李葉嫻李萬鑫祁春于亞峰*

1蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院耳鼻咽喉科（蘇州 215006）

2陽澄湖鎮(zhèn)人民醫(yī)院耳鼻咽喉科（蘇州 215006）

由于大約每1000名嬰兒就有1-2名受到重度或極重度耳聾的影響，耳聾已經(jīng)成為全國乃至全球最重要的健康問題之一。在中國，聽力損失的患病率范圍為0.1%-0.3%[1]，其病因極其復(fù)雜，其中遺傳占主要因素。根據(jù)有無伴隨其他系統(tǒng)異常，遺傳性聾可分為綜合征性（syndromic hearing loss,SHL）和非綜合征性耳聾(non-syndromic hearing loss,NSHL),大約70%的遺傳性耳聾是NSHL，其中有30%的遺傳方式為常染色體顯性遺傳[2]。本文通過對一個耳聾家系的臨床表現(xiàn)及先證者家庭的基因測序分析，報道一個MYH9基因新的突變位點，為該家系的遺傳咨詢提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 家系資料

這個耳聾家系位于江蘇省，先證者因聽力下降于我院門診就診，仔細(xì)詢問病史并行聽力檢查。發(fā)現(xiàn)先證者是1例成年以后才出現(xiàn)的雙側(cè)進(jìn)行性中重度感音神經(jīng)性耳聾。詢問家族史時了解到該家族有多名親屬有成年后遲發(fā)性聽力下降的癥狀，于是我們對該家系成員進(jìn)行追蹤調(diào)查，并有10位成員與先證者有著相似的病史。接著我們對這個家系中的18位成員進(jìn)行了詳細(xì)的病史采集，詢問一些基本情況包括聽力損失的發(fā)病年齡、進(jìn)展情況、程度，有無耳毒性藥物使用、噪音環(huán)境生活、傳染病史，有無耳部外傷、中耳炎、頭頸部腫瘤病史，有無眼部、神經(jīng)、肌肉、心血管系統(tǒng)及免疫系統(tǒng)疾病史，是否近親婚配。

1.2 方法

1.2.1 ?？萍奥犃W(xué)檢查

電耳鏡檢查受檢者的外耳和鼓膜，對家系中與先證者血緣關(guān)系密切的5位耳聾成員進(jìn)行純音聽閾測定、聲導(dǎo)抗、耳聲發(fā)射、ABR聽力學(xué)檢查。

1.2.2 實驗室檢查

我們對家系中耳聾成員進(jìn)行了血液系統(tǒng)檢查（血常規(guī)、血凝常規(guī)、血涂片、血小板功能、血小板流式檢測）等。

1.2.3 影像學(xué)檢查

對家系中耳聾成員行顳骨CT檢查。

1.2.4 致病基因突變檢測

將先證者的血樣本送往北京邁基諾基因科技股份有限公司，行耳聾基因組二代測序，參考版本GRch37／h919進(jìn)行分析比對，從已知的159個耳聾基因（所有已知的非綜合征耳聾基因包括在內(nèi)）中檢測疑似致病基因突變位點。再通過常規(guī)Sanger測序方法，驗證該位點在家系其他成員中的表達(dá)以及與耳聾表型的共分離情況。

2 結(jié)果

2.1 家系表型特征及遺傳學(xué)特征

該家系中被追蹤調(diào)查的五代人從第一代開始連續(xù)四代中均有聾病患者，呈連續(xù)遺傳現(xiàn)象，第五代目前年齡尚小尚未發(fā)病。家系圖譜呈常染色體顯性遺傳特征(圖1)。大多數(shù)患者敘述他們成年之后（大約30多歲）開始出現(xiàn)聽力下降但均無語言障礙，不影響正常語言交流，耳聾呈漸進(jìn)性發(fā)展。除了Ⅲ12有過化膿性中耳炎病史外，其他成員均否認(rèn)使用耳毒藥物史，耳流膿史，也均未發(fā)現(xiàn)其他系統(tǒng)先天畸形，未見智力障礙。但先證者的祖父母為近親婚配（表兄妹）。

圖1 家系圖譜Fig.1 Pedigree map

2.2 ?？茩z查結(jié)果及聽力學(xué)特征

專科檢查見Ⅲ1示雙耳廓外形正常，外耳道通暢，鼓膜鈣化，標(biāo)志不清。這些特點與Ⅲ1既往患過中耳炎病史相符合。余參與研究家族人員專科檢查未見明顯異常。除Ⅲ1右耳為混合性耳聾外，其他部分耳聾患者的純音聽閾表現(xiàn)為雙側(cè)對稱高頻下降的感音神經(jīng)性聾；ABR結(jié)果提示反應(yīng)閾值均升高，且隨著年齡的增長而升高（圖2）；聲導(dǎo)抗檢測除III1為B型外其他無異常；DPOAE雙耳各頻率均未引出；聲反射未引出。

圖2 家系部分耳聾患者的反應(yīng)聽閾-年齡曲線圖。從曲線圖我們可以看出，聽閾隨著年齡的增長逐漸升高。橫坐標(biāo)對應(yīng)的年齡分別代表V1，Ⅳ1，Ⅲ7，Ⅲ5，Ⅲ1。Fig.2 Hearing threshold with age.As we can see from the graph,hearing thresholds increase with the growth of age.The corresponding points on the abscissa represent the age of V1，Ⅳ1，Ⅲ7，Ⅲ5，Ⅲ1.

2.3 輔助檢查

家系中耳聾成員血液系統(tǒng)檢查（血常規(guī)、血凝常規(guī)、血涂片、血小板功能、血小板流式檢測）以及內(nèi)耳CT均未見明顯異常。

2.4 基因檢測報告結(jié)果

采用二代測序法對先證者（Ⅳ1）進(jìn)行測定：發(fā)現(xiàn)3個潛在的致病基因位點，分別為:MYH9c.314A＞T:p.Y105F；MYO3A，c.1324C＞T:p.H442N；TCIRG1，c.1801G＞A:p.A601T。后對先癥者的父親（Ⅲ1）及兒子（Ⅴ1）經(jīng)Sanger測序驗證發(fā)現(xiàn)MYH9突變位點與家系的表型共分離（圖3）。后兩種并未發(fā)現(xiàn)共分離現(xiàn)象。MYH9變異為雜合錯義突變，數(shù)據(jù)庫中未見頻率報道，致病性分析該突變?yōu)閡ncertain。后續(xù)又對先證者聽力正常的母親在此基因位點上無突變（圖4）。家系內(nèi)該變異與耳聾表型共分離，此變異經(jīng)查閱文獻(xiàn)和數(shù)據(jù)庫未見致病性報道。

圖3 先證者的父親及兒子基因Sanger測序結(jié)果，箭頭示突變位點Fig.3 Sanger sequencing results of proband’s father and his son

圖4 先證者母親基因測序結(jié)果，箭頭示正常無突變Fig.4 Sanger sequencing results of proband’s mather

3 討論

MYH9基因突變引起的耳聾大致可分為兩類，大多數(shù)引起綜合征性耳聾（即血液疾病與耳聾同時存在）：MYH9相關(guān)疾?。∕YH9-realteddisease，MYH9-RD）。還有少部分MYH9基因突變會導(dǎo)致非綜合征性耳聾（即單一的耳聾癥狀）：常染色體顯性遺傳性耳聾(DFNA17)[3]。由此可見，可根據(jù)是否有血液系統(tǒng)異常來區(qū)別MYH9-RD和DFNA17[4]。

MYH9是一個位于22號染色體q12-13上，編碼非肌球蛋白重鏈ⅡA（nonmuscle myosin heavy chainⅡA,NMMHCⅡA）的大基因[5]。MYH9在內(nèi)耳Corti器、前庭膜、螺旋韌帶、基底膜等器官均有表達(dá)[6]。另外NMHCⅡA在內(nèi)耳毛細(xì)胞的靜纖毛中表達(dá)，它有助于纖毛結(jié)構(gòu)的發(fā)育和維持。這些可以表明突變的MYH9基因引起的耳聾可能是通過損壞靜纖毛的結(jié)構(gòu)和運(yùn)動而實現(xiàn)的[7,8]。

本研究家系從耳聾的臨床表現(xiàn)上看，這幾例耳聾患者均為成年后遲發(fā)性、雙側(cè)、進(jìn)行性、以高頻為主的感音神經(jīng)性耳聾，隨著年齡的增長，耳聾越來越嚴(yán)重。所有患者均無血液系統(tǒng)異常，他們的這些表現(xiàn)大致與DFNA17表型大體一致，臨床較少見。其中Ⅲ1的純音測聽提示為混合性耳聾，聲導(dǎo)抗呈B型曲線，應(yīng)該是與患過中耳炎有關(guān)，可能中耳存在粘連情況。Ⅴ1目前無任何癥狀，無聽力損失，也沒有任何其他器官損傷，但他的基因報告表明存在MYH9基因雜合突變，說明其尚未到發(fā)病年齡。由于其他耳聾成員在聽力下降的時候未予重視，所以無法準(zhǔn)確判斷該家系的真實起病時間，我們只能按他們自述的大概時間，因此對于Ⅴ1我們建議定期于醫(yī)院復(fù)查聽力，尤其在自覺聽力明顯下降的時候立即行聽力檢查，明確發(fā)病年齡年齡。從該耳聾家系的家系圖及孟德爾遺傳規(guī)律可以分析出：該家系的耳聾遺傳方式為常染色體顯性遺傳。但是，只通過臨床表型及遺傳方式只能大概鎖定符合的部分耳聾基因，并不能具體明確致病基因。由此可以知道，要想確切的知道致病基因，只有經(jīng)過具體的基因分析。結(jié)合該家系的遺傳特點，經(jīng)過認(rèn)真分析后選擇合適的測序方法進(jìn)行研究。因該家系臨床特征不符合我國常見的四大致病基因特點，也沒有懷疑度極高的致病基因，因此我們采用第二代測序方法對該非綜合征性耳聾家系進(jìn)行基因檢測，檢測范圍:168個己知的與耳聾有關(guān)的耳聾基因，并用Sanger測序法進(jìn)行驗證，最后明確該家系成員的耳聾可能致病基因為MYH9[9]。

1999年Lalwani[10]等發(fā)現(xiàn)了一種MYH9基因上的突變DFNA17，他發(fā)現(xiàn)這個家庭有18例患者為常染色體顯性遺傳導(dǎo)致的耳聾，發(fā)病年齡接近10歲，它起初開始于高頻率，在近30歲的時候聽力損傷變得中等至極重度。Lalwani等通過Sanger測序的方法研究了所有基因在DFN17上的位點上并證實了MYH9作為一個新的耳聾基因，即在第2298核苷酸位置處都有G到A的轉(zhuǎn)位，MYH9基因第17號外顯子的突變使精氨酸(R)在蛋白位置705處(R705H)變?yōu)榻M氨酸(H)。Hildebrand[11]等也在一個耳聾家庭中發(fā)現(xiàn)了相同的變異。這個家庭的聽力損失開始于6歲左右，在20或30歲左右耳聾變得重度至極重度。這是一種非綜合征的常染色體顯性感音神經(jīng)性耳聾，其特征是延遲發(fā)作、漸進(jìn)性、早期以高頻率的聽力損失為主，晚期可涉及全頻。同時他們的血液系統(tǒng)正常，缺乏綜合征的臨床表現(xiàn)。到目前為止，檢索國內(nèi)外相關(guān)文獻(xiàn)中只有少數(shù)報道提到關(guān)于在非綜合征性耳聾患者中MYH9突變，說明MYH9基因很少導(dǎo)致以耳聾為唯一表現(xiàn)的非綜合征性感音神經(jīng)性耳聾[12]。我們調(diào)查的家庭中所觀察到的臨床表現(xiàn)與文獻(xiàn)報道的表型基本一致，發(fā)生聽力障礙的患者大多在30歲左右，其聽力學(xué)特征、血液檢查及影像學(xué)檢查大致與DFN17相符。除此之外我們所研究的家系致聾基因MYH9，c.314A＞T:p.Y105F在文獻(xiàn)中尚未報道，是一個新的MYH9基因突變位點，并導(dǎo)致非綜合征性常染色體顯性遺傳性耳聾。但因研究條件所限，未能對患病的每個家系成員進(jìn)行基因測定，以及對基因的致病性分析未做具體的研究分析。這些，都需要在以后的研究中進(jìn)一步完善。MYH9基因突變位點并不只限于目前所研究的這些，還有很多暫時未發(fā)現(xiàn)的突變等著我們?nèi)パ芯?，基因突變位點相同但導(dǎo)致出不同的耳聾表現(xiàn)也是未來基因研究方向的重點，可能存在其他因素或環(huán)境因素。