曹 艷，何 向，劉德宇，黃永春

（廣西科技大學生物與化學工程學院，廣西糖資源綠色加工重點實驗室，廣西柳州 545006）

殼聚糖[1?3]是甲殼素經(jīng)脫乙酰作用后的一種堿性氨基多糖，具有較好的生物相容性、生物可降解性、安全性和抗菌抑菌性等優(yōu)點，在化工[4]、醫(yī)藥[5]、食品[6]、環(huán)保[7]、農(nóng)業(yè)[8]等諸多領域得到了廣泛應用。但殼聚糖是一種分子量較大的高分子聚合物，只能溶于部分有機酸和少數(shù)無機酸[9?10]，這在很大程度上限制了殼聚糖的應用。殼聚糖的降解產(chǎn)物不僅水溶性較好，并且具有許多優(yōu)越的功能特性和特殊的生理活性，具有更廣泛的應用，因此降解殼聚糖顯得十分必要。目前殼聚糖降解的方法主要有氧化降解法[11]、酶降解法[12]、物理降解法[13]等，而物理降解方法中的水力空化法[14]和超聲波法[15]由于其具有操作簡單、成本低、降解產(chǎn)物無污染等優(yōu)勢得到了廣泛關注，這兩種方法都是基于機械-化學協(xié)同效應降解殼聚糖[16?17]，機械效應與化學效應交互影響，作用機制十分復雜，較難同時探究清楚。

本文試圖僅從機械降解的角度出發(fā)來探究殼聚糖降解的內(nèi)在機制。高速剪切技術[18]是利用轉(zhuǎn)子高速旋轉(zhuǎn)產(chǎn)生的高剪切線速度和高頻機械效應作用于樣品，實現(xiàn)對樣品的粉碎、研磨或分散等功能，以達到乳化或混合的目的，該技術已廣泛應用于食品、制藥、化妝品、涂料等諸多行業(yè)[19?20]。本文提出利用高速剪切技術來完成殼聚糖的機械降解過程，殼聚糖在定、轉(zhuǎn)子狹隘的間隙中受到強烈的機械及液力剪切作用而發(fā)生糖苷鍵的斷裂，此種方法操作簡單、成本低廉、易于控制。本文研究不同操作參數(shù)及物性參數(shù)對殼聚糖降解性能的影響，探究殼聚糖機械降解過程的機制，為深入探究殼聚糖降解機理提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

殼聚糖 工業(yè)級，脫乙酰度 90%，深圳中發(fā)源生物科技有限公司；冰乙酸、三水合乙酸鈉 分析純，由西隴科學股份有限公司提供。

T25 DS25型高速剪切機 德國IKA公司；NDJ?1B型旋轉(zhuǎn)黏度計 上海昌吉地質(zhì)儀器有限公司；DF?101S型集熱式恒溫加熱磁力攪拌器 鞏義市京華儀器有限責任公司；SHZ?D(Ⅲ)型循環(huán)水式多用真空泵 上海錦賦實驗儀器設備有限公司；Waters1515凝膠滲透色譜儀 美國沃特世有限公司；NICOLET 6700傅里葉變換紅外光譜儀 美國Thermo Fisher公司。

1.2 實驗方法

圖1 高速剪切實驗裝置示意圖Fig.1 Schematic diagram of high-speed shear device

1.2.1 實驗裝置及原理 本實驗的高速剪切裝置如圖1所示。刀頭由轉(zhuǎn)子和定子組成，當轉(zhuǎn)子高速旋轉(zhuǎn)時產(chǎn)生極大的剪切力作用于物料，物料在定、轉(zhuǎn)子的狹小空間內(nèi)受到強烈的剪切、離心擠壓和撞擊作用，后兩者的作用最終導致物料又回到轉(zhuǎn)子區(qū)域使其反復受到高速剪切作用。高速剪切過程中產(chǎn)生大量氣泡，但氣泡不會發(fā)生瞬間潰滅，不會產(chǎn)生空化效應，故本過程是純機械作用于殼聚糖致使其發(fā)生降解的過程。

1.2.2 降解實驗 將0.2 mol/L乙酸鈉溶液與0.3 mol/L乙酸溶液以一定體積比混合配制乙酸?乙酸鈉緩沖溶液，以緩沖溶液為溶劑配制一定濃度的殼聚糖溶液2 L，取200 mL 殼聚糖溶液移入燒杯中，在設定為反應溫度的恒溫槽中放置30 min，開啟高速剪切機，在設定轉(zhuǎn)速下反應一段時間，測定降解反應前后殼聚糖溶液的動力黏度，考察剪切時間、轉(zhuǎn)速、溫度、殼聚糖原溶液濃度、殼聚糖分子量和溶液pH等因素對殼聚糖降解效果的影響。

1.2.2.1 剪切時間對降解效果的影響 將乙酸鈉溶液與乙酸溶液以體積比49:51混合均勻，調(diào)節(jié)pH為4.6，溶解分子量為100×104的殼聚糖原料，配制濃度為3 g/L的殼聚糖溶液。在溫度為40 ℃、轉(zhuǎn)速為12000 r/min的條件下反應不同時間（10、20、40、60、80 min），分析剪切時間對殼聚糖降解效果的影響。

1.2.2.2 轉(zhuǎn)速對降解效果的影響 將乙酸鈉溶液與乙酸溶液以體積比49:51混合均勻，調(diào)節(jié)pH為4.6，溶解分子量為100×104的殼聚糖原料，配制濃度為3 g/L的殼聚糖溶液。在溫度為40 ℃及不同轉(zhuǎn)速（4000、8000、12000、16000、20000 r/min）下反應40 min，分析轉(zhuǎn)速對殼聚糖降解效果的影響。

1.2.2.3 溫度對降解效果的影響 將乙酸鈉溶液與乙酸溶液以體積比49:51混合均勻，調(diào)節(jié)pH為4.6，溶解分子量為100×104的殼聚糖原料，配制濃度為3 g/L的殼聚糖溶液。在轉(zhuǎn)速為12000 r/min及不同反應溫度（30、40、50、60、70 ℃）下反應40 min，分析溫度對殼聚糖降解效果的影響。

1.2.2.4 殼聚糖原溶液濃度對降解效果的影響 將乙酸鈉溶液與乙酸溶液以體積比49:51混合均勻，調(diào)節(jié)pH為4.6，溶解分子量為100×104的殼聚糖原料，配制不同濃度（1、3、5、7、9 g/L）的殼聚糖溶液。在溫度為40 ℃、轉(zhuǎn)速為12000 r/min的條件下反應40 min，分析殼聚糖原溶液濃度對殼聚糖降解效果的影響。

1.2.2.5 殼聚糖分子量對降解效果的影響 將乙酸鈉溶液與乙酸溶液以體積比49:51混合均勻，調(diào)節(jié)pH為4.6，溶解不同分子量（10×104、50×104、100×104、200×104、500×104）的殼聚糖原料，配制濃度為3 g/L的殼聚糖溶液。在溫度為40 ℃、轉(zhuǎn)速為12000 r/min的條件下反應40 min，分析殼聚糖分子量對殼聚糖降解效果的影響。

1.2.2.6 溶液pH對降解效果的影響 將乙酸鈉溶液與乙酸溶液以不同體積比（3:37、3:22、53:147、49:51、7:3）混合均勻，調(diào)節(jié)pH分別為（2.6、3.8、4.2、4.6、5.0），溶解分子量為100×104的殼聚糖原料，配制濃度為3 g/L的殼聚糖溶液。在溫度為40 ℃、轉(zhuǎn)速為12000 r/min的條件下反應40 min，分析溶液pH對殼聚糖降解效果的影響。

1.2.3 黏度下降率的測定 殼聚糖降解的過程是動力黏度下降的過程[21]，本實驗采用旋轉(zhuǎn)黏度計測定殼聚糖降解前后的動力黏度，采用動力黏度下降率（η）來評價殼聚糖發(fā)生降解反應的程度，動力黏度下降率（η）的定義為：

式中：μ0是降解前殼聚糖原溶液的動力黏度，mPa·s；μ1是降解后殼聚糖溶液的動力黏度，mPa·s。

1.2.4 分子量分布的測定 本實驗采用凝膠滲透色譜儀[22]對降解前后的殼聚糖溶液的分子量分布進行了測定。選擇的實驗條件為：殼聚糖原料分子量100×104，殼聚糖溶液濃度3 g/L，pH4.6，降解溫度40 ℃，剪切時間40 min，轉(zhuǎn)速分別為0、4000、12000、20000 r/min。

1.2.5 紅外光譜分析 采用紅外光譜儀[23]對降解前后的殼聚糖在波數(shù)為400～4000 cm?1范圍內(nèi)進行紅外光譜分析。采用KBr壓片法進行樣品的制備：將干燥后的殼聚糖樣品放入研缽內(nèi)，在紅外烤燈下充分研磨，再加入干燥后的KBr粉末一起研磨至混合均勻，將混合粉末置于紅外壓片模具中，在紅外壓片機上壓成透明薄片后可用于測定。

1.3 數(shù)據(jù)處理

使用Origin 8.5軟件處理實驗數(shù)據(jù)并繪圖。

2 結果與分析

2.1 殼聚糖的降解效果

2.1.1 剪切時間對降解效果的影響 本實驗考察了在不同剪切時間下殼聚糖的降解效果，實驗結果如圖2所示。

圖2 剪切時間對降解效果的影響Fig.2 Effect of shear time on the degradation of chitosan

由圖2可見，剪切時間對殼聚糖降解的影響較大。當剪切時間為10 min時，黏度下降率僅1.11%，幾乎沒有發(fā)生降解；隨著剪切時間的延長，殼聚糖的黏度下降率逐漸增大，當剪切時間為80 min時，黏度下降率達到13.75%。出現(xiàn)此現(xiàn)象是因為在短時間內(nèi)殼聚糖長鏈受機械剪切作用的次數(shù)較少，前期階段受到的機械剪切效應帶來的動能尚不足以使長鏈發(fā)生斷裂，只有長鏈被反復多次剪切作用后才會發(fā)生斷裂，剪切時間越長，剪切作用于長鏈的次數(shù)越多，長鏈更易于斷裂而發(fā)生降解。因此，在本實驗條件下，最佳降解時間為80 min，但剪切時間越長，能耗越高，綜合考慮選擇40 min剪切時間進行其它單因素實驗。

2.1.2 轉(zhuǎn)速對降解效果的影響 本實驗考察了在不同轉(zhuǎn)速下殼聚糖的降解效果，實驗結果如圖3所示。

圖3 轉(zhuǎn)速對降解效果的影響Fig.3 Effect of rotational speed on the degradation of chitosan

由圖3可見，轉(zhuǎn)速對殼聚糖降解的影響較大，當轉(zhuǎn)速從4000 r/min增大到20000 r/min時，殼聚糖的黏度下降率從5.15%提高到20.27%，呈直線型趨勢增長。這是因為轉(zhuǎn)速越大，不僅作用于殼聚糖分子的剪切力越大，而且在相同時間內(nèi)作用于殼聚糖分子的次數(shù)越多，更易促使殼聚糖分子的長鏈發(fā)生斷裂；另外，隨著轉(zhuǎn)速的增大，流體間的剪切作用及流體與定子、容器壁的撞擊作用也會增強，在某種程度上也會促進分子鏈的斷裂。因此，轉(zhuǎn)速越大，殼聚糖的黏度下降率越高。在本實驗條件下，最佳降解轉(zhuǎn)速為20000 r/min，但從節(jié)能和減少機械磨損的角度考慮，選擇12000 r/min轉(zhuǎn)速進行其它單因素實驗。

2.1.3 溫度對降解效果的影響 考察了在不同溫度下殼聚糖的降解效果，實驗結果如圖4所示。

圖4 溫度對降解效果的影響Fig.4 Effect of temperature on the degradation of chitosan

由圖4可見，隨著溫度從30 ℃升高到70 ℃，殼聚糖的黏度下降率先增大后降低，殼聚糖原溶液的黏度從4.70 mPa·s逐漸降低到2.88 mPa·s，當溫度是40 ℃時，殼聚糖的黏度下降率最大，此時殼聚糖原溶液的黏度為4.3 mPa·s。這說明黏度對殼聚糖的機械降解過程有一定影響。黏度過大，流體的流動性較差，流體流動的阻力更大，導致殼聚糖分子被剪切的頻率降低；黏度過小，由于流體的流動性太好，當轉(zhuǎn)子作用于流體時，周圍流體易被推離轉(zhuǎn)子，導致被推開的流體未能受到轉(zhuǎn)子的剪切作用，且流體間的剪切作用也減小，從而導致流體受到的剪切力大大減弱。因此，為了使剪切作用發(fā)揮最大的效果，應根據(jù)溶液的黏度選擇合適的反應溫度，本實驗的最佳溫度是40 ℃。

2.1.4 殼聚糖原溶液濃度對降解效果的影響 通過配制不同濃度的殼聚糖原溶液來考察濃度對殼聚糖降解效果的影響，實驗結果如圖5所示。

圖5 殼聚糖原溶液濃度對降解效果的影響Fig.5 Effect of initial concentration of chitosan on degradation

由圖5可見，隨著殼聚糖原溶液濃度的增大，殼聚糖的黏度下降率先增大后降低。當殼聚糖原溶液濃度為1 g/L時，溶液的黏度為2.6 mPa·s，當殼聚糖原溶液濃度從3 g/L增大到9 g/L時，溶液的黏度從3.9 mPa·s增大到13.4 mPa·s，且當殼聚糖原溶液濃度為3 g/L時的黏度下降率最大，此時殼聚糖原溶液的黏度是3.9 mPa·s。本實驗的研究結果與2.1.3溫度對殼聚糖降解效果的影響的實驗結果相吻合，同樣說明黏度對殼聚糖的機械降解過程有一定影響，黏度過大、過小都不利于殼聚糖的機械降解過程，而當溶液黏度在4.0 mPa·s左右時，機械剪切殼聚糖的降解效果更好。

2.1.5 殼聚糖分子量對降解效果的影響 本實驗選取不同分子量的殼聚糖作為研究對象來考察原料分子量大小對殼聚糖降解效果的影響，實驗結果如圖6所示。

圖6 殼聚糖分子量對降解效果的影響Fig.6 Effect of molecular weight of chitosan on degradation

由圖6可見，隨著殼聚糖分子量的增大，殼聚糖的黏度下降率先增大后降低，最后趨于平緩，當殼聚糖分子量為100×104時的黏度下降率最大，此時殼聚糖原溶液的黏度是4.1 mPa·s。從圖6中還可看出，當殼聚糖分子量從200×104增大到500×104時，殼聚糖原溶液的黏度僅從5.4 mPa·s增大到6.0 mPa·s，黏度增大的幅度不大，相應地殼聚糖的黏度下降率變化也不大，且趨于平緩。這是因為在其它操作條件和物性條件不變的情況下，殼聚糖原料分子量的改變表現(xiàn)為溶液黏度的改變，黏度變化不大，則作用于殼聚糖長鏈的機械剪切力相差不大，因此殼聚糖的黏度下降率變化不大，再一次證實殼聚糖的機械降解過程與殼聚糖溶液的黏度密切相關，且溶液黏度為4.0 mPa·s時，機械剪切殼聚糖的降解效果更好。

2.1.6 溶液pH對降解效果的影響 本實驗考察了在不同溶液pH下殼聚糖的降解性能，實驗結果如圖7所示。

圖7 殼聚糖原溶液pH對降解效果的影響Fig.7 Effect of initial chitosan solution pH on the degradation

由圖7可見，殼聚糖原溶液pH對殼聚糖降解過程的影響較大。隨著pH的增大，黏度下降率逐漸增大。這是因為溶液中的H+濃度會隨著pH的減小而增大，同時溶液中的陰離子濃度也會逐漸增大，使得殼聚糖形成的鹽鍵增多[24]，增加了糖苷鍵斷裂的阻力，在同等的剪切條件下，糖苷鍵更難發(fā)生斷裂，所以殼聚糖的黏度下降率隨pH的減小而降低。從圖中還可發(fā)現(xiàn)，當殼聚糖原溶液pH從4.6增大到5.0時，溶液的黏度下降率有一定增大，但殼聚糖原溶液的黏度僅從4.5 mPa·s變化到4.6 mPa·s，變化極小，可認為黏度微小的變化對殼聚糖降解的影響近似忽略，殼聚糖降解過程主要是由于溶液中pH變化而引起的。

2.1.7 黏度與殼聚糖降解之間的內(nèi)在聯(lián)系 通過2.1.1～2.1.6的研究發(fā)現(xiàn)，在外部條件不變的情況下，殼聚糖溶液溫度、濃度、分子量的不同表現(xiàn)為溶液黏度的不同，黏度是影響機械剪切作用的重要因素，黏度不同導致作用于流體的剪切力不同，剪切力的強弱直接影響殼聚糖降解的程度。為了進一步找出溶液黏度與殼聚糖降解之間的內(nèi)在聯(lián)系，本研究以殼聚糖原溶液的黏度為橫坐標，殼聚糖的動力黏度下降率為縱坐標，繪制了二者的關系圖，結果如圖8所示。

圖8 殼聚糖溶液黏度與動力黏度下降率之間的關系Fig.8 Relationship between viscosity and dynamic viscosity reduction rate of chitosan

由圖8可見，當殼聚糖原溶液的黏度在3.5～6.0 mPa·s之間時，殼聚糖的黏度下降率較大，且當黏度為4.0 mPa·s時，殼聚糖的黏度下降率最大；當殼聚糖原溶液的黏度小于3.5 mPa·s或大于6.0 mPa·s時，殼聚糖的黏度下降率都呈明顯的下降趨勢，說明溶液黏度過大或過小都不利于殼聚糖的降解。因此，為了能夠使殼聚糖機械降解效率達到最優(yōu)，可以通過改變溫度、溶液濃度或分子量來調(diào)節(jié)溶液黏度至4.0 mPa·s左右，進而實現(xiàn)對殼聚糖機械降解過程的調(diào)控。

2.2 分子量的測定

由圖9可見，隨著轉(zhuǎn)速從4000 r/min增大到20000 r/min，降解產(chǎn)物凝膠滲透色譜圖的主峰逐漸由保留時間33.2 min向保留時間34.3 min的方向偏移，保留時間逐漸延長，說明殼聚糖在高速剪切作用下發(fā)生了降解，轉(zhuǎn)速越高，得到的降解產(chǎn)物分子量越小[22,25]。另外，隨著轉(zhuǎn)速的增加，降解產(chǎn)物的峰寬逐漸變窄，說明分子量分布更為集中。由此可見，利用機械剪切的方式可以獲得分子量分布更窄的降解產(chǎn)物。

圖9 不同轉(zhuǎn)速下降解產(chǎn)物的凝膠滲透色譜圖Fig.9 Gel permeation chromatogram of degradation products at different rotational speed

2.3 紅外光譜分析

由圖10可知，位于1029和1083 cm?1處的吸收峰是殼聚糖分子中的C-O伸縮振動吸收峰[26]，此處的吸收峰明顯減弱，說明C-O鍵發(fā)生了變化，表明降解過程主要是殼聚糖分子主鏈發(fā)生斷裂。1598 cm?1附近的吸收峰為酰胺Ⅱ（N-H）的特征吸收峰[27]，此處的吸收峰略發(fā)生了偏移，且吸收峰明顯增強，說明在降解過程中殼聚糖中的部分乙?；贿M一步脫除，提高了殼聚糖的脫乙酰度。899 cm?1附近的吸收峰是環(huán)伸縮振動的吸收峰[28]，此處的吸收峰位置基本沒變，表明殼聚糖的環(huán)狀結構沒有改變。由以上結果可知，殼聚糖經(jīng)高速剪切作用后，主要發(fā)生殼聚糖β-（1,4）-糖苷鍵的斷裂，部分N-乙?；D(zhuǎn)變?yōu)榘被?NH2），其它官能團和結構單元基本未發(fā)生變化，說明此降解方式不會改變殼聚糖降解產(chǎn)物的結構，且在一定程度上能提高殼聚糖的脫乙酰度。

圖10 殼聚糖原料及其降解產(chǎn)物的紅外譜圖Fig.10 Infrared spectra of chitosan and its degradation product

3 結論

本實驗探究了剪切時間、轉(zhuǎn)速、溫度、殼聚糖原溶液濃度、殼聚糖分子量及溶液pH對殼聚糖降解效果的影響，結果表明：隨著剪切時間和轉(zhuǎn)速的增大，殼聚糖動力黏度下降率均逐漸增大；隨著溫度、殼聚糖原溶液濃度和分子量的增大，殼聚糖動力黏度下降率均先升高再降低，均在殼聚糖原溶液黏度為4.0 mPa·s左右時出現(xiàn)黏度下降率最大；隨著pH的增大，殼聚糖動力黏度下降率逐漸增大。本實驗條件下，當殼聚糖原溶液濃度為3 g/L，分子量為100×104，pH為4.6，溫度為40 ℃，剪切時間為40 min，轉(zhuǎn)速為20000 r/min時，降解效果最明顯，動力黏度下降率可達20.27%。

殼聚糖溶液黏度對降解過程有一定影響，黏度過大或過小都不利于殼聚糖的降解，當殼聚糖溶液黏度為4.0 mPa·s時的機械降解效果最好。高速剪切技術能夠有效促進殼聚糖的降解，此種方式可獲得分子量分布更窄的降解產(chǎn)物，降解過程不會改變殼聚糖降解產(chǎn)物的結構，且在一定程度上能提高殼聚糖的脫乙酰度。