林宗鏗 張?zhí)煜? 楊俊杰

摘 ?要：為探討辣木（Moringa spp.）種質資源間的遺傳關系，采用相關序列擴增多態(tài)性（sequence-related amplified polymorphism， SRAP）分子標記方法對18份辣木種質資源的遺傳多樣性和親緣關系進行分析。結果表明，從170對引物中篩選出13對多態(tài)性較高的引物組合，共擴增出104條清晰穩(wěn)定的條帶，平均多態(tài)性條帶百分率達62.50%。遺傳多樣性參數(shù)分別為等位基因數(shù)（Na）為1.6250，有效等位基因數(shù)（Ne）為1.4777，基因多樣性指數(shù)（H）為0.2632，香農(nóng)信息指數(shù)（I）為0.3797，說明18份辣木種質資源間有較高的遺傳多樣性。UPGMA聚類分析結果表明，18份辣木種質資在遺傳相似系數(shù)0.732水平上，可分了3個群，來自非洲盧旺達的狹瓣辣木[M. stenopetala（Baker f.） Cufod.]具有較遠的親緣關系，單獨聚類為一個類群Ⅲ;其余樣品則分別聚類為類群Ⅰ和類群Ⅱ，類群Ⅰ共11份材料，主要為來源于印度的多油辣木（M.?oleifera Lam.）及其改良種‘PKM1和‘PKM2，類群Ⅱ共6份材料，主要為來源于我國云南和海南的多油辣木及其改良種‘PKM1和PKM2。SRAP標記反映了辣木種質資源間的遺傳關系，本研究結果為辣木雜交育種的親本選擇提供了科學基礎。

關鍵詞：辣木;SRAP;遺傳多樣性;親緣關系中圖分類號：Q949.748.5??????文獻標識碼：A

Assessment of Genetic Diversity and Relationship among 18 Moringa?Species Based on SRAP Marker

LIN Zongkeng， ZHANG Tianxiang， YANG Junjie

Fujian Institute of Tropical Crops， Zhangzhou， Fujian 363001， China

Abstract： Sequence-related amplified polymorphism （SRAP） molecular marker was used to analyze the genetic diversity and relationship among 18?Moringa species in this study. A total of 104 bands were amplified from 18 tested germplasm resources by 13 pairs of core primer combinations selected from 170 pairs of primers. The average percentage of polymorphism was 62.50%. Observed alleles were 1.6250， effective alleles were 1.4777， Neis gene diversity was 0.2632 and Shannons information index was 0.3797， which showed 18Moringaspecies existed high genetic diversity. According to Neis genetic similarity coefficient， when the genetic similarity coefficient was 0.732， theMoringagermplasms could be divided into three categories. Among the 18 germplasms， apart fromM. stenopetala（Baker f.） Cufod.， the rest materials were in category I or category II. Thereinto， category II contained 11 germplasms， mainly includingM. oleiferaLam.， its improved species ‘PKM1 and ‘PKM2， which derived from India. Besides，M. oleiferaLam.， its improved species ‘PKM1 and ‘PKM2 which came from Hainan and Yunnan， China were clustered into category II.M. stenopetala（Baker f.） Cufod. which came from Rwanda was clustered in group III， indicating this material had further relationship with others. SRAP molecular marker reflects the genetic relationship amongMoringaspecies and would provide a theoretical basis for the selection ofMoringa hybrid parents.

Keywords： Moringa; SRAP; genetic diversity; genetic relationships

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2021.04.005

辣木（Moringa spp.）為辣木亞目（Moringineae）辣木科（Moringaceae）辣木屬（MoringaAdans.）植物，是單科單屬植物^[1]。辣木原產(chǎn)于印度、巴基斯坦等南亞國家以及阿拉伯半島及非洲大陸，具有獨特的經(jīng)濟價值和營養(yǎng)保健作用。辣木各個部位如葉、花、果、種子等均可食用，特別是辣木葉含有較高的蛋白質、維生素和礦物質等營養(yǎng)成分^[2-5]。辣木葉、花、果等部位還含有豐富的植物多糖、黃酮類、生物堿、酚類等多種活性成分，具有降血糖、降血脂、抗腫瘤、抗炎抑菌等作用，有較高的藥用價值^[6-8]。此外，辣木因生長迅速、主桿粗壯、株型圓滿、花期長、花量多等優(yōu)點，已應用于城市廣場綠化。辣木有13個種，其中只有4個種有栽培價值。常見種植的主要是多油辣木（M.?oleifera Lam.）和狹瓣辣木[M. stenopetala（Baker f.） Cufod.]2個種。多油辣木原產(chǎn)于印度北部喜馬拉雅山脈，由于口感好，產(chǎn)量高，是目前世界上的主栽種。印度科研人員在多油辣木原種的基礎上，采用選擇育種和雜交育種方式分別培育出2個改良品種‘PKM1和‘PKM2，并在全世界得到推廣種植^[1，9]。狹瓣辣木原產(chǎn)于埃塞俄比亞和肯尼亞北部，葉片較大，芳香味濃，在非洲有較大面積栽培^[1]。近10 a來，隨著消費群體對辣木營養(yǎng)價值、藥用價值及功效的認識逐漸深化，辣木在我國云南、廣西、海南、廣東、福建等熱帶、南亞熱帶地區(qū)得到了快速推廣種植^[10-13]，并在北方一些栽培設施內(nèi)也得到了推廣^[14]。

我國并非辣木原產(chǎn)地，目前國內(nèi)種植所需種子大部分是從境外進口，小部分由國內(nèi)種植者自己采種。由于辣木在國內(nèi)大面積種植時間較短，沒有自主產(chǎn)權的辣木品種，辣木種子管理尚不規(guī)范，因而市場上辣木品種混雜，真假難分。國內(nèi)科研人員已著手進行辣木選育種工作^[15]。辣木以雜交育種為主，親本間的遺傳關系將在很大程度上決定雜交F₁代種子的質量。因而，將篩選出具有明顯表觀特征的辣木種質資源，利用分子標記進行遺傳關系分析，是育種過程中重要的一環(huán)。

隨著分子標記技術的發(fā)展，多種DNA分子標記技術已廣泛應用于種質資源評價、遺傳多樣性分析和圖譜構建等方面，如限制性片段長度多態(tài)性（restriction fragment length polymorphism， RFLP）、隨機擴增DNA多態(tài)性（random amplified polymorphic DNA， RAPD）、簡單重復序列（simple sequence repeat， SSR）、相關序列擴增多態(tài)性（sequence-related amplified polymorphism， SRAP）和單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism， SNP）等^[16-17]。SRAP因具有較好的重復性、較強的多態(tài)性、共顯性標記系統(tǒng)和操作簡便、成本低等特點，成為植物親緣關系和遺傳多樣性分析的有效手段，已應用于果樹、蔬菜、花卉等多種植物輔助育種研究中^[18-21]。目前，鮮見有關SRAP分子標記技術應用于辣木種質資源親緣關系分析的研究報道。筆者自2012年起收集辣木種質資源，建立了種質資源圃，進行試種觀測。本研究對辣木SRAP標記的通用引物進行篩選，對18份具有鮮明特征、擬作為育種親本的辣木種質資源進行遺傳多樣性和親緣關系分析，了解其遺傳背景，明確各材料間的親緣關系，為下一步進行辣木雜交育種提供理論依據(jù)。

1??材料與方法

1.1材料

供試材料均采自福建省熱帶作物科學研究所辣木種質資源圃。資源圃的辣木種質主要引自于中國云南、海南、廣東、臺灣，以及印度、泰國、緬甸、盧旺達等地。供試材料共18份，根據(jù)種（品種）名、引種地及特征進行編號（表1），其中S6～S8尚不能確定品系歸屬。采集各供試材料的幼嫩葉片，裝入自封袋并編號，每袋20片葉子，加入硅膠，葉片充分干燥后保存于–80?℃冰箱中備用。

1.2方法

1.2.1??總DNA的提取和檢測 ?辣木基因組DNA提取參考林藝華等^[22]的方法，采用天根高效植物基因組DNA提取試劑盒（DP350）進行提取，總DNA采用1.2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測完整性，并用核酸蛋白儀（Eppendorf BioPhotometer Plus）測定其濃度和質量。基因組DNA條帶明亮，完整無降解。加入適量無菌水后將其稀釋至20?ng/?L，并置于–20?℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 ?PCR引物篩選及反應體系 ?以種質S1的DNA為模板，篩選17條上游引物（編號為A～Q），10條下游引物（編號為1～10），兩兩組成170對SRAP引物，引物序列見表2。SRAP-PCR擴增總體積為25??L，其中包括不含Mg²⁺的10×PCR buffer 2.5??L，Mg²⁺2?mmol/L，dNTPs 0.2?mmol/L，DNA濃度為2??L（20?ng/?L），TaqDNA聚合酶用量為0.625?U，上下游引物各0.75??mol/L。引物來源于生工生物工程（上海）股份有限公司，PCR試劑來源于寶生物工程（大連）有限公司。

將上述SRAP-PCR反應混合液按如下程序進行擴增：94?℃預變性5?min;94?℃變性1?min，37?℃復性1?min，72?℃延伸1?min，5個循環(huán);94?℃變性1?min，50?℃復性1?min，72?℃延伸1?min，35個循環(huán);72?℃再延伸10?min，于4?℃下保存。

1.3數(shù)據(jù)處理

SRAP-PCR擴增后采用2.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，使用凝膠成像系統(tǒng)拍照記錄結果。根據(jù)擴增結果，清晰、可重復且長度范圍在200～2000 bp內(nèi)的進行記錄，對同一引物的擴增條帶，有條帶記為“1”，無條帶記為“0”，建成原始表征0-1數(shù)據(jù)矩陣。SM相似系數(shù)利用NTSYS 2.1軟件中Similarity程序的Qualitative data計算，用Clustering程序中的SHAN進行UPGMA聚類分析，繪制出聚類圖。辣木遺傳多樣性參數(shù)采用POPGENE?32計算，包括群體多態(tài)性位點百分率（P）、觀察等位基因數(shù)（Na）、有效等位基因數(shù)（Ne）、基因多樣性指數(shù)（H）和Shannon信息指數(shù)（I）。

2??結果與分析

2.1 ?SRAP引物篩選

采用已建立的辣木SRAP-PCR反應體系和程序，通過引物篩選，從170對SRAP引物中篩選出13對具有較好多態(tài)性的引物，分別為A6、F1、F2、F3、G3、I4、I8、M2、M3、P7、P8、Q1和Q2（表3）。其中，L1～L10和M1～M10引物擴增辣木種質S1的結果如圖1所示。

2.2擴增多態(tài)性及遺傳多樣性分析

用13對SRAP引物對18份辣木樣品進行PCR擴增，總共獲得104條擴增帶，其中多態(tài)性條帶數(shù)為65條，平均多態(tài)性條帶百分率為62.50%。采用POPGENE軟件對SRAP分子標記方法擴增的結果進行分析，結果表明，等位基因數(shù)（Na）為1.6250，基因多樣性指數(shù)（H）為0.2632，有效等位基因數(shù)（Ne）為1.4777，Shannon信息指數(shù)（I）為0.3797。說明試驗所用18份辣木種質資源間有較豐富的遺傳多樣性。

2.3辣木親緣關系分析

根據(jù)SRAP分子標記PCR擴增的結果進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計，形成0-1矩陣，進而通過NTSYS 2.1軟件對該數(shù)據(jù)進行聚類分析?；赟RAP分子標記的聚類結果表明（圖2），在相似系數(shù)為0.62處時，S14單獨聚類為1個分支，為來自于非洲盧旺達的狹瓣辣木。在相似系數(shù)為0.732處，另外17份辣木材料分為2類，I類為S1～S11，共11份材料;Ⅱ類為S12～S13、S15～S18，共6份材料。I類群的11份材料主要為來源于印度的多油辣木及其改良種‘PKM1和‘PKM2，Ⅱ類群的6份材料主要為來源于我國云南和海南的多油辣木及其改良種‘PKM1和‘PKM2。

3??討論

分子標記技術是DNA水平上遺傳變異的直接反映，不受環(huán)境及基因表達與否的限制，遍及整個基因組，遺傳穩(wěn)定，能夠克服形態(tài)學鑒定的很多困難。利用分子標記對辣木遺傳多樣性和親緣關系進行分析對育種工作中親本的選擇具有重要指導意義。已有研究表明，辣木種間、種內(nèi)不同個體間存在著豐富的遺傳多樣性。韓闖等^[23]利用ISSR標記對7個不同種的辣木材料進行了分析，將7份材料聚為4類，認為同種辣木植物的樣品間遺傳距離相對較小，不同種的辣木遺傳距離較遠。李海渤等^[24]采用RAPD分子標記技術對同一品種內(nèi)78株不同形態(tài)特征的辣木遺傳多樣性進行了研究，將參試材料劃分為4個大類，并認為參試材料雖為同一品種但單株間差異大，遺傳背景豐富，不同形態(tài)特征與遺傳無關，可能是環(huán)境變化或營養(yǎng)組分的差異所致。魏靜^[25]應用SSR標記對多油辣木種內(nèi)10個種源進行了分析，也認為各種源內(nèi)存在廣泛的變異，個體層次的遺傳背景豐富。鄭碩理等^[26]采用AFLP分子標記技術對27份在云南省栽培的辣木遺傳多樣性和親緣關系進行了分析，發(fā)現(xiàn)來自同一栽培區(qū)域、具有相同性狀的材料沒有按預期聚類在一起，因而認為栽培辣木種群內(nèi)遺傳分化較大。林藝華等^[27]曾利用RAPD和ISSR分子標記技術分析了16份辣木種質資源的親緣關系。

不同分子標記在辣木種質資源的分析中各具特點，SSR和AFLP標記都存在費用較高的問題，RAPD標記的穩(wěn)定性和重復性差，ISSR對PCR擴增的最適條件要求嚴格。SRAP標記是基于PCR的一種新型標記系統(tǒng)，通過一對引物對開放閱讀框進行擴增，在設計引物時正反引物分別是針對序列相對保守的編碼區(qū)與變異大的內(nèi)含子、啟動子和間隔序列，因此多數(shù)SRAP標記在基因組中分布均勻^[18]。SRAP標記具有簡便、高效、重復性好、成本低等優(yōu)點，被認為最有可能大規(guī)模應用于分子標記輔助育種的一種技術。唐源江等^[28]應用SRAP標記技術對48個葉子花品種的遺傳多樣性及遺傳關系進行了分析，將試驗材料分為4個類群，認為SRAP標記可較好地反映葉子花種質間的遺傳關系。張安世等^[29]采用SRAP標記技術對18份皂莢種質資源的遺傳多樣性進行了分析，認為種質間的遺傳多樣性水平存在顯著差異，具有豐富的遺傳變異。

本研究利用SRAP標記對18份辣木品系進行分析，群體多態(tài)性條帶百分率達62.50%，說明本試驗篩選的引物可以有效地應用于辣木種質資源間遺傳多樣性分析。同樣，基因多樣性指數(shù)（H）、有效等位基因數(shù)（Ne）和Shannon信息指數(shù)（I）分別為0.2632、1.4777、0.3797，處于較高水平，說明供試材料間在分子水平上存在較為豐富的遺傳多樣性。本研究對常見種植的多油辣木和狹瓣辣木2個種共18份材料進行了分類。從聚類結果的整體來看，與傳統(tǒng)的分類基本類似。不同種的辣木具有較遠的親緣關系，參試材料狹瓣辣木單獨為一類，與其他17份屬于多油辣木種的參試材料親緣關系較遠。聚類結果還顯示，18份辣木種質資源的類型劃分與其地域來源有一定的關聯(lián)性，來源于非洲、印度、中國的辣木自成一類群。本研究同時發(fā)現(xiàn)，同一品系內(nèi)出現(xiàn)嫩梢不同顏色、果莢變長和小葉片增大等形態(tài)學變異并不能與分子標記結果相對應。如多油辣木中S9和S10親緣關系較近，均來源于印度，嫩葉分別表現(xiàn)為紅色和綠色;S17和S18親緣關系較近，均來源于海南，嫩葉分別表現(xiàn)為綠色和紅色，未按性狀特征聚類?！甈KM2品系中表現(xiàn)出同樣的現(xiàn)象。說明這些形態(tài)學變異可能是由于環(huán)境變化或體內(nèi)營養(yǎng)成分不同引起。研究結果表明，來源于緬甸、泰國和中國臺灣的3個未知品系與改良種‘PKM系列具有較近的親緣關系，這與筆者之前利用RAPD和ISSR分子標記分析的結果類似^[26]，這3個國家或地區(qū)在地理位置上靠近印度，其種源很可能來自印度。研究結果表明SRAP分子標記適用于辣木種質資源遺傳多樣性分析，研究結果為辣木種質資源雜交育種親本選擇提供了理論依據(jù)。

參考文獻

[1]劉昌芬. 神奇保健植物辣木及其栽培技術[M]. 昆明： 云南科技出版社， 2013： 1-97.

[2]劉昌芬， 伍??英， 龍繼明. 不同品種和產(chǎn)地辣木葉片營養(yǎng)成分含量[J]. 熱帶農(nóng)業(yè)科技， 2003， 26（4）： 1-2，?14.

[3]周才瓊， 陽長敏， 吳雪琴， 等. 食品資源引進研究：海南產(chǎn)印度辣木的營養(yǎng)價值評價[J]. 西南農(nóng)業(yè)大學學報（自然科學版）， 2005， 27（6）： 763-765.

[4]段瓊芬， 陳思多， 馬李一， 等. 開拓辣木飼料產(chǎn)業(yè)的可行性和必要性分析[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學， 2009， 37（1）： 10-12.

[5]劉子記， 孫繼華， 劉昭華， 等. 特色植物辣木的應用價值及發(fā)展前景分析[J]. 熱帶作物學報， 2014， 35（9）： 1871-?1878.

[6]孔令鈺， 賀艷培， 陶遵威， 等. 辣木生物活性的研究進展[J]. 天津藥學， 2015， 27（2）： 57-59.

[7]王瑞琴， 許文婷， 蔡晨晨， 等. 辣木多糖的研究進展[J]. 廣西糖業(yè)， 2018（4）： 28-30，33.

[8]周丹蓉， 孫凱慧， 葉新福， 等. 辣木葉黃酮苷的分離鑒定及抗氧化活性研究[J]. 熱帶作物學報， 2018， 39（3）： 455-458.

[9]陸??斌， 陳??芳， 張勁峰. 印度的辣木生產(chǎn)和研究[J]. 世界農(nóng)業(yè)， 2005（10）： 32-35.

[10]林宗鏗， 肖??靖， 陳振東， 等. 辣木產(chǎn)業(yè)現(xiàn)狀及其在福建發(fā)展前景[J]. 福建熱作科技， 2015， 40（4）： 63-66.

[11]廖承飛， 李貴華， 韓學琴， 等. 云南辣木產(chǎn)業(yè)發(fā)展的SWOT分析及對策[J]. 中國熱帶農(nóng)業(yè)， 2016（2）： 13-16.

[12]黃麗娜， 程世敏， 趙增賢， 等. 我國辣木產(chǎn)業(yè)發(fā)展的現(xiàn)狀與前景[J]. 貴州農(nóng)業(yè)科學， 2016， 44（7）： 104-107.

[13]梁潘霞， 劉永賢， 沙國新， 等. 廣西辣木產(chǎn)業(yè)發(fā)展現(xiàn)狀及富硒辣木發(fā)展前景展望[J]. 熱帶農(nóng)業(yè)科學， 2017， 37（8）： 88-92.

[14]武新琴， 智??順. 太原引種印度辣木栽培試驗[J]. 山西農(nóng)業(yè)科學， 2012， 40（12）： 1285-1287，?1295.

[15]羅會英， 趙瓊玲， 韓學琴， 等. 辣木花粉活力研究和花粉散粉動態(tài)觀察[J]. 熱帶農(nóng)業(yè)科學， 2018， 38（5）： 24-27.

[16]李蒙蒙， 崔麗潔， 錢忠英， 等. DNA分子標記在不結球白菜遺傳育種中的應用進展[J]. 上海師范大學學報（自然科學版）， 2017， 46（5）： 720-728.

[17]鄒??奕， 吳則東， 興??旺， 等. 甜菜種質資源遺傳多樣性研究進展[J]. 中國糖料， 2018， 40（5）： 73-76，?80.

[18]唐玉海， 郭春芳， 張木清. 相關序列擴增多態(tài)性（SRAP）標記及其應用研究進展[J]. 生物技術通報， 2006（S1）： 237-241.

[19]王曉菡， 郭先鋒， 孫憲芝， 等. SRAP標記在園藝植物研究中的應用[J]. 山東農(nóng)業(yè)大學學報（自然科學版）， 2009， 40（4）： 650-654.

[20]王從彥. SRAP標記在植物遺傳多樣性中的應用進展[J]. 生物技術， 2011， 21（5）： 87-90.

[21]王國澤， 左福元， 曾??兵. SRAP分子標記的研究進展及在植物上的應用[J]. 畜牧與獸醫(yī)， 2013， 45（9）： 92-95.

[22]林藝華， 楊俊杰， 張?zhí)煜瑁?等. 兩種辣木DNA提取方法比較[J]. 福建熱作科技， 2017， 42（1）： 33-35，?38.

[23]韓??闖， 李??敏， 鐘??然， 等. 辣木植物ISSR分子標記的初步研究[J]. 廈門大學學報（自然科學版）， 2008， 47（S2）： 177-180.

[24]李海渤， 唐志明， 任安祥， 等. 用RAPD標記分析辣木的遺傳多樣性[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學， 2009， 37（1）： 49-52.

[25]魏??靜. 多油辣木的遺傳多樣性研究[D]. 北京： 中國林業(yè)科學研究院， 2013.

[26]鄭碩理， 邵建輝， 張敬麗， 等. 云南辣木資源遺傳多樣性的AFLP分析[J]. 云南農(nóng)業(yè)大學學報（自然科學版）， 2016， 31（5）： 850-855.

[27]林藝華， 林宗鏗， 鄭??濤， 等. 16份辣木品系親緣關系和遺傳多樣性分析[J]. 福建熱作科技， 2018， 43（1）： 1-6.

[28]唐源江， 武曉燕， 曹雯靜. 基于SRAP的葉子花種質資源遺傳多樣性及遺傳關系分析[J]. 熱帶亞熱帶植物學報， 2014， 22（2）： 147-154.

[29]張安世， 張素敏， 范定臣， 等. 皂莢種質資源SRAP遺傳多樣性分析及指紋圖譜的構建[J]. 浙江農(nóng)業(yè)學報， 2017， 29（9）： 1524-1530.

責任編輯：謝龍蓮