洪平靜 徐小萍 王靜宇 陳曉慧 申序 林玉玲 賴鐘雄

摘? 要：為了解龍眼4-香豆酸：輔酶A連接酶（Dl4CL）基因家族的分子特性及生物學(xué)功能。采用生物信息學(xué)分析方法進行龍眼4CL基因家族的成員鑒定，蛋白結(jié)構(gòu)域及特性、分子進化樹、體胚發(fā)生過程和組織器官中的表達規(guī)律分析以及可能互作的miRNA預(yù)測。結(jié)果顯示，Dl4CL基因家族包含43個成員，分為6個亞家族;不同亞家族成員的基本理化性質(zhì)包括等電點、相對分子量、氨基酸個數(shù)及信號肽有所差別;Dl4CL蛋白均屬于非分泌型蛋白，具有多個保守的motif;各成員基因結(jié)構(gòu)特性與進化樹中家族成員親緣關(guān)系的遠近有關(guān);Dl4CL啟動子序列包含大量光響應(yīng)元件、厭氧誘導(dǎo)響應(yīng)元件及MYB結(jié)合位點，推測Dl4CL家族成員可能參與龍眼生長發(fā)育過程中黃酮類物種的生物合成以及色素的積累;Dl4CL可能參與不同胚胎發(fā)育過程和不同組織器官的形態(tài)建成;43個Dl4CL成員共有10個受miRNA調(diào)控，并且不同成員受不同的miRNA靶向調(diào)控，推測Dl4CL可能通過與miRNA互作參與體胚發(fā)生、響應(yīng)環(huán)境脅迫等過程。研究表明，Dl4CL在龍眼體胚發(fā)生早期除了參與木質(zhì)素的合成之外，還可能參與色素合成、組織器官特異表達等多種生物代謝途徑，表現(xiàn)其生物學(xué)功能的復(fù)雜性。

關(guān)鍵詞：龍眼;4CL基因家族;基因鑒定;功能分析

中圖分類號：S667.2? ? ? 文獻標識碼：A

Identification and Functional Analysis of 4CL Gene Family During Early Somatic Embryogenesis in Dimocarpus longan Lour.

HONG Pingjing， XU Xiaoping， WANG Jingyu， CHEN Xiaohui， SHEN Xu， LIN Yuling， LAI Zhongxiong*

Institute of Horticultural Biotechnology， Fujian Agriculture and Forestry University， Fuzhou， Fujian 350002， China

Abstract： To understand the molecular characteristics and biological functions of the 4-coumarate： coenzyme A ligase （Dl4CL） gene family in Dimocarpus longan Lour.， bioinformatics analysis was used to identify the members of the 4CL gene family of longan， to analyse the protein domain and characteristics， molecular evolutionary tree， expression patterns in somatic embryogenesis and tissue-organ， and to predict the possible interaction of miRNAs. There were 43 members of the Dl4CL gene family， which could be divided into six subfamilies. The basic physical and chemical properties of different subfamilies including isoelectric point， relative molecular weight， amino acid number and signal peptide were different. Dl4CL proteins belonged to the non-secretory pathway， there were multiple conserved motifs. The structural characteristics of the genes were related to the kinship of family members in the evolutionary tree. The Dl4CL promoter sequence contained a large number of light responses elements， anaerobic induction response elements， and MYB binding sites， which suggesting that the Dl4CL gene family may be involved in the biosynthesis of flavonoids and the accumulation of pigments during the growth and development of longan. Dl4CL gene family might be involved in different somatic embryogenesis process and tissue-organ morphogenesis. A total of 10 Dl4CL members were likely to be regulated by miRNA， and different members were targeted by different miRNA， it was speculated that Dl4CL may interact with miRNA regulation process to participate in somatic embryogenesis， response to environmental stress and other biological processes. This study shows that Dl4CL might not only participate in lignin synthesis， but also participate in a variety of biological metabolic pathways， such as pigment synthesis， tissue-organ specific expression， showing the complexity of its biological functions.

Keywords： longan; 4CL gene family; gene identification; functional analysis

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2021.04.001

4-香豆酸：輔酶A連接酶（4-coumarate： coenzyme A ligase， EC 6. 2. 1. 12）是苯丙烷類代謝途徑中第3個步驟的關(guān)鍵酶，對木質(zhì)素和黃酮類化合物的合成發(fā)揮重要的調(diào)控作用[1]，同時決定著植物中苯丙烷類途徑代謝物質(zhì)的合成方向，是植物與環(huán)境間相互作用的重要樞紐[2]。

近年來，隨著對4CL基因的深入研究，已逐漸從多種植物中分離出4CL基因，如水稻（Oryza sativa）[3]、擬南芥（Arabidopsis thaliana）[4]、歐芹（Petroselinum crispum）[5]、毛白楊（Populus tomentosa Carr.）[6]和煙草（Nicotiana tabacum）[7]等約40多種植物[8-17]。Hu等[18]在對山楊的研究中發(fā)現(xiàn)，Pt4CL1和Pt4CL2是結(jié)構(gòu)和功能完全不同的2個基因，Pt4CL1在木質(zhì)化的組織中特異性表達，參與木質(zhì)素的生物合成;而Pt4CL2則在莖和葉的表皮層中特異性表達，參與類黃酮及其他酚類化合物的生物合成。在擬南芥中[19]，At4CL1、At4CL2、At4CL3和At4CL5均能編碼具有催化活性蛋白的4CL基因，At4CL3受光誘導(dǎo)調(diào)控，藍光能誘導(dǎo)其表達，調(diào)控生成類黃酮物質(zhì)，在葉片、花中具有較高表達，并且具有明顯的晝夜節(jié)律性。前人通過對多種植物的4CL基因序列進行分析發(fā)現(xiàn)[20]，植物中的4CL基因是以基因家族的形式存在，主要被劃分為2類，分別是以擬南芥、煙草等為代表的大部分雙子葉植物和以水稻、玉米等為代表的單子葉植物的4CL基因，這表明4CL基因與單子葉植物向雙子葉植物進化有著密切的關(guān)聯(lián)。也進一步證明4CL基因在植物中開始進化的時間比單子葉植物和雙子葉植物開始進化的時間均要早，甚至可以大膽推測在單子葉植物開始進化之前，植物中的4CL基因就可能已經(jīng)存在[21]。

龍眼（Dimocarpus longan Lour.）原產(chǎn)于中國南部和越南南部的亞熱帶區(qū)域，是我國著名的熱帶亞熱帶果樹，具有很高的藥用價值。研究表明，龍眼胚胎的發(fā)育狀況在很大程度上影響果實的產(chǎn)量和品質(zhì)[22]，但各種生物脅迫及鹽堿、寒冷、干旱等非生物脅迫均會對龍眼胚胎的生長發(fā)育造成不良影響。因此，了解龍眼胚胎發(fā)育過程的生理生化反應(yīng)變化對龍眼的生物學(xué)研究有著重要意義。據(jù)Zimmerman[23]報道，植物體胚和合子胚在分子水平上具有相似性，體胚發(fā)生系統(tǒng)是研究植物胚胎發(fā)育的理想模式系統(tǒng)，尤其對龍眼這類遺傳背景復(fù)雜、雜合度高的喬木。鑒于此，對龍眼體胚發(fā)生過程中4CL基因家族進行全基因組范圍的鑒定和表達模式分析，不僅為研究植物體胚發(fā)生發(fā)育過程中4CL的作用機制提供理論依據(jù)，而且為研究龍眼胚胎發(fā)育過程中4CL的調(diào)控作用提供重要參考。

1? 材料與方法

1.1? 材料

以無患子科紅核子龍眼為研究對象，龍眼全基因組的數(shù)據(jù)庫來源于實驗室構(gòu)建的龍眼基因組數(shù)據(jù)庫（NCBI登錄號：BioProject PRJNA305337）[24]、龍眼轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫（SRA050205）[25]。于Phytozome在線軟件上下載擬南芥以及甜橙（Citrus sinensis）的4CL家族成員序列。

1.2? 方法

1.2.1? Dl4CL基因家族成員的鑒定及其基本理化性質(zhì)分析? 經(jīng)過龍眼基因組數(shù)據(jù)庫的同源對比，通過篩選初步獲得43條具有完整開放閱讀框（open reading frame， ORF）的龍眼4CL候選序列。利用NCBI Blast進行4CL序列同源比對分析，同時結(jié)合該序列的基因注釋，通過DNAMAN 6.0軟件對4CL的CDS、gDNA及啟動子序列進行比對后，可以基本確定龍眼4CL家族的基因成員。采用ExPASy分析43條Dl4CL氨基酸序列的等電點（pI）、分子量（Mr）、氨基酸個數(shù)（aa）、信號肽等相關(guān)數(shù)據(jù)。

1.2.2? Dl4CL家族成員進化樹的構(gòu)建? 為了對Dl4CL基因家族成員進行更加準確地分類，將對4CL基因有系統(tǒng)研究的甜橙和模式植物擬南芥與龍眼一同分析。采用MEGA 6.06軟件的鄰近法（neighbor-joining method）對龍眼的43條序列、擬南芥的23條序列以及甜橙的26條序列，3個物種共92條4CL氨基酸序列進行系統(tǒng)進化樹的構(gòu)建，自展法系數(shù)（bootstrap）設(shè)為1000，最后利用ITOL（https：//itol.embl.de/）在線網(wǎng)站導(dǎo)入進化樹對其進行美化。

1.2.3? Dl4CL基因結(jié)構(gòu)及蛋白結(jié)構(gòu)域分析? 采用GSDS 2.0分析龍眼4CL成員的內(nèi)含子、外顯子特征，通過The MEME Suite（http：//meme-suite.org/）在線分析Dl4CL的蛋白保守基序，基序數(shù)值設(shè)置為20，采用TBtools對獲得的motif進行繪制。

1.2.4? Dl4CL基因啟動子分析? 常規(guī)而言，啟動子序列為CDS ATG上游1500～2000 bp，因此，利用TBtools提取CDS ATG上游2000 bp序列，采用Plant Care在線網(wǎng)站分析Dl4CL家族成員的啟動子特征及順式作用元件特點，利用Excel軟件對預(yù)測結(jié)果進行整理和簡化，最后采用TBtools對順式作用元件進行可視化。其中由于Dl4CL29、Dl4CL27和Dl4CL24三個成員的啟動子序列含有較多N，不進行后續(xù)分析。

1.2.5? Dl4CL基因家族不同組織器官特異表達模式分析? 為了解4CL基因家族在龍眼不同體胚發(fā)生過程和不同組織器官中的生物學(xué)功能，利用龍眼基因組數(shù)據(jù)庫提取的Dl4CL基因成員在體胚發(fā)生的不同階段包括非胚性愈傷組織（non-embr yonic callus， NEC）、胚性愈傷組織（embryonic callus， EC）、不完全胚性緊實結(jié)構(gòu)（incomplete compact pro-embrogenic cultures， ICpEC）、球形胚（globular embryos， GE）和不同組織器官中特異表達的FPKM值，分析Dl4CL基因家族各成員的表達情況。

1.2.6? Dl4CL家族成員受調(diào)控的miRNA預(yù)測? 以本實驗室構(gòu)建的龍眼體胚發(fā)生過程的miRNA文庫為數(shù)據(jù)庫[26]，利用在線軟件psRNATtarget對龍眼的43條4CL基因成員進行可能互作的miRNA預(yù)測，期望值E設(shè)為3.5。

2? 結(jié)果與分析

2.1? Dl4CL家族基因鑒定與蛋白理化性質(zhì)分析

通過4CL家族成員的基因座位置將43個成員命名為Dl4CL1～Dl4CL43。通過對龍眼43條4CL氨基酸序列的蛋白質(zhì)特性分析發(fā)現(xiàn)（表1），該家族的氨基酸個數(shù)在105～1468之間;蛋白質(zhì)分子量在12.05～203.49 kDa之間;等電點在4.49～ 9.12之間，其中pI小于7的有25條，說明大部分為堿性;除了Dl4CL21含有信號肽外，其余42條成員均不含信號肽。

2.2? Dl4CL家族進化樹的構(gòu)建

為進一步了解Dl4CL家族的生物學(xué)功能，利用MEGA 6.06軟件對擬南芥、甜橙和龍眼3個物種共92條氨基酸序列進行系統(tǒng)進化樹的構(gòu)建（圖1）。

參考擬南芥中4CL基因的分類，并結(jié)合聚類分析，可大致將擬南芥、甜橙和龍眼3個物種的4CL基因家族分為6類。Group1中只包含擬南芥和龍眼的4CL家族基因，這部分基因與甜橙4CL基因同源差異性較大;擬南芥、甜橙和龍眼3個物種的4CL基因在其余各組均有存在，具有較高同源性。

2.3? Dl4CL基因結(jié)構(gòu)分析

為進一步分析Dl4CL基因家族的基因結(jié)構(gòu)特征，了解Dl4CL的生物學(xué)功能，對龍眼43條基因的基因結(jié)構(gòu)進行內(nèi)含子、外顯子的數(shù)目及位置分析（圖2）。從圖2中可見，所有4CL基因的核苷酸序列基本可以分為2個部分：CDS區(qū)和UTR區(qū)。結(jié)果顯示，所有Dl4CL基因家族成員的第1個內(nèi)含子都落在成熟編碼序列內(nèi)部，從而有利于區(qū)別信號序列和編碼序列。Dl4CL含有1～23個內(nèi)含子，以6個內(nèi)含子為主，說明Dl4CL基因家族的蛋白質(zhì)編碼區(qū)有很高的保守性。其中Dl4CL18、Dl4CL27、Dl4CL26、Dl4CL3只有1個內(nèi)含子，最多的是Dl4CL20有23個內(nèi)含子，其次是Dl4CL12有22個內(nèi)含子。此外，Dl4CL基因家族成員的基因長度存在明顯差異，其中最短序列Dl4CL22的基因長度只有105 bp，而最長序列Dl4CL37的基因長度為1468 bp，不同分支的Dl4CL基因CDS-UTR結(jié)構(gòu)數(shù)量分布差異較大，可能會影響其基因功能的分化。由于基因同源關(guān)系越近，其結(jié)構(gòu)越相似[27]，因此聚集在同一分枝的Dl4CL基因具有相似的內(nèi)含子、外顯子結(jié)構(gòu)。

2.4? Dl4CL蛋白結(jié)構(gòu)域分析

為了解Dl4CL家族基因在龍眼中的蛋白保守結(jié)構(gòu)域特點與分布情況，使用MEME軟件對4CL氨基酸序列進行保守序列分析，共鑒定出20個motif（圖3）。43條序列中大部分序列（30條以上）包含motif 1～3、motif 5、motif 7、motif 10共6個motif，表明這6個基序在Dl4CL中排序及位置都非常保守。其中最保守的基序motif 1長為29個氨基酸，41個成員中均包含該基序。通過43個序列成員的序列比較，有些序列缺少或多出幾個保守基序，推測植物4CL基因家族的不同成員所表達的功能有所不同。Dl4CL基因家族具有相對保守的蛋白功能結(jié)構(gòu)域（圖4），結(jié)果顯示，Dl4CL家族中有16條基因均含有AFD_class_I superfamily結(jié)構(gòu)域，并且其中有14條基因是只有該結(jié)構(gòu)域。值得注意的是，Dl4CL家族的大部分基因成員都只含有1個蛋白結(jié)構(gòu)域，Dl4CL37是具有最多蛋白結(jié)構(gòu)域的序列，包括FAAL、NRPS_term_dom superfamily、HemY superfamily和PP-binding 4個結(jié)構(gòu)域。猜測Dl4CL基因家族成員廣泛參與龍眼體胚和組織器官發(fā)育過程，在植物的生長發(fā)育過程中發(fā)揮特異的生物學(xué)功能。

2.5? Dl4CL家族啟動子順式作用元件分析

對Dl4CL家族基因上游2000 bp的啟動子順式作用元件進行預(yù)測，以了解Dl4CL不同成員啟動子之間存在的功能差異。其中Dl4CL29、Dl4CL27和Dl4CL24無完整啟動子，無法進行分析。對4CL基因組啟動子序列主要的順式作用元件分析發(fā)現(xiàn)（圖5），大部分Dl4CL基因家族啟動子均包含大量的光響應(yīng)元件、厭氧誘導(dǎo)響應(yīng)元件以及MYB結(jié)合位點，還有部分基因響應(yīng)脫落酸、赤霉酸、水楊酸、茉莉酸甲酯等激素應(yīng)答，以及熱脅迫、低溫脅迫、創(chuàng)傷修復(fù)等非生物脅迫;其中，Dl4CL15、Dl4CL43包含與黃酮類化合物生物合成相關(guān)基因調(diào)控的MYB轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點，該現(xiàn)象表明，Dl4CL可能參與龍眼生長發(fā)育過程的色素合成途徑;此外，發(fā)現(xiàn)65%的基因序列均包含干旱脅迫下MYB轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合位點，還有部分響應(yīng)光脅迫下MYB轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點。由此可見，Dl4CL基因家族中存在大量的核心啟動子元件，不同成員擁有不同種類和數(shù)目的作用元件，從而導(dǎo)致不同成員間功能的差異性和復(fù)雜性。

2.6? Dl4CL家族基因組織特異表達分析

為分析Dl4CL家族成員在龍眼不同體胚發(fā)生階段和組織器官中的表達情況，根據(jù)從龍眼基因組數(shù)據(jù)庫中提取的Dl4CL家族特異表達的FPKM值，利用TBtools繪制成聚類分析圖（圖6）。結(jié)果表明，在不同體胚發(fā)生過程中，大致有9種表達模式：NEC階段上調(diào)表達，其他階段下調(diào)表達

（Dl4CL4、28、6、9、18、11、8、13、20、16、33、35、36）;EC階段上調(diào)表達，其他階段下調(diào)表達（Dl4CL12、1、30、3、41、23、14）;ICpEC階段上調(diào)表達，其他階段下調(diào)表達（Dl4CL39、38、29、27）;GE階段上調(diào)表達，其他階段下調(diào)表達（Dl4CL32）;EC和ICpEC階段上調(diào)表達，其他階段下調(diào)表達（Dl4CL10、17、19、24、5）;NEC和GE階段上調(diào)表達，其他階段下調(diào)表達（Dl4CL34、43）;EC和GE階段上調(diào)表達，其他階段下調(diào)表達（Dl4CL21、25、7、31）;NEC和EC階段上調(diào)表達，其他階段下調(diào)表達（Dl4CL32）;NEC、ICpEC和GE階段上調(diào)表達，其他階段下調(diào)表達（Dl4CL23、14）。其中Dl4CL15在整個體胚發(fā)生過程中均不表達。可見，Dl4CL家族大部分成員在龍眼體胚發(fā)生過程中主要呈現(xiàn)下調(diào)表達的趨勢。

在不同組織器官中（圖7），Dl4CL表達情況總體而言仍是下調(diào)為主，其中Dl4CL1、5、9、15、18、21、25、39在所有組織器官中均幾乎不表達，而Dl4CL4和Dl4CL10則是均有較高表達;Dl4CL26、14、23在果肉階段下調(diào)表達，其他階段均上調(diào)表達;Dl4CL12、16在花蕾和種子階段上調(diào)表達，其他階段下調(diào)表達。在不同組織器官中Dl4CL家族成員表達情況較為分散，但總體仍呈下調(diào)趨勢。

2.7? Dl4CL家族基因miRNA預(yù)測分析

通過psRNATarget在線預(yù)測軟件分析Dl4CL家族受miRNA文庫中靶向調(diào)控的miRNA種類。結(jié)果表明：43個Dl4CL家族成員預(yù)測出10個成員受miRNA調(diào)控（表2）。10個Dl4CL基因家族成員所受到調(diào)控的miRNA種類均不同，可能受10個miRNA調(diào)控。根據(jù)結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)Dl4CL家

族成員受到的miRNA調(diào)控種類較多，基本上是1個基因只受到1種miRNA的調(diào)控，可能是Dl4CL家族的各成員之間的結(jié)構(gòu)與功能特異性所致。

3? 討論

3.1? Dl4CL家族成員可能具有功能上的多樣性

4CL作為苯丙烷類代謝途徑的主要分支酶，除了調(diào)控合成多種次生代謝產(chǎn)物外，還調(diào)控著植物的生長發(fā)育，同時在保護植物免受生物和非生物脅迫的過程中發(fā)揮重要作用[28-30]。目前植物4CL家族的基因組分析已有相應(yīng)的報道[3-17]，且有眾多關(guān)于4CL基因克隆以研究其功能表達及植物生長發(fā)育規(guī)律的報道[18-21]。龍眼4CL基因組具有43條序列，結(jié)合從擬南芥和甜橙中分別提取的23條和26條4CL序列進行系統(tǒng)進化樹的構(gòu)建，結(jié)合聚類分析，可將龍眼4CL分為6大類，在進化上多于擬南芥和甜橙。

結(jié)合Dl4CL基因啟動子順式作用元件分析發(fā)現(xiàn)，有65%的基因序列含有調(diào)控干旱的MYB轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點，還有部分響應(yīng)光脅迫下的MYB轉(zhuǎn)錄結(jié)合因子。MYB轉(zhuǎn)錄因子在植物的形態(tài)建成、生長發(fā)育中起著重要的調(diào)控作用[31]，推測Dl4CL家族基因可能受MYB轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控途徑作用，從而通過改變細胞壁木質(zhì)化程度，提高抵抗逆境脅迫的能力;MYB轉(zhuǎn)錄因子同時還參與植物的初生代謝和次生代謝等多種生命活動，調(diào)節(jié)苯丙烷類代謝途徑[32]。通過對Dl4CL基因家族的順式作用元件分析發(fā)現(xiàn)，Dl4CL43以及Dl4CL15包含參與黃酮類化合物生物合成的MYB轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點，植物中的花青素屬于黃酮類化合物中的一種，而MYB轉(zhuǎn)錄蛋白能夠通過調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)基因的轉(zhuǎn)錄，從而影響花青素的合成積累，因此推測Dl4CL可能參與龍眼生長發(fā)育過程中色素的積累[33-35]。另外還發(fā)現(xiàn)79% Dl4CL啟動子序列均包含茉莉酸甲酯反應(yīng)性響應(yīng)元件，推測Dl4CL家族可能在促進鱗莖的形成與膨大過程中發(fā)揮重要作用[36]。另外值得注意的是，所有基因家族成員都含有光響應(yīng)元件，但包含的數(shù)量不同，個數(shù)介于4～18之間，推測該家族在調(diào)節(jié)植物晝夜節(jié)律上發(fā)揮著重要作用。

在Dl4CL家族基因組織特異表達中發(fā)現(xiàn)，Dl4CL4和Dl4CL10在龍眼非胚性階段和體胚發(fā)生階段均有高表達，暗示這2個基因在龍眼的體胚發(fā)生過程和生長發(fā)育過程均發(fā)揮重要的生物學(xué)功能。在龍眼不同體胚發(fā)生過程和不同組織器官中4CL家族的不同成員存在明顯的功能多樣性，這與前人報道4CL調(diào)控胚胎發(fā)育、花器官發(fā)育及木質(zhì)素生物合成等生物學(xué)功能類似[1]。而Dl4CL家族各成員是如何影響體胚發(fā)生過程和不同組織器官形態(tài)建成的生物機制，還有待后續(xù)進一步深入研究。

miRNA調(diào)控途徑參與植物體的生長發(fā)育，以及各種生物與非生物脅迫響應(yīng)過程，通過調(diào)控轉(zhuǎn)錄水平或轉(zhuǎn)錄后水平翻譯，以及參與轉(zhuǎn)錄水平甲基化起重要作用，在植物體細胞胚胎發(fā)生過程miRNA也具有重要的分子調(diào)控作用[37-38]。通過對Dl4CL家族進行的miRNA預(yù)測，發(fā)現(xiàn)Dl4CL家族43個成員中有10個受miRNA靶向調(diào)控，并且10個家族成員所受調(diào)控的miRNA種類均不同，并且1個Dl4CL基因只受1個miRNA調(diào)控，1種miRNA也只調(diào)控1個4CL基因。其中Dl4CL4在不同龍眼體胚發(fā)生階段和不同組織器官中均有高表達，推測miR5170可能也通過調(diào)控Dl4CL進而參與龍眼體胚的形態(tài)建成。根據(jù)調(diào)控4CL基因家族的miRNA種類特異性，初步推測Dl4CL通過參與miRNA的調(diào)控過程，進而參與龍眼胚胎發(fā)育及不同組織器官發(fā)育過程及多種植物生長發(fā)育過程，但至今關(guān)于miRNA靶向調(diào)控4CL基因家族的具體調(diào)控機制尚無報道，需要進一步深入研究。

3.2? Dl4CL基因可能參與龍眼不同組織部位的生長發(fā)育

4CL作為苯丙烷類代謝途徑中的第3個關(guān)鍵步驟酶，在木質(zhì)素合成過程中發(fā)揮重要的調(diào)控作用。在木質(zhì)素的生物合成過程中發(fā)現(xiàn)，4CL基因?qū)αu基肉桂酸衍生物的表達模式有較大差異。例如，At4CLl、At4CL2編碼的同工酶與木質(zhì)素的合成有著緊密的聯(lián)系，同時At4CLl和At4CL2在幼苗的根中具有很高的表達活性，而At4CL3則主要在植物的花中有較高的表達活性。另外，At4CL3能夠通過激活p-香豆酸作為查耳酮合成酶的底物，參與植物中類黃酮物質(zhì)的合成[39]，同一物種中4CL基因家族中不同成員在器官、組織和細胞的表達上表現(xiàn)出較大的特異性，而這些也是4CL基因組織特異性表達的表現(xiàn)。本次在對Dl4CL家族基因成員在不同體胚發(fā)生過程和不同組織器官的表達研究中也發(fā)現(xiàn)了這一點，Dl4CL11和Dl4CL26在龍眼體胚發(fā)生早期NEC階段具有高表達，并且Dl4CL26包含水楊酸和脫落酸響應(yīng)元件，而水楊酸在促進植物體細胞胚胎發(fā)育和抗環(huán)境脅迫方面發(fā)揮重要作用[40]，因而初步推測Dl4CL11和Dl4CL26對龍眼胚性愈傷組織的形成以及抗逆性的提高起促進作用。另外值得注意的是，Dl4CL4和Dl4CL10在龍眼胚胎發(fā)育早期各階段以及各組織器官中均有較高的表達，并且Dl4CL10含有茉莉酸甲酯反應(yīng)性響應(yīng)元件以及干旱的MYB轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點，可見Dl4CL10在促進龍眼早期胚胎發(fā)育和各器官形成的同時，還參與了黃酮類的生物合成以及色素的積累。4CL基因家族在植物中的組織特異性表達，也反映出4CL家族成員可能參與了植物體內(nèi)不同的生物代謝途徑。

3.3? Dl4CL可能響應(yīng)多種激素應(yīng)答和非生物脅迫

根據(jù)Dl4CL家族的啟動子順式作用元件的分析，得知該家族中的大部分成員具有響應(yīng)多種激素調(diào)控及抵抗非生物脅迫的順式作用元件，包括低溫脅迫、熱脅迫、干旱脅迫等非生物脅迫，響應(yīng)茉莉酸甲酯、ABA、赤霉素等激素應(yīng)答。67%的Dl4CL家族成員可響應(yīng)ABA調(diào)控，ABA不僅影響植物胚胎發(fā)育，同時在種子和芽休眠到萌發(fā)過程中起著重要作用[41]，推測ABA可能通過調(diào)控Dl4CL家族基因的表達進而影響龍眼體胚的生長發(fā)育和組織器官的形態(tài)建成。另外還有79%的Dl4CL家族成員具有茉莉酸甲酯應(yīng)答元件，茉莉酸甲酯是常用的植物激素之一，具有促進合成酚類物質(zhì)的作用，提高植物的抗氧化活性，從而延長果實保質(zhì)期，降低果實貯藏期間的腐爛率[42]。而4CL作為苯丙烷類代謝途徑中的關(guān)鍵酶，4CL酶活性的高低直接影響到酚酸物質(zhì)的合成[43]。因此，茉莉酸甲酯可能通過調(diào)控Dl4CL家族成員的表達，促使龍眼中酚酸的積累，提高果實的抗氧化活性的同時進一步提升果實品質(zhì)。Dl4CL家族大多數(shù)成員響應(yīng)多種植物激素調(diào)控，說明Dl4CL基因家族在龍眼生長發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用。

據(jù)報道，4CL基因家族不僅在植物的生長發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用，同時能夠響應(yīng)非生物脅迫[44]。細胞中活性氧（ROS）產(chǎn)生與清除之間的平衡容易被非生物脅迫破壞，導(dǎo)致ROS濃度過高以及生物膜、蛋白質(zhì)等的氧化性損傷，從而抑制植物的生長發(fā)育[45-46]。在Dl4CL基因家族中，約有60%的成員能夠響應(yīng)低溫脅迫、熱脅迫、干旱脅迫等非生物脅迫。有研究發(fā)現(xiàn)，棉花在干旱條件下，Gh4CL7能夠通過增加木質(zhì)素含量，促進根系伸長，關(guān)閉氣孔，從而增強對干旱脅迫的耐受性[47]，而ABA在干旱脅迫下根的發(fā)育中起著至關(guān)重要的作用[48]，推測Dl4CL通過響應(yīng)ABA激素應(yīng)答，促進龍眼根系伸長，增加根部對水分的吸收，從而抵抗干旱脅迫。通過對植物激素的響應(yīng)影響植物的生長發(fā)育，從而提高植物的抵抗非生物脅迫能力，推測Dl4CL家族成員中響應(yīng)激素應(yīng)答的順式作用元件與植物抵抗非生物脅迫能力必然有著直接或間接的關(guān)系。但Dl4CL家族成員在龍眼體胚發(fā)生階段如何響應(yīng)激素應(yīng)答和抵抗非生物脅迫的具體機制還需要進一步深入研究。

參考文獻

[1]田曉明， 顏立紅， 向光鋒， 等. 植物4香豆酸： 輔酶A連接酶研究進展[J]. 生物技術(shù)通報， 2017， 33（4）： 19-26.

[2]趙淑娟， 劉? 滌， 胡之璧. 植物4-香豆酸： 輔酶A連接酶[J]. 植物生理學(xué)通訊， 2006， 42（3）： 529-538.

[3]Zhao Y， Kung S D， Dube S K. Nucleotide sequence of rice 4-coumarate： CoA ligase gene， 4-CL.1[J]. Nucleic Acids Research， 1990， 18（20）： 6144-6144.

[4]Hamberger B， Hahlbrock K. The 4-coumarate： CoA ligase gene family in Arabidopsis thaliana comprises one rare， sinapate-activating and three commonly occurring isoenzymes[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America， 2004， 101（7）： 2209-2214.

[5]Lozoya E， Hoffmann H， Douglas C， et al. Primary structures and catalytic properties of isoenzymes encoded by the two 4-coumarate： CoA ligase genes in parsley[J]. European Journal of Biochemistry， 1988， 176（3）： 661-667.

[6]范丙友， 陸? 海， 蔣湘寧. 維管植物4-香豆酸： 輔酶A連接酶（4CL）研究進展[J]. 林業(yè)科學(xué)， 2007， 43（2）： 96-103.

[7]Lu H， Zeng Q Y， Zhao Y L， et al. Xylem-specific expression of a GRP1.8 promoter：：4CL gene construct in transgenic tobacco[J]. Plant Growth Regulation， 2003， 41（3）： 279-286.

[8]韓? 欣. 馬尾松木質(zhì)素合成途徑中4CL基因克隆及RNA干擾載體構(gòu)建研究[D]. 長沙： 中南林業(yè)科技大學(xué)， 2012.

[9]侯思宇， 趙蓋超， 劉榮華， 等. 苦蕎Ft4CL基因克隆、生物信息學(xué)及分子進化分析[J]. 山西農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版）， 2015， 35（1）： 411-415.

[10]胡尚連， 曹? 穎， 黃勝雄， 等. 慈竹4CL基因的克隆及其生物信息學(xué)分析[J]. 西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版）， 2009， 37（8）： 204-210.

[11]霍? 松， 陳? 慧， 朱瓊?cè)A， 等. 象草4CL基因片段的克隆及RNAi表達載體構(gòu)建[J]. 草業(yè)學(xué)報， 2012， 21（1）： 296-301.

[12]李珊珊. 香鱗毛蕨4CL基因家族的克隆及功能驗證[D]. 哈爾濱： 東北農(nóng)業(yè)大學(xué)， 2015.

[13]劉文哲. 紫穗槐UGPase和4CL基因的克隆及在植物中的轉(zhuǎn)化與表達[D]. 大連： 大連理工大學(xué)， 2002.

[14]龍松華， 李? 翔， 陳? 信， 等. 亞麻4CL基因克隆及RNAi遺傳轉(zhuǎn)化[J]. 西北植物學(xué)報， 2014， 34（12）： 2405-2411.

[15]母洪娜， 孫陶澤， 徐? 晨， 等. 桂花（Osmanthus fragrans Lour.）4-香豆酸輔酶A連接酶（4CL）基因克隆與表達分析[J]. 分子植物育種， 2016， 14（3）： 536-541.

[16]倪志勇， 王? 娟， 呂? 萌， 等. 棉花4-香豆酸輔酶A連接酶基因克隆及原核表達[J]. 西北植物學(xué)報， 2010， 30（3）： 429-436.

[17]楊冬梅， 王學(xué)敏， 高洪文， 等. 東方山羊豆4香豆酸： 輔酶A連接酶（4CL）基因的克隆和熒光定量表達分析[J]. 草地學(xué)報， 2010， 18（4）： 533-538.

[18]Hu W J， Kawaoka A， Tsai C J， et al. Compartmentalized expression of two structurally and functionally distinct 4-coumarate： CoA ligase genes in Aspen （Populus tremuloides）[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America， 1998， 95 （9）： 5407-5412.

[19]Ehlting J， Buéttner D， Wang Q， et al. Three 4-coumarate： Coenzyme A ligases in Arabidopsis thaliana represent two evolutionary classes in angiosperms[J]. Plant Journal， 1999， 19（1）： 9-20.

[20]黃勝雄， 胡尚連， 孫? 霞， 等. 木質(zhì)素生物合成酶4CL基因的遺傳進化分析[J]. 西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版）， 2008， 36（10）： 199-206.

[21]Stuible H P， Buttner D， Ehlting J. Mutational analysis of 4-coumarate： CoA ligase identifies functionally important amino acids and verifies its close relationship to other adenylate forming enzymes[J]. FEBS Letters， 2000， 467（1）： 117-122.

[22]Lai Z X， Lin Y L. Analysis of the global transcriptome of longan （Dimocarpus longan Lour.） embryogenic callus using illumina paired-end sequencing[J]. BMC Genomics， 2013， 14（1）： 561.

[23]Zimmerman J L. Somatic embryogenesis： A model for early development in higher plants[J]. Plant Cell， 1993， 5（10）： 1411-1423.

[24]Lin Y L， Min J M， Lai R L， et al. Genome-wide sequencing of longan （Dimocarpus longan Lour.） provides insights into molecular basis of its polyphenol-rich characteristics[J]. Gigascience， 2017， 6（5）： 1-14.

[25]Chen Y K， Xu X P， Liu Z X， et al. Global scale transcriptome analysis reveals differentially expressed genes involve in early somatic embryogenesis in Dimocarpus longan Lour.[J]. BMC genomics， 2020， 21（1）： 4.

[26]Lin Y L， Lai Z X. Comparative analysis reveals dynamic changes in miRNAs and their targets and expression during somatic embryogenesis in Longan （Dimocarpus longan Lour.）[J]. PLoS One， 2013， 8（4）： e60337..

[27]楊? 婧， 黃? 原， 汪曉陽. 直系同源基因的識別方法與數(shù)據(jù)庫[J]. 生命科學(xué)研究， 2013， 17（3）： 274-277.

[28]Gui J S， Shen J H， Li L G. Functional characterization of evolutionarily divergent 4-coumarate： Coenzyme A ligases in rice[J]. Plant Physiology， 2011， 157（2）： 574-586.

[29]Zhang C H， Ma T， Luo W C， et al. Identification of 4CL genes in desert poplars and their changes in expression in response to salt stress [J]. Genes， 2015， 6（3）： 901-917.

[30]Naik P， Wang J P， Sederof R. Assessing the impact of the 4CL enzyme complex on the robustness of monolignol biosynthesis using metabolic pathway analysis[J]. PLoS One， 2018， 13（3）： 0193896.

[31]Li J L， Han G L， Sun C F， et al. Research advances of MYB transcription factors in plant stress resistance and breeding[J]. Plant Signaling & Behavior， 2019， 14 （8）： 16131131.

[32]張婧嫻， 趙淑娟. 轉(zhuǎn)錄因子MYB在光誘導(dǎo)的苯丙烷次生代謝中的作用[J]. 藥物生物技術(shù)， 2015， 22（5）： 461-464.

[33]楊? 雪， 雒? 軍， 王引權(quán). 調(diào)控植物黃酮類化合物生物合成的MYB轉(zhuǎn)錄因子研究進展[J]. 甘肅中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報， 2018， 35（6）： 77-81.

[34]王軍妮， 黃艷紅， 牟志美， 等. 植物次生代謝物黃酮類化合物的研究進展[J]. 蠶業(yè)科學(xué)， 2007， 33（3）： 499-505.

[35]王岸娜， 向? 琳， 吳? 立. 果蔬中黃酮類物質(zhì)的研究進展[J]. 河南工業(yè)大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版）， 2019， 40（3）： 118-125.

[36]李春香， 周? 燮. MeJA對大蒜鱗莖膨大及內(nèi)源激素含量的影響[J]. 生命科學(xué)研究， 2002， 6（2）： 183-185.

[37]Zhang J， Xue B Y， Gai M Z， et al. Small RNA and transcriptome sequencing reveal a potential miRNA-mediated interaction network that functions during somatic embryogenesis in Lilium pumilum DC. Fisch.[J]. Frontiers in Plant Science， 2017， 8： 566.

[38]Kumar V， Van Staden J. New insights into plant somatic embryogenesis： an epigenetic view [J]. Acta Physiologiae Plantarum， 2017， 39（9）： 194.

[39]Li Y， Kim J I， Pysh L， et al. Four isoforms of Arabidopsis thaliana 4-coumarate： CoA ligase （4CL） have overlapping yet distinctroles in phenylpropanoid metabolism[J]. Plant Physiology， 2015， 169（4）： 2409-2421.

[40]康國章， 孫谷疇， 王正詢. 水楊酸在植物抗環(huán)境脅迫中的作用[J]. 廣西植物， 2004， 24（2）： 178-183.

[41]傅梅萍. 植物激素ABA/GA代謝與響應(yīng)通路基因表達在秋茄（Kandelia obovata）顯胎生過程中的調(diào)控作用[D]. 廈門： 廈門大學(xué)， 2018.

[42]李? 麗， 董銀卯， 姚? 霞， 等. 茉莉酸甲酯對植物酚類成分代謝影響研究進展[J]. 中藥材， 2014， 37（11）： 2109-2112.

[43]焦蒙麗. 水楊酸和茉莉酸甲酯對丹參培養(yǎng)細胞迷迭香酸生物合成的誘導(dǎo)作用[D]. 楊凌： 西北農(nóng)林科技大學(xué)， 2012.

[44]Sun H Y， Li Y， Feng S Q， et al. Analysis of five rice 4-coumarate： Coenzyme A ligase enzyme activity and stress response for potential roles in lignin and favonoid biosynthesis in rice[J]. Biochemical Biophysical Research Communications， 2013， 430 （3）： 1151-11156.

[45]Hossain M A， Bhattacharjee S， Armin S M， et al. Hydrogen peroxide priming modulates abiotic oxidative stress tolerance： insights from ROS detoxification and scavenging[J]. Frontiers in Plant Science， 2015， 6： 420.

[46]Jain G， Gould K S. Are betalain pigments the functional homologues of anthocyanins in plants？[J]. Environmental and Experimental Botany， 2015， 119： 48-53.

[47]Sun S C， Xiong X P， Zhang X L， et al. Characterization of the Gh4CL gene family reveals a role of Gh4CL7 in drought tolerance[J]. BMC Plant Biology， 2020， 20， DOI： 10.21203/rs.2.17480/v3.

[48]Rowe J H， Topping J F， Liu J， et al. Abscisic acid regulates root growth under osmotic stress conditions via an interacting hormonal network with cytokinin， ethylene and auxin [J]. New Phytologist， 2016， 211（1）： 225-239.

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