趙 彤邵 瑾楊 穎賈正平馬慧萍*景臨林*

（1.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)，甘肅 蘭州730000； 2.聯(lián)勤保障部隊第九四〇醫(yī)院藥劑科，甘肅 蘭州730050；3.蘭州大學(xué)藥學(xué)院，甘肅 蘭州730000）

生物體內(nèi)存在氧化與抗氧化平衡系統(tǒng)，當(dāng)該系統(tǒng)失衡就會產(chǎn)生活性氧，過量的活性氧可能攻擊細(xì)胞蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、核酸，導(dǎo)致細(xì)胞功能障礙，還能引發(fā)氧化應(yīng)激反應(yīng)，誘導(dǎo)細(xì)胞損傷、阻礙細(xì)胞增殖、抑制細(xì)胞活力［1?2］。研究發(fā)現(xiàn)急性高山病、神經(jīng)退行性疾病、癌癥、心血管疾病及炎癥等均與氧化應(yīng)激損傷密切相關(guān)［3?6］。相關(guān)報道指出，抗氧化劑可有效清除體內(nèi)自由基，消除過量的活性氧，從而達(dá)到預(yù)防和治療相關(guān)疾病的目的［7］。

藏紫菀是菊科紫菀屬植物緣毛紫菀Aster soulieiFranch.的干燥花序，是青藏高原的特有物種，生長在海拔3 000～4 500 m 的高原濕地。作為一種傳統(tǒng)藏藥，其具有止咳、祛痰、散熱、解毒的功效［8］。迄今為止，已有文獻(xiàn)報道藏紫菀的主要化學(xué)成分包括黃酮和多酚類，如山柰酚、槲皮素等［9?10］。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)藏紫菀的醇提取物具有較好的抗氧化活性［11］，本研究將在前期研究的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步考察藏紫菀不同極性提取部位的抗氧化活性，以及抗氧化活性與總多酚和總黃酮含量的關(guān)系，以期達(dá)到初步富集和明確抗氧化活性成分的目的，為進(jìn)一步分離藏紫菀中的活性成分奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 樣品 藏紫菀購于西寧三江寶商務(wù)有限公司（青海西寧），經(jīng)蘭州大學(xué)藥學(xué)院楊永健教授鑒定為正品。保藏號為2014?002 的憑證樣本存放在生藥部的植物標(biāo)本館。

1.2 試劑與藥物 1，1?二苯基?2?三硝基苯肼（DPPH，批號D9312）、2，2′?聯(lián)氮基雙（3?乙基苯并噻唑啉?6?磺酸）二銨鹽（ABTS，批號1001393091）、硝基藍(lán)四唑（NBT，批號N6876，日本Sigma 公司）；蘆?。ㄅ朇HB170303）、沒食子酸（批號CHB171107）對照品均購于成都克洛瑪生物科技有限公司；還原型輔酶Ⅰ?二鈉（β?NADH，批號N106933）、硫代巴比妥酸（TBA，批號T108505）、2，4，6?三吡啶基三嗪（TPTZ，批號T106623）、硝普鈉（批號S110755）、萘乙二胺（批號201307251）、對氨基苯磺酰胺（批號S108476）、吩嗪硫酸甲酯（PMS，批號48805）均購于阿拉丁控股集團有限公司；三氯乙酸（TCA，批號149771，成都博瑞特化學(xué)技術(shù)有限公司）；抗壞血酸（批號2016070201，成都市科龍化工試劑廠）；磷酸二氫鈉（批號20111005，萊陽市雙雙化工有限公司）；磷酸氫二鈉（批號20160812，天津市光復(fù)科技發(fā)展有限公司）；鹽酸（批號20090818，天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司）。

1.3 萃取和極性分段 稱取干燥的藏紫菀200 g，70%乙醇在室溫條件下攪拌6 h，料液比為1 ∶10，重復(fù)3 次，合并提取物，濾過，濃縮，得到粗提物（70%乙醇粗提物）。將部分粗提物懸浮在水中，依次用正己烷、乙酸乙酯、正丁醇萃取，各萃取3 次，然后將不同溶劑的萃取物過濾、濃縮，得到正己烷部位（非極性部位）、乙酸乙酯部位（中等極性部位）、正丁醇部位（極性部位）、水提部位（高極性部位）。

1.4 總黃酮和總多酚含量測定 取500 μL 不同濃度提取液于離心管中，加入50 μL 5% NaNO2溶液，混勻，反應(yīng)5 min后，加入50 μL 10%AlCl3溶液，靜置5 min 后，加入250 μL 4%NaOH 溶液，搖勻，在510 nm 波長處測定吸光度，各濃度平行3 次。在同樣條件下使用不同濃度蘆丁的對照品溶液制備標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算藏紫菀不同極性部位總黃酮含量，將其表示為每1 g 提取物的蘆丁當(dāng)量（mg RU／g提取物）。

使用改良的Folin?Ciocalteu 方法測定總多酚含量，稍作修改進(jìn)行測定［12］。在100 μL不同濃度提取液中加 入1.0 mL Folin?Ciocalteu 試劑，5 min 后，加入1.0 mL 7.5%NaHCO3溶液，室溫下避光放置90 min，在725 nm 波長處測定吸光度，平行3 次。在同樣條件下使用不同濃度沒食子酸的對照品溶液制備標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算藏紫菀不同提取部位總多酚含量，將其表示為每1 g 提取物的沒食子酸當(dāng)量（mg GAE／g 提取物）。

1.5 抗氧化活性測定

1.5.1 DPPH 自由基清除試驗 DPPH 測定基于根據(jù)文獻(xiàn)［13］ 的方法，稍作修改。將150 μL 不同濃度提取液加入到150 μL DPPH（0.1 mmol／L）自由基甲醇溶液中。劇烈振搖，在室溫下避光孵育30 min，用抗壞血酸（VC）作為陽性對照，使用酶標(biāo)儀在517 nm 波長處測定吸光度，平行3 次。使用公式［1－（A1－A2）／A0］ ×100%計算DPPH 自由基的清除率，式中A0是不加待測液的吸光度值，A1是待測液吸光度值，A2是不加自由基的吸光度值。抗氧化活性表示為EC50（μg／mL），即在517 nm 波長處引起吸光度降低50%所需的樣品劑量，較低的EC50值對應(yīng)較強的抗氧化活性。

1.5.2 ABTS 自由基清除試驗 ABTS 自由基清除能力根據(jù)文獻(xiàn)［14］ 描述的方法進(jìn)行測定。將等體積的ABTS 溶液（7 mmol／L）和過硫酸鉀溶液（2.45 mmol／L）均勻混合，在室溫條件下避光放置16 h，得到深色溶液，即為ABTS＋·貯備液。將100 μL 不同濃度的提取物與3.9 mL ABTS＋·工作溶液混合，室溫下避光溫育10 min 后測定自由基清除活性，以VC作為陽性對照，測量所得溶液在734 nm 波長處的吸光度值（A1）。再用100 μL 蒸餾水代替不同濃度的提取液測定吸光度值（A0），用蒸餾水代替ABTS＋·工作溶液測定吸光度值（A2），計算提取物的ABTS＋·的清除率，并計算EC50。

1.5.3 羥基自由基清除試驗 根據(jù)文獻(xiàn)［15］ 的方法測定提取物的羥自由基清除活性，略有改變。在500 μL 不同濃度提取液中，依次加入100 μL 脫氧核糖［28 mmol／L，溶于pH 7.4 的50 mmol／L 磷酸鹽 緩沖液（PBS）］，100 μL EDTA（1 mmol／L）、100 μL FeCl3（1 mmol／L）、100 μL H2O2（1 mmol／L）、500 μL H2O，最后加入100 μL Vc 引發(fā)反應(yīng)。在37 ℃下水浴中孵育1 h 后，加入500 μL的10% TCA 終止反應(yīng)，再加入500 μL 0.5% TBA（溶于50 mmol／L NaOH 水溶液中），在沸水浴中加熱30 min 后，冷卻至室溫，以Vc 作為陽性對照，記錄532 nm 波長處的吸光度（A1）。再用500 μL 蒸餾水代替不同濃度的提取液測定吸光度（A0），用PBS 代替脫氧核糖測得吸光度值（A2），計算提取物的羥基自由基清除率、EC50。

1.5.4 超氧陰離子自由基清除試驗 根據(jù)文獻(xiàn)［16］ 的方法稍微修改，測定提取物的超氧陰離子清除活性。將100 μL不同濃度的提取液、50 μL NADH 溶液（0.5 mmol／L，溶于0.1 mol／L Tris?HCl，pH 8.0）和50 μL NBT（0.2 mmol／L）混合均勻，然后加入50 μL PMS 水溶液（25 μmol／L）。將反應(yīng)混合物在室溫下孵育15 min，以Vc 為陽性對照。在570 nm 波長處測定吸光度（A1），用100 μL 蒸餾水代替提取物溶液測定吸光度（A0），用蒸餾水代替脫氧核糖測定吸光度（A2）。反應(yīng)混合物的吸光度降低表明超氧陰離子清除活性增加，計算清除率及EC50。

1.5.5 一氧化氮自由基清除試驗 根據(jù)根據(jù)文獻(xiàn)［17］的方法略微修改進(jìn)行測定。將50 μL 各種濃度的提取物加入的50 μL 硝普鈉（10 mmol／L，溶解在PBS 中，pH 7.4）中，在室溫光照下孵育150 min 后，加入50 μL 0.33%對氨基苯磺酰胺（溶解于20%冰醋酸中），10 min 后加入50 μL 0.1%萘乙二胺鹽酸鹽，將所得溶液靜置30 min，Vc 作為陽性對照，用酶標(biāo)儀在540 nm 波長處測量吸光度值（A1），用50 μL 蒸餾水代替提取物溶液測得吸光度值（A2），用蒸餾水代替萘乙二胺溶液測得吸光度（A0），計算NO 自由基清除率及EC50。

1.5.6 鐵還原／抗氧化能力（FRAP）測定 根據(jù)根據(jù)文獻(xiàn)［18］ 的方法計算提取物的還原／抗氧化能力（FRAP）。將25 mL 乙酸鹽 緩沖液（0.3 mmol／L，pH 3.6）、2.5 mL TPTZ 溶液（10 mmol／L，溶于40 mmol／L HCl）和2.5 mL FeCl3·6H2O（20 mmol／L）中均勻混合制備新鮮FRAP?試劑，使用前加熱至37 ℃。將30 μL 不同濃度的提取液加到900 μL FRAP 試劑中，水浴加熱30 min，冷卻至室溫后，在595 nm 波長處測定吸光度。用FeSO4對照品溶液制備標(biāo)準(zhǔn)曲線，提取物的鐵還原能力表示為mmol FeSO4／g 提取物。

2 結(jié)果

2.1 樣品含量分析 本實驗先用70%乙醇提取藏紫菀，得到藏紫菀70%乙醇粗提物33.97 g，然后用正己烷、乙酸乙酯、正丁醇依次萃取，分別得到正己烷部位（2.85 g）、乙酸乙酯部位（5.46 g）、正丁醇部位（6.00 g）、水提部位（14.56 g）。以上結(jié)果表明，極性化合物是藏紫菀的主要成分，非極性組分的含量非常少，見表1。（51.02±2.39）μg／mL，而正己烷部位和水提部位表現(xiàn)出較弱的清除效果。

表1 不同提取物中總多酚、總黃酮含量測定結(jié)果（）

表1 不同提取物中總多酚、總黃酮含量測定結(jié)果（）

注：同一列中不同上標(biāo)表示平均值有統(tǒng)計學(xué)差異。

表1 顯示，正己烷部位中總黃酮和總多酚的含量較低，其原因可能與糖基化酚類化合物在正己烷中的溶解度較小有關(guān)。酚類、黃酮類成分大多屬于中等極性。Kumkrai等［19］也發(fā)現(xiàn)，石竹的乙酸乙酯部分具有最高的總黃酮含量，而水和石油醚部分具有最低總多酚含量。

2.2 清除DPPH 自由基作用 DPPH 是一種穩(wěn)定的自由基，可以從抗氧化劑中接受電子或氫自由基，形成其非自由基形式DPPH?H，使DPPH 溶液的顏色從紫色變?yōu)辄S色，在517 nm 波長處的吸光度降低［20］?？寡趸瘎┑腄PPH 清除活性反映了其對氫的貢獻(xiàn)能力，EC50值越低，DPPH 自由基清除活性越好。圖1 顯示了不同濃度提取物表現(xiàn)出對DPPH 自由基呈劑量依賴性抑制，表2 顯示了藏紫菀粗提取物及不同提取部位對不同自由基的EC50值，其中70%乙醇粗提物的DPPH 自由基EC50為（58.00±2.17）μg／mL，與其相比，乙酸乙酯、正丁醇部位對DPPH 清除效果更好，EC50分別為（35.15±2.46）、（35.94±2.26）μg／mL，而正己烷部位和水提部位對DPPH 清除能力較弱。

圖1 藏紫菀不同極性提取物的DPPH 自由基清除活性

2.3 清除ABTS＋·作用 在ABTS＋·測定中，不同提取部位之間的EC50值顯著不同，范圍為（49.83±2.66）～（156.89±1.64）μg／mL，見圖2、表2。與DPPH 自由基清除試驗結(jié)果相似，乙酸乙酯、正丁醇部位仍然表現(xiàn)出強于70%乙醇粗提物的清除效果，EC50為（49.83±2.66）、

圖2 藏紫菀不同極性提取物的ABTS 自由基清除活性

表2 粗提物和不同極性提取物對不同自由基清除活性的影響（）

表2 粗提物和不同極性提取物對不同自由基清除活性的影響（）

注：同一列中不同上標(biāo)表示平均值有統(tǒng)計學(xué)差異。

2.4 清除·OH 作用 羥基自由基（·OH）被認(rèn)為是活性氧化物中反應(yīng)性最強的自由基，可以非特異性地破壞活細(xì)胞中幾乎所有類別的生物大分子［21］。圖3、表2 顯示，除正己烷部位外其他提取部位都顯示出·OH 清除活性，EC50范圍為（80.20±0.46）～（299.53±6.84）μg／mL，但均弱于Vc 清除效果。乙酸乙酯、正丁醇部位有較強的清除效果，EC50分別為（80.20±0.46）、（103.13±4.53）μg／mL，均強于70%乙醇粗提物清除效果。由此推測，·OH 的清除可能是由于提取物中存在供氫能力的酚類化合物。

圖3 藏紫菀不同極性提取物的羥基自由基清除活性

圖4 藏紫菀不同極性提取物的超氧自由基清除活性

2.6 清除NO 自由基作用 機體產(chǎn)生的NO 是一種必不可少的生物調(diào)節(jié)分子，具有許多生理功能，如調(diào)節(jié)血壓、傳遞神經(jīng)信號、控制血管擴張、松弛平滑肌和影響免疫反應(yīng)［23］。另一方面，過量濃度的NO 可與反應(yīng)，形成氧化活性更強的分子——過氧亞硝酸鹽（ONOO－），通過攻擊脂質(zhì)，蛋白質(zhì)和DNA 產(chǎn)生細(xì)胞毒素［24］。圖5、表2 顯示，NO 清除活性與劑量有明顯的量效關(guān)系。其中70% 乙醇粗提物清除活性低于正丁醇和乙酸乙酯部位，正丁醇部位對NO 具有最高的清除活性，EC50值為（61.52±1.27）μg／mL，乙酸乙酯部位也表現(xiàn)出比Vc 和其他提取部位更高的自由基清除活性。正己烷部位對NO 清除能力最弱。

圖5 藏紫菀不同極性提取物的NO 自由基清除活性

2.7 對鐵還原抗氧化能力（FRAP）測定 抗氧化劑可以將鐵三嘧啶三嗪（Fe3＋?TPTZ）復(fù)合物還原為有色亞鐵三吡啶三嗪（Fe2＋?TPTZ）絡(luò)合物，最大吸收波長為593 nm［18］，吸光度越大，表明鐵的總還原能力越強。表3 顯示，正丁醇部位對Fe3＋還原能力最強，乙酸乙酯部位還原能力也強于70%乙醇粗提物，正己烷部位、水提部位顯示出較低的還原能力。

表3 藏紫菀粗提物和不同極性提取物的FRAP 測定（）

表3 藏紫菀粗提物和不同極性提取物的FRAP 測定（）

注：C 為用于測定FRAP 活性的濃度，同一列中不同上標(biāo)表示平均值有統(tǒng)計學(xué)差異。

2.8 抗氧化活性和化學(xué)成分的相關(guān)性 多酚和黃酮是與植物提取物抗氧化活性相關(guān)的主要生物活性成分［25］。對藏紫菀中總多酚和總黃酮含量與DPPH、ABTS、·、·OH 和NO 自由基清除活性及還原能力進(jìn)行相關(guān)性分析，見表4，可知抗氧化活性與二者含量表現(xiàn)出良好的相關(guān)性，進(jìn)一步表明總黃酮和總多酚是藏紫菀提取物抗氧化活性的成分基礎(chǔ)。

表4 抗氧化活性與藏紫菀提取物中總酚類、總黃酮類成分的相關(guān)性

3 討論

抗氧化劑可以通過清除自由基，破壞鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，結(jié)合金屬離子并作為氧清除劑來干擾氧化應(yīng)激過程，雖然在市場上可購買到數(shù)種有效的合成抗氧化劑，但合成氧化劑具有潛在的毒理作用［26］。傳統(tǒng)藏藥是治療多種炎癥和氧化應(yīng)激疾病的首選藥，高海拔地區(qū)生長的植物總是處于氧化應(yīng)激狀態(tài)，可以推測這些植物中必然存在某些特征的化學(xué)成分，使其生長不會受到干預(yù)。Gharibi 等［27］發(fā)現(xiàn)從較高海拔采集的植物比從低海拔栽培的植物具有更高的酚類含量和抗氧化活性。較低的溫度以及紫外線輻射的增加可導(dǎo)致某些抗氧化劑的生物合成速率增加［28］。

本實驗采用6 種不同的抗氧化活性研究方法，對藏紫菀粗提物及不同極性提取部位抗氧化活性進(jìn)行研究，并將其與總多酚和總黃酮含量進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，藏紫菀的不同提取部位均具有抗氧化活性。黃酮類和酚類成分是多數(shù)天然產(chǎn)物中發(fā)揮抗氧化活性的基礎(chǔ)，藏紫菀抗氧化活性與其所含的總黃酮和總多酚密切相關(guān)，而該兩類化合物大多具有酚羥基，顯示中等極性，可以與自由基發(fā)生結(jié)合，體現(xiàn)出較強的抗氧化活性，可以推測乙酸乙酯部位、正丁醇部位中抗氧化的成分基礎(chǔ)很可能是黃酮類和酚類。因此，藏紫菀可作為一類潛在的天然抗氧化備用藥材，具有極大的開發(fā)價值，但其具體抗氧化活性成分及作用機理仍需進(jìn)一步研究。