張 弓黃劍林

（延安大學(xué)附屬醫(yī)院臨床藥學(xué)科，陜西 延安716000）

轉(zhuǎn)移生長(zhǎng)因子?β（TGF?β）是一種具有多種生物學(xué)功能的細(xì)胞因子，可調(diào)控多種細(xì)胞（如巨噬細(xì)胞、T 細(xì)胞和B 細(xì)胞、造血細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和樹突細(xì)胞等）的增殖、分化、凋亡、粘附和遷移。TGF?β 包括3 個(gè)異構(gòu)體，分別為TGF?β1、TGF?β2、TGF?β3。其中TGF?β1 在組織纖維化和組織修復(fù)過(guò)程發(fā)揮重要作用，TGF?β1 可通過(guò)激活TGF?β／Smad 信號(hào)通路而引發(fā)組織器官產(chǎn)生纖維化。而且，大量研究表明多種癌癥（如乳腺癌、前列腺癌、肺癌、肝癌、結(jié)腸癌等）的發(fā)生與TGF?β1 的高表達(dá)具有密切聯(lián)系。因此，TGF?β1 抑制劑的開(kāi)發(fā)在器官纖維化以及多種癌癥的治療中具有廣闊的應(yīng)用前景［1］。

藏藥典籍《晶珠本草》 中記載阿仲具有“清肺中之熱，止咳，治肺炎”等功效。阿仲的基源藥材有多種，團(tuán)狀雪靈芝Arenaria polytrichoides是其中一種，隸屬于石竹科蚤綴屬，為多年生墊狀草本植物，主要分布于西藏、四川西部和青海東南部海拔3 500～5 300 m 的高山草甸、倒石堆和碎石帶地段［2?3］，截止到目前，關(guān)于團(tuán)狀雪靈芝化學(xué)成分的報(bào)道甚少，伍賢學(xué)等［4?5］首次報(bào)道了該植物中的10 個(gè)化合物；王國(guó)軍等［6］從該植物中分離得到10個(gè)化合物，其中8 個(gè)為首次獲得，并對(duì)其抗炎活性進(jìn)行了評(píng)價(jià)。

本課題組一直致力于從傳統(tǒng)藏藥中篩選TGF?β1 抑制劑的研究，并將所篩選的活性化合物用于肺纖維化和肺癌的治療。團(tuán)狀雪靈芝在藏族同胞生活區(qū)域被廣泛用于肺間質(zhì)性疾病的治療，中醫(yī)將肺纖維化歸為肺間質(zhì)病，所以，本實(shí)驗(yàn)擬對(duì)團(tuán)狀雪靈芝的化學(xué)成分和抑制TGF?β1 活性進(jìn)行研究，通過(guò)多種色譜分析分離技術(shù)和波譜解析方法結(jié)合體外細(xì)胞篩選模型，對(duì)團(tuán)狀雪靈芝抑制TGF?β1 的化學(xué)成分進(jìn)行探究，以期為其臨床治療肺間質(zhì)病提供理論依據(jù)，為其進(jìn)一步開(kāi)發(fā)應(yīng)用提供參考。

1 材料

AM?600核磁共振儀（TMS為內(nèi)標(biāo)，德國(guó)Bruker 公司）；Saturn 2200 型高分辨質(zhì)譜儀（美國(guó)Varian 公司）；硅膠GF254（青島碩遠(yuǎn)硅膠科技有限公司）；D101 大孔吸附樹脂、柱色譜硅膠（100～200 目）、微孔樹脂CHP20P（日本三菱化學(xué)公司）；安捷倫1260 高效液相色譜儀（美國(guó)安捷倫科技公司）；LC?600P 制備液相色譜儀（南京科捷分析儀器有限公司）；反相TSKgel ODS?100V C18色譜柱［250 mm×20 mm、250 mm×4.6 mm，東曹（上海）生物科技有限公司］；BSC?1600IB2 型生物安全柜 ［蘇潔醫(yī)療器械（蘇州）有限公司］；HF160WCO2培養(yǎng)箱（力康生物醫(yī)療科技控股有限公司）；CKX41SF 倒置顯微鏡（日本奧林巴斯公司）。96 孔板、細(xì)胞培養(yǎng)皿（上海晶安生物科技有限公司）；Gibco 胎牛血清［賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司］；比菲尼酮［美國(guó)西格瑪奧德里奇（上海）貿(mào)易有限公司］；ELISA（TGF?β1）檢測(cè)試劑盒（北京索萊寶生物科技有限公司）；RAW264.7 細(xì)胞株（中國(guó)南京科佰生物科技有限公司）。團(tuán)狀雪靈芝全草購(gòu)于青海省西寧市康樂(lè)藥材市場(chǎng)，經(jīng)中國(guó)科學(xué)院三江源國(guó)家公園研究院盧學(xué)鋒研究員鑒定為石竹科蚤綴屬的團(tuán)狀雪靈芝Arenaria polytrichoides。

2 提取與分離

取陰干后團(tuán)狀雪靈芝全草，粉碎后稱取9 kg，室溫下用90%乙醇進(jìn)行浸取，每次8 h，共3 次，料液比為1 ∶8，所得浸取液收集后減壓真空濃縮，濃縮至一定體積，于真空冷凍干燥機(jī)中進(jìn)行冷凍干燥，得粉末狀提取物527 g，稱取300 g，加適量水混懸分散，上樣于大孔吸附樹脂，分別以水、20%乙醇?水、40%乙醇?水、60%乙醇?水、80%乙醇?水、100% 乙醇?水進(jìn)行梯度洗脫，減壓回收洗脫劑，TLC 薄層點(diǎn)板合并得到F1（39 g）、F2（85 g）、F3（42 g）、F4（20 g）4 個(gè)組分。稱取80 g F2 組分，加硅膠適量進(jìn)行拌樣，過(guò)硅膠柱色譜，三氯甲烷?甲醇（30 ∶1、25 ∶1、20 ∶1、15 ∶1、10 ∶1）進(jìn)行梯度洗脫，得到5 個(gè)組分F2?1～F2?5，F(xiàn)2?3 經(jīng)MCI 微孔樹脂柱色譜，分別以20% 甲醇?水、40%甲醇?水、60% 甲醇?水、80% 甲醇?水、100% 甲醇進(jìn)行梯度洗脫，得到化合物1（6.4 mg）、6（5.2 mg）、9（7.3 mg）和5 個(gè)組分F2?3?1～F2?3?5，F(xiàn)2?3?1 經(jīng)過(guò)硅膠柱色譜，三氯甲烷?丙酮（25 ∶1、20 ∶1、15 ∶1、10 ∶1、5 ∶1）進(jìn)行梯度洗脫，得到5 個(gè)組分，半制備液相反復(fù)純化，得化合物2（2.3 mg）、3（3.3 mg）、10（2.8 mg）、12（3.3 mg）、16（4.1 mg）；F2?3?2 經(jīng)硅膠柱色譜，石油醚?乙酸乙酯（20 ∶1、15 ∶1、10 ∶1、5 ∶1）梯度洗脫，得到4 個(gè)精細(xì)組分，經(jīng)高效半制備液相色譜反復(fù)純化，得化合物7（2.4 mg）、8（2.6 mg）、11（4.1 mg）、13（2.1 mg）；F2?3?3 經(jīng)高效半制備液相色譜反復(fù)純化，得化合物4（3.6 mg）、5（2.9 mg）、14（3.7 mg）、15（4.4 mg）。

3 結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1：黃色粉末。ESI?MSm／z：215.3［M＋H］＋。1H?NMR（600 MHz，DMSO?d6）δ：7.24（1H，ddd，J＝7.6，1.2，0.8 Hz，H?6），7.32（1H，ddd，J＝8.2，7.1，1.2 Hz，H?7），7.51（1H，ddd，J＝8.2，1.1，0.8 Hz，H?8），8.24（1H，ddd，J＝7.6，1.2，0.8，H?5），11.74（1H，brs，H?9），13.22（IH，brs，H?2）；13C?NMR（150 MHz，DMSO?d6）δ：158.1（C?l），156.8（C?3），169.1（C?4），120.4（C?5），122.8（C?6），125.3（C?7），112.7（C?8），114.6（C?11），122.0（C?12），136.7（C?13），134.2（C?20）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［7］ 報(bào)道基本一致，故鑒定為1，2，3，4?四氫?1，3，4?三羰基?β?咔啉。

化合物2：黃色粉末。ESI?MSm／z：431.1［M?H］－。1H?NMR（600 MHz，DMSO?d6）δ：5.21（1H，d，J＝7.5 Hz，H?1″），6.51（1H，d，J＝2.0 Hz，H?6），6.79（1H，d，J＝2.0 Hz，H?8），6.91（1H，s，H?3），7.03（2H，d，J＝8.5 Hz，H?3′，5′），7.88（2H，d，J＝8.5 Hz，H?2′，6′），12.87（1H，s，5?OH）；13C?NMR（150 MHz，DMSO?d6）δ：162.4（C?2），101.1（C?3），181.0（C?4），160.2（C?5），98.9（C?6），162.0（C?7），93.8（C?8），156.0（C?9），104.2（C?10），121.8（C?1′），127.6（C?2′，6′），115.0（C?3′，5′），160.8（C?4′），99.6（C?1″），72.1（C?2″），75.5（C?3″），68.6（C?4″），76.3（C?5″），60.7（C?6″）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［8］ 報(bào)道基本一致，故鑒定為芹菜素?7?O?β?D?葡萄糖苷。

化合物3：黃色粉末。ESI?MSm／z：213.3［M＋H］＋。1H?NMR（600 MHz，DMSO?d6）δ：11.33（1H，s，H?9），8.39（1H，d，J＝5.5 Hz，H?3），8.37（1H，d，J＝5.5 Hz，H?4），8.21（1H，d，J＝8.0 Hz，H?5），7.67（1H，d，J＝8.0 Hz，H?8），7.59（1H，d，J＝8.0 Hz，H?7），7.28（1H，d，J＝8.0 Hz，H?6）；13C?NMR（150 MHz，DMSO?d6）δ：140.8（C?1），134.3（C?3），117.3（C?4），121.2（C?5），128.6（C?6），119.8（C?7），112.7（C?8），130.8（C?10），118.8（C?11），130.9（C?12），134.8（C?13），164.7（1?COOH）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［9］ 報(bào)道基本一致，故鑒定為β?咔啉?1?羧酸。

化合物4：淡黃色固體。ESI?MSm／z：241.6［M ＋H］＋。1H?NMR（600 MHz，CD3OD）δ：8.53（1H，d，J＝4.8 Hz，3?H），8.23（1H，d，J＝4.8 Hz，4?H），8.18（1H，dd，J＝7.6，0.7 Hz，5?H），7.57（2H，m，7?H，8?H），7.42（1H，ddd，J＝7.6，5.2，2.5 Hz，6?H），5.22（2H，s，2′?H），3.60（3H，s，?OCH3）；13C?NMR（150 MHz，CD3OD）δ：133.2（C?1），137.1（C?3），118.4（C?4），130.7（C?4a），120.5（C?4b），121.8（C?5），120.9（C?6），128.5（C?7），111.1（C?8），140.2（C?8a），134.2（C?9a），73.9（C?2′），198.6（?C ＝O），58.9（?OCH3）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［10］ 報(bào)道基本一致，故鑒定為蚤綴堿A。

化合物5：淡黃色粉末。ESI?MSm／z：345.2［M＋H］＋。1H?NMR（600 MHz，DMSO?d6）δ：7.60（1H，s，H?5），7.69（1H，s，H?5′），3.96（3H，s，H?4′），3.98（3H，s，H?3′），3.99（3H，s，H?3）；13C?NMR（150 MHz，DMSO?d6）δ：111.9（C?1），142.0（C?2），140.9（C?3），154.0（C?4），113.0（C?5），114.1（C?6），160.1（C?7），113.2（C?1′），141.9（C?2′），142.1（C?3′），155.3（C?4′），107.9（C?5′），113.9（C?6′），160.1（C?7′），58.0（4′?OCH3），61.9（3′?OCH3），63.8（3?OCH3）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［11］ 報(bào)道基本一致，故鑒定為3，3′，4′?三?O?甲基鞣花酸。

化合物6：淡黃色粉末。ESI?MSm／z：285.1［M?H］－。1H?NMR（600 MHz，CD3OD）δ：13.05（1H，s，5?OH），7.38（1H，dd，J＝2.5，7.5 Hz，H?6′），7.35（1H，d，J＝2.5 Hz，H?2′），6.87（1H，d，J＝7.5 Hz，H?5′），6.70（1H，s，H?3），6.50（1H，d，J＝2.5 Hz，H?8），6.16（1H，d，J＝2.5 Hz，H?6）；13C?NMR（150 MHz，CD3OD）δ：115.5（C?2），102.6（C?3），181.6（C?4），163.6（C?5），98.5（C?6），163.8（C?7），93.8（C?8），162.1（C?9），103.7（C?10），121.7（C?1′），149.7（C?2′），156.9（C?3′），145.6（C?4′），112.9（C?5′），118.9（C?6′）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［12］ 報(bào)道基本一致，故鑒定為木犀草素。

化合物7：淺黃色粉末。ESI?MSm／z：179.3［M?H］－。1H?NMR（600 MHz，DMSO?d6）δ：6.20（1H，d，J＝14.5 Hz，H?8），6.81（1H，d，J＝8.5 Hz，H?5），6.89（1H，dd，J＝2.5，8.5 Hz，H?6），6.98（1H，d，J＝2.5 Hz，H?2），7.47（1H，d，J＝14.5 Hz，H?7）；13C?NMR（150 MHz，DMSO?d6）δ：126.8（C?1），114.8（C?2），145.9（C?3），148.7（C?4），115.8（C?5），121.9（C?6），146.5（C?7），114.6（C?8），170.7（C?9）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［13］ 報(bào)道基本一致，故鑒定為咖啡酸。

化合物8：棕黃色結(jié)晶（甲醇）。ESI?MSm／z：447.4 ［M?H］－。1H?NMR（600 MHz，DMSO?d6）δ：7.42（1H，dd，J＝8.7，2.0 Hz，H?6′），7.39（1H，d，J＝2.0 Hz，H?2′），6.91（1H，d，J＝8.7 Hz，H?5′），6.75（1H，d，J＝1.8 Hz，H?8），6.41（1H，d，J＝1.8 Hz，H?6），6.72（1H，s，H?3），5.12（1H，d，J＝6.9 Hz，Glu1″?H）；13C?NMR（150 MHz，DMSO?d6）δ：163.5（C?2），102.2（C?3），180.9（C?4），160.2（C?5），98.6（C?6），163.0（C?7），93.8（C?8），156.0（C?9），105.3（C?10），121.4（C?1′），112.6（C?2′），144.6（C?3′），148.9（C?4′），116.0（C?5′），118.1（C?6′），98.9（C?1″），72.01（C?2″），75.4（C?3″），68.6（C?4″），76.7（C?5″），60.6（C?6″）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［14］ 報(bào)道基本一致，故鑒定為木犀草素?7?O?β?D?葡萄糖苷。

化合物9：黃色結(jié)晶（甲醇）。ESI?MSm／z：431.2 ［M?H］－。1H?NMR（600 MHz，DMSO?d6）δ：12.96（1H，s，OH?5），10.81（1H，brs，OH?7），10.33（1H，brs，OH?4′），7.92（2H，d，J＝8.8 Hz，H?2′，6′），6.91（2H，d，J＝8.8 Hz，H?3′，5′），6.82（1H，s，H?3），6.23（1H，d，J＝2.1 Hz，H?6），6.52（1H，d，J＝2.1 Hz，H?8）；13C?NMR（150 MHz，DMSO?d6）δ：162.7（C?2），102.7（C?3），180.7（C?4），160.1（C?5），97.9（C?6），163.1（C?7），92.9（C?8），157.3（C?9）.102.8（C?10），121.2（C?1′），127.4（C?2′，6′），114.9（C?3′，5′），160.4（C?4′）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［15］報(bào)道基本一致，故鑒定為芹菜素。

化合物10：黃色結(jié)晶（甲醇）。ESI?MSm／z：273.6 ［M＋H］＋。1H?NMR（600 MHz，DMSO?d6）δ：12.18（1H，s，5?OH），10.83（1H，s，7?OH），9.64（1H，s，4′?OH），7.38（2H，d，J＝8.4 Hz，H?2′，6′），6.85（2H，d，J＝8.8 Hz，H?3′，5′），5.90（2H，s，H?6，8），5.46（1H，dd，J＝13.2，3.0 Hz，H? 2），3.29（1H，dd，J＝17.0，13.0 Hz，H?3α），2.69（1H，dd，J＝16.8，2.8 Hz，H?3β）；13C?NMR（150 MHz，DMSO?d6）δ：77.5（C?2），41.0（C?3），195.5（C?4），162.5（C?5），94.8（C?6），165.7（C?7），94.0（C?8），162.0（C?9），102.8（C?10），127.9（C?1′），127.4（C?2′），114.2（C?3′），156.7（C?4′），114.2（C?5′），127.4（C?6′）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［16］ 報(bào)道基本一致，故鑒定為柚皮素。

化合物11：黃色粉末。ESI?MSm／z：463.1［M?H ］－。1H?NMR（600 MHz，DMSO?d6）δ：12.68（1H，s，5?OH），10.79（1H，s，7?OH），9.66（1H，s，4?OH），9.22（1H，s，3?OH），6.13（1H，d，J＝2.4 Hz，H?6），6.37（1H，d，J＝2.4 Hz，H?8），7.58（1H，d，J＝2.4 Hz，H?2′），6.91（1H，d，J＝8.4 Hz，H?5′），7.62（1H，dd，J＝8.4，2.4 Hz，H?6′），5.51（1H，d，J＝7.2 Hz，glc H?1），3.11～3.59（6H，m，glc H?2，3，4，5，6a，6b）；13C?NMR（150 MHz，DMSO?d6）δ：155.8（C?2），132.9（C?3），176.7（C?4），160.6（C?5），97.8（C?6），163.8（C?7），92.9（C?8），155.7（C?9），102.7（C?10），120.7（C?1′），114.8（C?2′），143.9（C?3′），147.9（C?4′），115.7（C?5′），120.9（C?6′），101.1（C?1″），73.9（C?2″），75.8（C?3″），69.7（C?4″），76.9（C?5″），61.2（C?6″）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［17］ 報(bào)道基本一致，故鑒定為槲皮素?3?O?β?D?葡萄糖。

化合物12：黃色針晶。ESI?MSm／z：331.0［M＋H］＋。1H?NMR（600 MHz，DMSO?d6）δ：12.32（1H，s，5?OH），7.69（1H，d，J＝2.5 Hz，H?2′），7.88（1H，dd，J＝2.5，8.0 Hz，H?6′），6.89（1H，d，J＝8.0 Hz，H?5′），6.69（1H，d，J＝2.5 Hz，H?8），6.29（1H，d，J＝2.5 Hz，H?6），3.79（3H，s，3′?OCH3），3.91（3H，s，7?OCH3）；13C?NMR（150 MHz，DMSO?d6）δ：148.9（C?2），135.8（C?3），177.6（C?4），161.9（C?5），96.9（C?6），166.1（C?7），93.1（C?8），157.1（C?9），104.8（C?10），122.7（C?1′），114.1（C?2′），146.9（C?3′），148.8（C?4′），116.0（C?5′），123.6（C?6′），55.7（?OCH3），56.2（?OCH3）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［18］報(bào)道基本一致，故鑒定為鼠李秦素。

化合物13：黃色粉末。ESI?MSm／z：549.2［M ＋ Na］＋。1H?NMR（600 MHz，DMSO?d6）δ：12.83（1H，s，5?OH），10.85（1H，s，7?OH），8.76（1H，s，4″?OH），7.28（2H，s，H?2′，6′），6.98（1H，d，J＝1.6 Hz，H?2″），6.95（1H，s，H?3），6.81（1H，dd，J＝8.2，1.6 Hz，H?6″），6.69（1H，d，J＝8.2 Hz，H?5″），6.48（1H，brs，H?8），6.16（1H，brs，H?6），4.85（1H，d，J＝5.0 Hz，H?7″），4.26（1H，m，H?8″），3.86（6H，s，3′，5′?OCH3），3.74（3H，s，3″?OCH3），3.64（1H，dd，J＝11.5，4.7 Hz，9″?CH2），3.27（1H，dd，J＝11.5，4.8 Hz，9″?CH2）；13C?NMR（150 MHz，DMSO?d6）δ：181.6（C?4），166.0（C?7），162.8（C?2），161.4（C?5），157.5（C?9），153.0（C?3′，5′），147.0（C?3″），145.4（C?4″），139.8（C?4′），133.0（C?1″），125.5（C?1′），119.2（C?6″），114.7（C?5″），111.1（C?2″），104.7（C?3），104.3（C?2′，6′），103.3（C?10），99.4（C?6），94.5（C?8），86.9（C?8″），71.6（C?7″），60.4（C?9″），56.4（3′，5′?OCH3），55.6（3″?OCH3）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［19］ 報(bào)道基本一致，故鑒定為salcolin A。

化合物14：黃色粉末。ESI?MSm／z：269.2［M＋H］＋。1H?NMR（600 MHz，DMSO?d6）δ：7.56（1H，d，J＝15.6 Hz，H?β），6.46（1H，d，J＝15.6 Hz，H?α），6.79（1H，d，J＝8.2 Hz，H?5），7.09（1H，d，J＝1.9 Hz，H?2），7.11（1H，dd，J＝1.9，8.2 Hz，H?6），3.60（2H，d，J＝6.2 Hz，H?1′），4.17（2H，d，J＝4.7 Hz，H?3′），3.88（1H，t，J＝4.7，6.2 Hz，H?2′）；13C?NMR（150 MHz，DMSO?d6）δ：125.5（C?1），111.1（C?2），149.4（C?3），147.9（C?4），115.4（C?5），123.0（C?6），144.9（C?β），114.4（C?α），166.6（C ＝O），62.7（C?1′），65.5（C?2′），69.3（C?3′）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［20］ 報(bào)道基本一致，故鑒定為1?O?feruloylg?lycerol。

化合物15：白色粉末。ESI?MSm／z：123.2［M ＋H］＋。1H?NMR（600 MHz，DMSO?d6）δ：9.82（1H，s，H?1），7.79（2H，d，J＝8.5 Hz，H?3，3′），6.97（2H，d，J＝8.5 Hz，H?5，5′）；13C?NMR（150 MHz，DMSO?d6）δ：190.5（C?1），163.1（C?2），132.1（C?3，3′），128.5（C?4），115.8（C?5，5′）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［21］ 報(bào)道基本一致，故鑒定為4?羥基苯甲醛。

化合物16：無(wú)色油狀液體。ESI?MSm／z：287.1 ［M?H］－。1H?NMR（600 MHz，CDCl3）δ：7.70（1H，dd，J＝5.5，3.0 Hz），7.59（1H，dd，J＝5.5，3.0 Hz），4.30（4H，m），1.51（4H，m），1.80（4H，m），0.93（3H，m），0.93（3H，m）；13C?NMR（150 MHz，CDCl3）δ：168.8（C?7），134.0（C?1，6），130.1（C?2，5），131.9（C?3，4），67.1（C?1′，1″），32.2（C?2′，2″），18.9（C?3′，3″），14.0（C?4′，4″）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［22］ 報(bào)道基本一致，故鑒定為dibutyl?phthalate。

4 TGF?β1 抑制活性研究

4.1 藥品制備 準(zhǔn)確稱量所得化合物和陽(yáng)性對(duì)照藥物比菲尼酮各4.0 mg，用DMSO 溶解制備成質(zhì)量濃度為40 mg／mL 的母液備用，用不含有血清的培養(yǎng)基制成系列質(zhì)量濃度的藥液，用于TGF?β1 抑制活性篩選實(shí)驗(yàn)。

4.2 細(xì)胞培養(yǎng) RAW264.7 細(xì)胞在含有10%血清的培養(yǎng)基及5% CO2、37 ℃、飽和濕度的標(biāo)準(zhǔn)條件下進(jìn)行培養(yǎng)，待細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)達(dá)到培養(yǎng)瓶底約80%時(shí)進(jìn)行傳代，3 代后的RAW264.7 細(xì)胞用于TGF?β1 抑制活性檢測(cè)。

4.3 活性檢測(cè) 將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的貼壁細(xì)胞進(jìn)行胰酶消化、重懸和計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度至1×105／mL，分別加至96 孔板的孔內(nèi)，每孔0.1 mL，在標(biāo)準(zhǔn)條件下培養(yǎng)一定時(shí)間至細(xì)胞完全貼壁后進(jìn)行饑餓處理，12 h 后棄去每個(gè)孔內(nèi)的上清液，按照不同的分組情況（空白對(duì)照組、模型組、陽(yáng)性藥組和不同濃度給藥組）分別加入總體積為0.1 mL相應(yīng)的藥液，各組給藥濃度設(shè)置為空白對(duì)照組只加等體積的無(wú)血清培養(yǎng)基，模型組無(wú)血清培養(yǎng)基配制的1 μg／mL LPS，陽(yáng)性藥組1 μg／mL LPS＋質(zhì)量濃度分別為0.5、1、3、5、7、9、11 μg／mL 的比菲尼酮，不同濃度給藥組1 μg／mL LPS＋質(zhì)量濃度分別為1、5、10、15、25、40、55 μg／mL 的化合物1～16，每組重復(fù)3 次，置于標(biāo)準(zhǔn)條件下培養(yǎng)12 h，吸取培養(yǎng)上清液用ELISA 方法檢測(cè)化合物對(duì)TGF?β1 的抑制作用，并計(jì)算出各化合物的半數(shù)抑制濃度（IC50）值。

4.4 檢測(cè)結(jié)果 圖1 顯示，化合物1～16 均對(duì)TGF?β1 呈現(xiàn)一定的抑制作用，陽(yáng)性藥比菲尼酮對(duì)TGF?β1 的IC50為3.68 μg／mL；1、3～4、6、11、13 對(duì)TGF?β1 呈現(xiàn)較強(qiáng)的抑制作用效果，IC50值分別 為 4.95、5.79、7.76、11.55、18.89、15.65 μg／mL，但均弱于陽(yáng)性藥；8～10、12、14 對(duì)TGF?β1 的IC50值分別為30、20.32、25.55、33.21、42.22 μg／mL，不及1、3～4、6、11、13，但明顯強(qiáng)于2、5、7、15～16（IC50值分別為40、50、50、89.88、97.77 μg／mL）；15～16 對(duì)TGF?β1 幾乎無(wú)抑制作用。

圖1 各化合物對(duì)TGF?β1 抑制作用的IC50值（，n＝3）Fig.1 IC50 values of various compounds on TGF?β1（，n＝3）

5 討論

特發(fā)性肺纖維化是一種嚴(yán)重危害人類生命的間質(zhì)性肺病，特發(fā)性肺纖維化患者體內(nèi)TGF?β1 表達(dá)量明顯升高，有研究表明抑制TGF?β1 可有效緩解肺纖維化病人的纖維化進(jìn)程［1］。藏藥是我國(guó)傳統(tǒng)中醫(yī)藥的重要組成部分，植物來(lái)源的藏藥因其獨(dú)特的生長(zhǎng)環(huán)境（高海拔、強(qiáng)輻射、晝夜溫差大等）使其次級(jí)代謝產(chǎn)物具有獨(dú)特的治療效果。本研究結(jié)果表明，團(tuán)狀雪靈芝中具有抑制TGF?β1 的強(qiáng)活性成分，主要以咔啉生物堿和黃酮類為主（化合物1、3～4、6、11、13），研究表明黃酮類化合物及咔啉生物堿具有明顯抑制肺纖維化的藥理活性［23?24］。本研究結(jié)果表明咔啉生物堿和黃酮類可能是團(tuán)狀雪靈芝臨床治療間質(zhì)性肺病的主要藥效成分，以期為其進(jìn)一步深入研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，為篩選TGF?β1 抑制劑提供實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。