徐陽鑫，高 雪，孫敏君，劉秀英，勵建榮

（渤海大學食品科學與工程學院，遼寧省食品安全重點實驗室，生鮮農(nóng)產(chǎn)品貯藏加工及安全控制技術國家地方聯(lián)合工程研究中心，遼寧錦州 121013）

石墨烯量子點（Quantum Dots，GQDs）是一種準零維納米材料[1?2]，相比于傳統(tǒng)的半導體量子點，GQDs毒性更低、抗光漂白性更強[3?4]，因此在光電領域、食品檢測、生物醫(yī)藥等方面應用廣泛[5?9]。

革蘭氏陰性菌是臨床常見的致病菌[10]，因其細胞壁脂類含量、結構復雜高而具有較強的耐藥性，可產(chǎn)生內(nèi)毒素，危害人體健康。大腸桿菌作為食源性致病菌，是其中的一種，無芽孢，周生鞭毛，可運動[11?12]。食用含大腸桿菌超標的食物后，輕者會出現(xiàn)腹瀉等腸道疾病，重者會造成腸道出血甚至引發(fā)死亡，因此，其含量與人體健康密切相關。大腸桿菌的檢測方法很多，如平板計數(shù)法、PCR技術等[13]，但普遍存在弊端—操作繁雜、對專業(yè)技能要求高、檢測前需擴增或富集，往往費力費時等[14?17]。GQDs具有寬的吸收光譜，并且其發(fā)射具有窄的帶寬依賴的局部最大值[18?20]。不同粒徑的GQDs可被單個波長同時激發(fā)，此外，GQDs的熒光發(fā)射波長可隨粒徑的不同而改變[21?23]。

粘菌素是一種環(huán)狀多肽抗生素，不僅對多重耐藥革蘭氏陰性菌具有顯著活性[24?25]，還具有有效的抗內(nèi)毒素活性[26?27]。革蘭氏陰性菌外膜能夠作為細胞的滲透屏障，控制物質(zhì)的進出[28?29]，粘菌素能夠與其外膜中的脂多糖分子相互作用，引起細胞膜的紊亂，最終導致細胞死亡[30?32]。

本研究合成了氨基修飾的Fe3O4，將其與含羧基的GQDs結合，并用粘菌素修飾形成Colis-Fe3O4-GQDs復合物[33?34]。存在不同濃度的Colis-Fe3O4-GQDs時，會存在猝滅現(xiàn)象，隨著濃度變大，猝滅效果越明顯；本實驗基與此，建立了一種熒光探針檢測大腸桿菌的實驗方法，以期為致病菌快速檢測提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

N-羥基琥珀酰亞胺（NHS），1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽（EDC） 北京索萊寶科技有限公司；四水二氯化鐵 上海倍卓生物科技有限公司；六水三氯化鐵 北京百靈威科技有限公司；氨水 泰興市益民化工有限公司；3-氨丙基三甲氧基硅烷（APTES）、粘菌素 阿拉丁；營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基 深圳子科生物科技有限公司；大腸桿菌、鏈球菌、葡萄球菌、白喉桿菌、肺炎雙球菌、破傷風桿菌 均采集于錦州市科技路農(nóng)貿(mào)市場，并于實驗室分離。

PHS-3C pH計 上海BSNTE有限公司；S2020-M60-B-230 搖床 深圳CY-TECH有限公司；CMAG HS 7 磁力攪拌器 德國IKA公司；高壓蒸汽滅菌器 河南省三強醫(yī)療器械有限責任公司；F-7000熒光分光光度計 日本HITACHI公司；IR Tracer-100 傅里葉紅外光譜儀 日本SHIMADZU公司；SK6210HP 超聲波清洗器 上海優(yōu)浦科學儀器有限公司；VSM-100 振動樣品磁強計 長春英普有限公司；SU8020 場致發(fā)射掃描式電子顯微鏡 日本日立有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 四氧化三鐵（Fe3O4）的制備 將0.86 g氯化亞鐵和2.36 g氯化鐵（FeCl3·6H2O）溶解于40 mL蒸餾水中，80 ℃的溫度下快速攪拌10 min。用25%的氨水調(diào)節(jié)至pH為9，繼續(xù)快速攪拌1 h，然后將溶液冷卻至室溫，最后加入去離子水，磁吸分離3次，干燥備用[35]。

1.2.2 氨基修飾的Fe3O4納米顆粒（NH2-Fe3O4）的制備 用乙醇和水將制備好的四氧化三鐵（Fe3O4）稀釋到50 mL，使分散效果更好，進一步超聲30 min，加800 μL APTES到混合溶液中，室溫下攪拌8 h，加入無水乙醇磁吸分離兩次，最后用去離子水磁吸分離一次，除去溶液中的雜質(zhì)[36]。

1.2.3 Fe3O4-GQDs復合物的構建 將制備好的NH2-Fe3O4固體添加2 mL蒸餾水超聲，混勻之后檢查磁性，放置待用。取1 mL GQDs分別加入0.002 g EDC和0.001 g NHS，振蕩30 min，觀察是否有沉淀生成，再加入NH2-Fe3O4振蕩，4 h后，將2 mL水加入到混合液中，磁吸洗滌分離2～3次，最后檢測其磁性[37]。

1.2.4 粘菌素與Fe3O4-GQDs的連接 用0.002 g EDC和0.001 g NHS活化500 μL預先制備的Fe3O4-GQDs復合物。室溫下培養(yǎng)30 min后，將200 μL粘菌素溶液（10?4mol/L）加入到配置好的混合溶液中。在室溫下反應2 h，用去離子水進行磁吸分離，Colis-Fe3O4-GQDs復合物通過連續(xù)磁吸分離3次，除去未反應的物質(zhì)。最后，將Colis-Fe3O4-GQDs 復合物分散在2 mL PBS（pH=7.4）溶液中。濃縮的溶液需穩(wěn)定一周后可以使用。

1.2.5 場致發(fā)射掃描電子顯微鏡（SEM） 將凍干的NH2-Fe3O4納米粒子置于導電膠樣品臺上，噴金，通過SEM顯微鏡在電流10 mA、電壓5 kV、工作距離5 mm的工作條件下對待測樣品進行掃描[38]。

1.2.6 紅外吸收光譜分析 打開紅外軟件的測定頁面，初始化儀器。將制備的溴化鉀壓片作為空白對照放入樣品倉，點擊背景按鈕采集光譜，再將Fe3O4納米粒子和NH2-Fe3O4納米粒子放入樣品倉分別進行測定[39]。

1.2.7 磁力回線表征 采用磁強計測定復合物納米粒子的磁滯回線，先打開循環(huán)水，啟動電腦中的測定軟件，預熱2 h，校準后于室溫下測試樣品磁性能，設置測試范圍為?20000～20000 eV，將樣品放入樣品杯，開始測量[40]。

1.2.8 革蘭氏陰性菌的檢測 將大腸桿菌在液體培養(yǎng)基中37 ℃恒溫培養(yǎng)12 h，用平板計數(shù)法檢測菌株濃度。將200 μL預先制備的Colis-Fe3O4-GQDs溶液加入到2 mL PBS（pH=7.4）中稀釋10倍，在UV燈下活化1 h。將活化后的Colis-Fe3O4-GQDs濃縮溶液，按梯度依次稀釋，然后取1×102～10×102CFU/mL濃度的溶液檢測。將處理好的樣品在400 nm的激發(fā)波長下進行檢測。

1.2.9 選擇性實驗 為了充分研究Colis-Fe3O4-GQDs對革蘭氏陰性菌的選擇性，選取了鏈球菌、葡萄球菌、白喉桿菌、肺炎雙球菌、破傷風桿菌在同濃度下進行選擇性實驗。選擇性實驗采用熒光猝滅程度F/F0作為縱坐標、不同菌種的名稱作為橫坐標對熒光猝滅數(shù)據(jù)進行處理，其中，F(xiàn)0和F的分別為單純Colis-Fe3O4-GQDs 復合物及加入同濃度的不同菌種后的熒光強度。

1.2.10 檢測機制探究 用掃描電鏡分別表征被Colis-Fe3O4-GQDs 復合物孵育前后的大腸桿菌，通過對比孵育前后的大腸桿菌表面形貌差異，主要觀察其外觀是否發(fā)生形變，探究大腸桿菌與結合物之間的作用機制。選取 2 份 6×102CFU/mL 濃度的大腸桿菌，其中一份加入 Fe3O4-GQDs 結合物，另一份加入同體積的緩沖溶液，充分反應后，將混合溶液離心，去除上清液，用 2.5% 的戊二醛固定 180 min，再用乙醇進行梯度脫水。將混合物凍干后置于導電膠樣品臺上，噴金，通過掃描電子顯微鏡在電流 10 mA、電壓5 kV 工作距離、5 mm 的工作條件下對待測樣品進行掃描[38,41]。

1.3 數(shù)據(jù)處理

2 結果與分析

2.1 NH2-Fe3O4的表征

2.1.1 掃描電鏡表征 掃描電鏡圖（圖1）表明，合成的NH2-Fe3O4分布均勻整齊，大小均一，但有一定的聚集，所以每次使用前都需要進一步做超聲均質(zhì)處理，此結果與文獻報道的結果一致[42]。

圖1 NH2-Fe3O4掃描電鏡圖Fig.1 Scanning electron micrograph of NH2-Fe3O4

2.1.2 紅外表征 如圖2，F(xiàn)e3O4粒子在580 cm?1處的強吸收峰對應Fe-O特征伸縮吸收峰，此峰峰形完整，1630和3440 cm?1處的峰分別對應-OH的彎曲振動和伸縮振動特征峰，表明Fe3O4磁納米粒子的成功合成。3-氨丙基三甲氧基硅烷作為一種硅烷偶聯(lián)劑，具有雙官能團，既具有能與其他有機分子反應的官能團（如-COOH、-NH2、-SH），又包括能與無機納米顆粒反應的Si-OH官能團。NH2-Fe3O4納米粒子的Fe-O-Si特征吸收峰由于和580 cm?1處的Fe-O特征峰相重疊，所以并不能直接在紅外圖中得出，但可以間接通過3-氨丙基三甲氧基硅烷的特征吸收峰來判斷粘菌素是否成功偶聯(lián)到了納米粒子表面。N-H鍵在3420 cm?1處的伸縮振動峰與-OH的伸縮振動吸收峰重疊，1100 cm?1是Si-O-Si的伸縮振動吸收峰，890 cm?1對應于-NH2的彎曲振動吸收峰，1700 cm?1左右的吸收峰是由-NH2的基團變形引起的，說明粘菌素成功偶聯(lián)到了納米粒子表面[42?43]。

圖2 NH2-Fe3O4和Fe3O4的紅外光譜圖Fig.2 Infrared spectra of NH2-Fe3O4 and Fe3O4

2.1.3 磁力回線表征 如圖3所示，F(xiàn)e3O4的磁化曲線和退磁曲線相互重合，呈對稱的“S”型，當磁場強度為0時，磁化強度也為0，說明樣品在磁場中可以被磁化，當磁場被去除后，樣品不再具有磁性，即合成的Fe3O4納米粒子具有超順磁性[38]。NH2-Fe3O4顆粒的飽和磁化強度相較于未經(jīng)修飾的 Fe3O4粒子略有下降，其原因可能是Fe3O4粒子經(jīng)氨基修飾后，表面原子與修飾分子的電子交換作用抑制了磁矩，進而引起磁化強度的降低[44]。Fe3O4經(jīng)氨基修飾后的飽和磁化強度相對較高，表明其磁性較強。

圖3 NH2-Fe3O4和Fe3O4的磁力回線圖Fig.3 Magnetic loop diagram of NH2-Fe3O4 and Fe3O4

2.2 Fe3O4-GQDs納米復合物磁性能研究

圖4所示，F(xiàn)e3O4-GQDs納米復合物分散液在不同條件下的實物照片。從圖中可以看出，合成的納米復合物在去離子水中具有顯著的分散性。當沒有外加磁場時，納米復合物可以均勻的分散在去離子水中，具有良好的分散性。當加入一個外磁場時，納米復合物迅速的移向外加磁場的那一側，表明納米復合物磁性良好。

圖4 Fe3O4-GQDs納米復合物分散液在日光照射下無磁場吸附（a），日光照射下有磁場吸附（b）Fig.4 Fe3O4-GQDs nanocomposite dispersion without magnetic field adsorption under sunlight (a) and magnetic field under sunlight (b)

2.3 Fe3O4-GQDs與革蘭氏陰性細菌的熒光猝滅反應

圖5所示，本實驗利用熒光光譜研究了Fe3O4-GQDs與革蘭氏陰性細菌結合的能力。當實驗中存在不同濃度的大腸桿菌時，F(xiàn)e3O4-GQDs的熒光猝滅程度隨細菌濃度的增大而變強，說明其猝滅程度對濃度具有依賴性。當大腸桿菌的濃度介于1×102～10×102CFU/mL時，線性關系良好，其回歸方程為y=0.0184x+13.343，R2=0.999，檢出限為0.36×102CFU/mL。Colis-Fe3O4-GQDs復合物表面上的粘菌素具有識別細菌的能力，并能夠有效結合革蘭氏陰性菌。粘菌素的脂肪酸側鏈可與革蘭氏陰性細菌表面上的脂質(zhì)A相互作用，破壞大腸桿菌的結構，導致猝滅現(xiàn)象。

圖5 不同濃度大腸桿菌的Colis-Fe3O4-GQDs復合物的熒光發(fā)射光譜Fig.5 Fluorescence emission spectra of Colis-Fe3O4-GQDs conjugates with different concentrations of Escherichia coli

2.4 選擇性對反應體系的影響

為了證明該實驗的準確性，F(xiàn)e3O4-GQDs對其他陽性菌進行了干擾檢測。圖6所示，在相同的檢測條件下，在反應體系中加入同濃度的Fe3O4-GQDs復合物。其中，鏈球菌、葡萄球菌、白喉桿菌、肺炎雙球菌、破傷風桿菌對Fe3O4-GQDs復合物的猝滅效率均在5%以內(nèi)，對大腸桿菌的檢測幾乎沒有影響。因為粘菌素修飾的Fe3O4-GQDs與革蘭氏陰性細菌表面上的脂質(zhì)A相互作用，其他陽性菌不能被識別。此外，在其它革蘭氏陰性菌的干擾實驗中，相同檢測條件下，布氏桿菌、肺炎桿菌、變形桿菌對Fe3O4-GQDs復合物的猝滅效率遠低于大腸桿菌。將以上三種革蘭氏陰性菌與大腸桿菌混合進行檢測，檢測結果表明，干擾菌的存在不會影響大腸桿菌的檢測結果。綜上所述，該實驗方法對大腸桿菌的檢測具有良好的特異性。

圖6 添加不同陽性菌后的熒光變化Fig.6 Changes in fluorescence after adding different positive bacteria

2.5 檢測機制探究

圖7所示，分別顯示的用Colis-Fe3O4-GQDs復合物孵育前后的大腸桿菌的SEM顯微照片，經(jīng)過對比，可以看出（圖中標記部分），大腸桿菌經(jīng)Colis-Fe3O4-GQDs復合物培養(yǎng)前表面飽滿，經(jīng)復合物孵育后的大腸桿菌表面干癟、皺縮，某些菌體表面出現(xiàn)了明顯的凹陷，說明大腸桿菌經(jīng)Colis-Fe3O4-GQDs復合物孵育后其結構被破壞。粘菌素作為抗菌藥物，其抗菌機理主要是通過結合細菌細胞膜上的磷酸鹽, 減小細胞膜的表面張力、增加其通透性, 致使胞漿外流,進而導致大腸桿菌死亡[45]。據(jù)此，本實驗可以推斷量子點與粘菌素之間極有可能通過其中一個氨基基團來實現(xiàn)肽循環(huán)，根據(jù)粘菌素的抑菌機制，粘菌素的脂肪酸側鏈可與革蘭氏陰性細菌表面上的脂質(zhì)A相互作用，導致大腸桿菌的細菌結構發(fā)生破壞。Colis-Fe3O4-GQDs涂覆在大腸桿菌細胞壁的整個表面上，主要因為它是粘菌素敏感的細菌。通過觀察結果表明，該方法可以成功的創(chuàng)造附著在大腸桿菌表面上有效的Colis-Fe3O4-GQDs探針。

3 結論

圖7 加入Colis-Fe3O4-GQDs復合物孵育前（a）后（b）的大腸桿菌的SEM顯微照片F(xiàn)ig.7 SEM microradiography of normal Escherichia coli before(a) and after(b) incubated with Colis-Fe3O4-GQDs complex

本實驗合成了一種帶有強熒光的四氧化三鐵與石墨烯量子點的復合材料(Fe3O4-GQDs)，經(jīng)粘菌素修飾后，用以檢測大腸桿菌。大腸桿菌對Colis-Fe3O4-GQDs復合物的熒光猝滅效應可用于開發(fā)革蘭氏陰性細菌傳感器，本實驗開辟了革蘭氏陰性細菌的新方法，對于細菌細胞可用于使用LPS-粘菌素相互作用進行特異性識別。因此，大量的Colis-Fe3O4-GQDs復合物可同多種細菌結合，進而引起熒光猝滅。該生物傳感器對于革蘭氏陰性菌檢測提供了新的方法，在細菌檢測方面具有廣闊的應用前景。