sephadex LH-20 gel chromatography of lipopeptide from B. coagulans XZQ-16

2.2 高效液相色譜分析

將經(jīng)過硅膠柱層析和Sephadex LH-20層析分離的抗菌物質(zhì)HPLC分析。圖3C可見抗菌物質(zhì)經(jīng)HPLC分離后得到3個(gè)主要峰簇,并且每個(gè)峰簇是由多個(gè)峰構(gòu)成,說明每個(gè)組分都不是單一物質(zhì),這與報(bào)道的脂肽類化合物通常是由多種同系物構(gòu)成的觀點(diǎn)相一致[22]。標(biāo)準(zhǔn)品iturin經(jīng)HPLC分離后出現(xiàn)了3個(gè)主要的峰,保留時(shí)間分別為6.675、7.927和8.334 min(圖3A),這3個(gè)峰為iturin同系物。樣品的峰簇I出現(xiàn)了多個(gè)峰,保留時(shí)間分別為6.512、7.742、8.241 min,其保留時(shí)間與標(biāo)準(zhǔn)品iturin三個(gè)峰的保留時(shí)間基本一致,根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道ituin類脂肽通常最先出峰[23],故初步認(rèn)定樣品中峰簇I為iturin。標(biāo)準(zhǔn)品surfactin出現(xiàn)四個(gè)峰,對(duì)應(yīng)保留時(shí)間分別是19.127、19.751、20.678和21.273 min,樣品的峰簇III主峰周圍有多個(gè)小峰,其中四個(gè)峰保留時(shí)間為19.137、19.763、20.261和21.273 min,同標(biāo)準(zhǔn)品非常接近,初步認(rèn)為第三個(gè)峰簇為surfactin。峰簇II和標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)比區(qū)別較大,可能是其他化合物。

圖3 B. coagulans XZQ-16脂肽高效液相色譜Fig.3 HPLC for lipopeptides produced by B. coagulans XZQ-16注：A:脂肽標(biāo)準(zhǔn)品iturin;B:脂肽標(biāo)準(zhǔn)品surfactin; C:B. coagulans XZQ-16樣品。

2.3 脂肽傅里葉紅外光譜分析

取經(jīng)過Sephadex LH-20柱層析純化的樣品FT-IR分析,結(jié)果如圖4所示。在FT-IR圖譜上,3315.2 cm-1是由分子鏈間氫鍵引起的NH收縮振動(dòng)譜帶,1647.3和1558.3 cm-1處是酰胺譜帶Ⅰ和Ⅱ,以上特征說明抗菌物質(zhì)分子中具有肽鏈結(jié)構(gòu)。2925.6～2853.7、1413.5～1332.2 cm-1的兩處吸收為脂肪酸碳鏈上的C-H鍵伸縮振動(dòng)峰,1712.4 cm-1為內(nèi)酯鏈的特征吸收峰。根據(jù)以上特征,推測(cè)菌株XZQ-16產(chǎn)生的抗菌分子是一類環(huán)脂肽類物質(zhì),與文獻(xiàn)報(bào)道的脂肽類抗菌劑結(jié)構(gòu)特性相一致[24-26]。

圖4 B. coagulans XZQ-16脂肽紅外光譜Fig.4 FT-IR of lipopeptide produced by B. coagulans XZQ-16

2.4 脂肽抗菌特性分析

2.4.1 脂肽抗菌譜 對(duì)經(jīng)過Sephadex LH-20層析分離得到的活性峰Ⅲ樣品做抗菌譜實(shí)驗(yàn),結(jié)果顯示B.coagulansXZQ-16脂肽對(duì)供試的食品腐敗菌和食源性致病菌均有抑制作用(表1),其中革蘭氏陰性菌4株,革蘭氏陽性菌5株,這些食源性致病菌、腐敗菌廣泛存在于土壤中,容易污染不同類型的食物,尤其是畜產(chǎn)品食物,從而引起嘔吐或腹瀉型疾病[27]。抑菌情況整體看,Ⅲ樣品對(duì)革蘭氏陽性菌比對(duì)革蘭氏陰性菌抑菌效果強(qiáng),對(duì)真菌也有抑制作用,相比細(xì)菌較弱。脂肽對(duì)易導(dǎo)致食品及水源污染、對(duì)公共衛(wèi)生構(gòu)成巨大威脅的沙門氏菌、大腸桿菌及金黃色葡萄球菌有較好的抑制作用[27]。因此B.coagulansXZQ-16脂肽有潛力作為化學(xué)防腐劑的替代品在食品工業(yè)中應(yīng)用。目前已經(jīng)在食品防腐中使用的天然防腐劑有乳酸鏈球菌素(nisin)[28]、片球菌素(pediocin PA-1)[29]和植物乳桿菌素(plantaricin UG1)[30]。目前脂肽還沒有作為食品防腐劑商業(yè)化開發(fā)使用,B.coagulansXZQ-16脂肽對(duì)其他食源性致病菌的作用還有待進(jìn)一步研究。

表1 脂肽對(duì)不同指示菌的抑菌作用Table 1 Inhibitory activity of lipopeptide against different indicator bacteria

2.4.2 溫度對(duì)脂肽抑菌活性的影響 在苛刻的條件下,脂肽的高穩(wěn)定性是評(píng)價(jià)其是否有應(yīng)用價(jià)值的重要標(biāo)準(zhǔn)之一。因此,有必要研究不同溫度對(duì)脂肽穩(wěn)定性的影響。如圖5所示,在50～100 ℃下保存30 min脂肽抑菌活性基本無變化,在110 ℃時(shí),抑菌活性仍保持85%以上,在120 ℃下,抑菌活性僅僅下降了18%。B.coagulansXZQ-16脂肽對(duì)熱的穩(wěn)定性同其他報(bào)道的脂肽相似[31],可以耐受食品加工中如巴氏殺菌等高溫工藝過程。

圖5 溫度對(duì)B. coagulans XZQ-16脂肽抑菌活性影響Fig.5 Effects of temperature on antimicrobial activity of B. coagulans XZQ-16 lipopeptide

2.4.3 pH對(duì)脂肽穩(wěn)定性的影響 脂肽在多個(gè)領(lǐng)域的適用性還取決于其在不同pH下的穩(wěn)定性。在較寬的pH范圍內(nèi)脂肽穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖6所示,在pH4～12之間,脂肽對(duì)兩種指示菌的抑菌效果有略微差異,但抑菌活性均在80%以上,當(dāng)pH2.0時(shí),脂肽溶液有絮狀析出,且抑菌活性略有下降,說明B.coagulansXZQ-16脂肽在極端酸性環(huán)境下穩(wěn)定性弱,但在pH4～12范圍非常穩(wěn)定。通常極端酸性環(huán)境可以抑制食品源性腐敗及致病菌的生長(zhǎng)繁殖,所以B.coagulansXZQ-16脂肽可以在需要添加食品防腐劑的食品中廣泛使用。

圖6 pH對(duì)脂肽抑菌活性的影響Fig.6 Effects of pH on antimicrobial activity of lipopeptide

2.4.4 水解酶對(duì)脂肽穩(wěn)定性的影響 脂肽水解酶敏感性研究如圖7顯示,脂肽經(jīng)胃蛋白酶和胰蛋白酶處理后抑菌活性無明顯變化,說明脂肽對(duì)兩蛋白酶不敏感;而經(jīng)胰凝乳蛋白酶處理后,抑菌活性有略微下降,但抑菌率扔保持在80%以上。脂肪酶處理后,抑菌活性下降不明顯,脂肽幾乎不受脂肪酶的影響。

圖7 水解酶對(duì)脂肽的抗菌活性影響Fig.7 Effects of hydrolytic enzyme on antimicrobial activity of lipopeptide

3 討論與結(jié)論

目前,關(guān)于芽孢桿菌屬菌株分泌的抗菌脂肽理論和應(yīng)用研究主要集中在植物病害的防治方面[32],而在食品防腐應(yīng)用方面研究較少。本研究的B.coagulansXZQ-16脂肽在食品防腐方面具有顯著優(yōu)勢(shì)。不同類型的脂肽抗菌范圍不同[7],本研究在NA和PDA平板上分別測(cè)定了抗菌脂肽對(duì)常見食品腐敗細(xì)菌和部分真菌的抗菌活性,在所測(cè)細(xì)菌中,B.coagulansXZQ-16脂肽對(duì)常見的食品腐敗菌包括革蘭氏陽性和革蘭氏陰性菌均具有良好的抑菌效果,同時(shí)對(duì)真菌也有不同程度的抑制作用。因此,B.coagulansXZQ-16脂肽在食品防腐方面具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。

B.coagulansXZQ-16脂肽經(jīng)酸沉淀、有機(jī)溶劑萃取、硅膠柱層析后進(jìn)一步采用SephadexLH-20凝膠柱層析,明顯減少了液相色譜檢測(cè)時(shí)大量雜質(zhì)的干擾,結(jié)果更精確、操作簡(jiǎn)便、純化效率高、成本低,最后得到抗菌脂肽樣品直接進(jìn)行高效液相色譜檢測(cè)確定其組分。目前對(duì)脂肽類抗菌化合物的鑒定主要采用液相色譜分析結(jié)合質(zhì)譜鑒定,根據(jù)化合物的保留時(shí)間和分子量判斷抗菌物質(zhì)類別。本研究從菌株XZQ-16發(fā)酵液中分離純化出一種對(duì)食源性致病菌有廣譜抗菌活性的抑菌物質(zhì),高效液相色譜分析發(fā)現(xiàn),該物質(zhì)與標(biāo)樣iturin和surfactin對(duì)應(yīng)的特征峰具有相同的保留時(shí)間,據(jù)此推斷該活性物質(zhì)為iturin和surfactin類脂肽化合物。為進(jìn)一步證明抗菌物質(zhì)為脂肽,進(jìn)行了傅里葉紅外光譜掃描,分析發(fā)現(xiàn)樣品分子中含有酰胺鍵、脂肪碳鏈等環(huán)脂肽類化合物所具有的結(jié)構(gòu),據(jù)此進(jìn)一步確認(rèn)抗菌物質(zhì)為脂肽類化合物。據(jù)研究報(bào)道,芽孢桿菌屬菌株可同時(shí)產(chǎn)生多種不同類型的脂肽化合物,Jemil等[33]報(bào)道了甲基營養(yǎng)型芽孢桿(Bacillusmethylotrophicus)DCS1可同時(shí)產(chǎn)生iturin A、Fengycin和surfacetin A三種類型的脂肽,每種類型還有多種同系物。

脂肽要應(yīng)用于食品、畜牧、化妝品及農(nóng)業(yè)生防等行業(yè)中,除了需要有良好的抗菌性能外,還需要能夠耐受較為苛刻的環(huán)境。穩(wěn)定性是衡量脂肽優(yōu)良的重要指標(biāo),陸雅琴等[34]報(bào)道可產(chǎn)生脂肽類抗菌劑的芽孢桿菌P6無菌發(fā)酵濾液在pH3～9范圍內(nèi)較穩(wěn)定,在堿性范圍內(nèi)穩(wěn)定性差,對(duì)溫度也具有較好的穩(wěn)定性,100 ℃處理30 min仍保持84.76%的抗菌活性,121 ℃處理15 min后抗菌物質(zhì)失活;張寶俊等[35]從解淀粉芽胞桿菌發(fā)酵液中分離到的抗菌物質(zhì)在較廣的范圍內(nèi)(pH3～11)穩(wěn)定性好,但121 ℃處理0.5 h即喪失活性;葛平華等[36]報(bào)道的海洋解淀粉芽胞桿菌抗菌物質(zhì)對(duì)蛋白酶、光照、紫外線及高溫均表現(xiàn)出良好穩(wěn)定性,但酸堿穩(wěn)定性差,pH<4或pH>10時(shí)幾乎抑菌活性完全喪失。B.coagulansXZQ-16脂肽對(duì)熱和酸堿的穩(wěn)定性與之相比更為突出,在50～110 ℃下處理30 min,抑菌活性保持在85%以上,在pH4.0～12.0的環(huán)境下處理2 h,抑菌活性保持80%以上。多種蛋白酶和脂肪酶處理后,脂肽抑菌活性幾乎不發(fā)生變化。因此,B.coagulansXZQ-16脂肽具有優(yōu)良的熱穩(wěn)定性、酸堿耐受性和抗消化酶的水解能力。在食品加熱滅菌及飼料造粒等受熱加工過程中,都可以保持較好的穩(wěn)定性。

本研究通過酸沉淀、有機(jī)溶劑萃取、硅膠柱層析以及Sephadex LH-20柱層析從B.coagulansXZQ-16發(fā)酵液中分離純化到了抗菌脂肽,通過傅里葉紅外光譜分析確定抗菌物質(zhì)為脂肽類化合物,反向高效液相色譜分析確定抗菌脂肽為iturin和surfactin類脂肽同系物?？咕V分析顯示脂肽同目前商業(yè)化應(yīng)用的乳酸鏈球菌素(nisin)和片球菌素(polymyxin B)在抑菌譜方面更具優(yōu)勢(shì),B.coagulansXZQ-16脂肽對(duì)常見的食源性致病菌包括革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌都具有明顯的抑菌活性,并對(duì)真菌生長(zhǎng)也有一定的抑制作用。熱穩(wěn)定性、酸堿穩(wěn)定性以及水解酶敏感性實(shí)驗(yàn)表明,該B.coagulansXZQ-16脂肽是一種相當(dāng)穩(wěn)定的抗菌化合物?；谝陨陷^好的生物及理化特性,B.coagulansXZQ-16脂肽有望在食品防腐、化妝品行業(yè)、醫(yī)藥行業(yè)、農(nóng)業(yè)等相關(guān)行業(yè)應(yīng)用。該研究為尋找新的安全性的食品防腐劑提供了新的思路。下一步將在探明B.coagulansXZQ-16菌株來源抗菌脂肽的抑菌作用機(jī)理、基因工程技術(shù)提高脂肽表達(dá)量、發(fā)酵優(yōu)化提高脂肽產(chǎn)量等方面開展工作,為后續(xù)開發(fā)相關(guān)產(chǎn)品提供研究基礎(chǔ)。