孫睦 趙俊英 孫振剛 楊帥 牛萬錦 李俊峰

甲狀腺癌是一種常見內(nèi)分泌腫瘤，且近年來患病率持續(xù)增加[1]。上述這個過程每個步驟均涉及1個或多個基因改變，這個過程>10年。甲狀腺癌與甲狀腺良性結(jié)節(jié)的臨床表現(xiàn)、療效、生存期具有很大差異，其中細(xì)胞遺傳學(xué)異常與患者的預(yù)后顯著相關(guān)[2]。為此找到診斷治療甲狀腺癌的新靶點(diǎn)，尋求更簡單、有效的診療方式，對改善患者預(yù)后具有重要價值[3]。MicroRNA(miRNA)是一類單鏈小RNA，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要的作用，microrna-675已被發(fā)現(xiàn)可參與多種重要生命過程，在前列腺癌、鼻咽癌、食管癌、乳腺癌中呈現(xiàn)異常表達(dá)譜情況[4,5]。長鏈非編碼RNAs(LncRNAs，long non-coding RNAs)為不具備編碼蛋白能力的RNA。LncRNAs具有明顯的時空表達(dá)特異性，可調(diào)控蛋白編碼基因的表達(dá)水平[6]。Actinin-4作為actin綁定蛋白，與細(xì)胞能動性和腫瘤的入侵、遷移密切相關(guān)。人類惡性腫瘤發(fā)展過程中，Actinin-4蛋白水平顯著升高，并且與腫瘤的不良預(yù)后相關(guān)[7],但其與甲狀腺癌的關(guān)系鮮有報道。胰島素樣生長因子1(IGF-1)及其受體(IGF-1R)在多種惡性腫瘤發(fā)病模型中起重要作用，其中IGF-R1在人甲狀腺癌細(xì)胞內(nèi)也過表達(dá)。IGF-1R特異性抑制劑(中和抗體、拮抗肽或激酶抑制劑NVP-ADW742)可以抑制多種腫瘤細(xì)胞生長[8]。本文具體探討了甲狀腺癌患者microrna-675、LncRNA LUCAT1、Actinin-4、IGF-1R的表達(dá)與臨床特征及預(yù)后的相關(guān)性，以明確甲狀腺癌的發(fā)生機(jī)制，為改善患者預(yù)后提供參考。報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2014年1月至2019年3月確診為甲狀腺癌患者78例(甲狀腺癌組)與甲狀腺良性結(jié)節(jié)患者78例(良性組)。甲狀腺癌組：甲狀腺乳頭狀癌54例，濾泡性癌20例，髓樣癌4例；臨床分期：Ⅰ期35例，Ⅱ期25例，Ⅲ期18例；組織學(xué)分化：低分化22例，中高分化56例；發(fā)病位置：左側(cè)36例，右側(cè)42例；遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移36例。良性組：結(jié)節(jié)性甲狀腺腫60例，甲狀腺腺瘤18例。本研究得到了所有患者的知情同意，也取得了本院倫理委員會的批準(zhǔn)書。2組患者資料等比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。見表1。

表1 2組一般資料比較

1.2 納入與排除標(biāo)準(zhǔn)

1.2.1 納入標(biāo)準(zhǔn)：甲狀腺癌與甲狀腺良性結(jié)節(jié)都經(jīng)過病理確診；臨床資料完整；年齡30～70歲；有相對完整的臨床及病理資料；均未進(jìn)行治療的初診患者。

1.2.2 排除標(biāo)準(zhǔn)：妊娠期及哺乳期女性；患有淋巴瘤等其他惡性腫瘤及嚴(yán)重免疫缺陷患者；合并糖尿病患者；臨床資料缺乏者；不配合調(diào)查者；合并精神障礙的患者；伴有出血性疾病、出血傾向；精神系統(tǒng)疾病或長期心理壓力過大患者。

1.3 microrna-675、LncRNA LUCAT1表達(dá)檢測 采集所有患者的空腹靜脈血3～5 ml，分為2管。其中一管抗凝后室溫放置2 h，取下層全血組織，分離外周血單個核細(xì)胞。提取總RNA，采用PrimerScript RT Reagent試劑盒(Takala)將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，然后采用定量PCR檢測試劑盒(taqman real-time PCR assays，德國Qiagen)檢測microrna-675、LncRNA LUCAT1表達(dá)水平。PCR擴(kuò)增條件：94℃預(yù)變性5 min，94℃變性1 min，55℃退火25 s，40個循環(huán)，4℃保存。實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用相對定量法ΔΔCT進(jìn)行分析，計算2-ΔΔCT，檢測全血microrna-675、LncRNA LUCAT1相對表達(dá)水平。

1.4 Actinin-4、IGF-1R表達(dá)檢測 取1.2中的另一管血液樣本，不進(jìn)行抗凝，室溫放置2 h后3 000 r/min離心10 min(離心半徑為10 cm)，分離上層血清在-80℃冰箱保存。采用酶聯(lián)免疫法檢測血清Actinin-4、IGF-1R含量，檢測試劑盒都由上海生工公司提供。

1.5 臨床資料與預(yù)后調(diào)查 調(diào)查所有患者的一般資料，詳細(xì)調(diào)查甲狀腺癌患者的病理資料，包括病理類型、臨床分期、組織學(xué)分化、發(fā)病位置、遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移等。同時隨訪到2020年1月1日，記錄所有患者的生存情況。

2 結(jié)果

2.1 microrna-675、LncRNA LUCAT1、Actinin-4、IGF-1R表達(dá)水平比較 甲狀腺癌組microrna-675、LncRNA LUCAT1相對表達(dá)水平和血清IGF-1R值低于良性組，血清Actinin-4值高于良性組(P<0.05)。見表2。

表2 2組microrna-675、LncRNA LUCAT1、Actinin-4、IGF-1R表達(dá)水平比較

2.2 預(yù)后情況比較 隨訪到2020年1月1日，良性

組患者都存活；甲狀腺癌組中存活67例，存活率85.9%，比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表3。

2.3 診斷價值分析 在156例患者中，ROC曲線分析microrna-675、LncRNA LUCAT1、Actinin-4、IGF-1R鑒別診斷甲狀腺癌的AUC值分別為0.843、0.807、0.811和0.837。

2.4 相關(guān)性分析 在甲狀腺癌患者中，Pearson分析顯示microrna-675、LncRNA LUCAT1、Actinin-4、IGF-1R表達(dá)水平與臨床分期、組織學(xué)分化、遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移、預(yù)后都存在相關(guān)性(P<0.05)。見表4。

2.5 影響因素分析 在甲狀腺癌患者中，以患者的隨訪生存作為因變量，以臨床分期、組織學(xué)分化、遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移、microrna-675、LncRNA LUCAT1、Actinin-4、IGF-1R表達(dá)水平等作為自變量，多因素Logistic回歸分析顯示臨床分期、組織學(xué)分化、遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移、microrna-675、LncRNA LUCAT1、Actinin-4、IGF-1R表達(dá)水平都為影響患者預(yù)后的主要因素(P<0.05)。見表5。

3 討論

已有研究顯示甲狀腺癌發(fā)病率逐年增加不僅是因?yàn)檫^渡診斷，還與一些風(fēng)險因素相關(guān)，如胰島素抵抗、環(huán)境致癌物和有限的治療手段[9]，這些因素對甲狀腺癌的發(fā)生發(fā)展至關(guān)重要。甲狀腺癌預(yù)后較好，5年存活率>90%，但是嚴(yán)重影響患者的生存質(zhì)量，增加了生活壓力。目前，臨床主要依靠超聲、病理學(xué)等手段診斷，存在一定程度的漏診及誤診[10]。

甲狀腺癌的發(fā)生發(fā)展是多因素、多階段，多種癌基因相互作用的復(fù)雜過程，但是具體機(jī)制還不明確。本研究顯示甲狀腺癌組的microrna-675、LncRNA LUCAT1相對表達(dá)水平和血清IGF-1R值低于良性組，血清Actinin-4值高于良性組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。從機(jī)制上分析，作為一類非編碼RNAs，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要的作用，可調(diào)控細(xì)胞增殖、黏附、凋亡等重要過程，研究表明H19RNA通過提供miR-675，結(jié)合與CDH13基因，阻斷CDH13表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)甲狀腺癌細(xì)胞侵襲和遷移能力[11]。LncRNA可在表觀遺傳學(xué)水平、轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄后水平等調(diào)控基因的表達(dá)，從而參與腫瘤的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移等病理過程[12]。LUCAT1可以增加MYC蛋白的半壽期，也可影響細(xì)胞功能[13]；并且可以與miRNA200家族結(jié)合而影響miRNA200家族對靶基因的作用。LUCAT1具有癌基因的特性和潛質(zhì)，在乳腺癌中表達(dá)上調(diào)[14]。細(xì)胞能動性在腫瘤細(xì)胞通過血液或淋巴侵入臨近組織或器官時至關(guān)重要，此時Actinin-4扮演重要角色。Actinin-4過表達(dá)與甲狀腺癌等腫瘤的不良預(yù)后和化療抵抗密切相關(guān)[15,16]。本研究發(fā)現(xiàn)，Actinin-4甲狀腺癌患者體內(nèi)高表達(dá)，可能作為甲狀腺癌診斷標(biāo)志物。IGF-1R在很多腫瘤中普遍表達(dá)，特異性抑制IGF-1R的功能(如選擇性小分子酪氨酸酶抑制劑)，可起到抗癌作用。甲狀腺癌細(xì)胞系和原發(fā)腫瘤樣本對IGF-1R抑制劑非常敏感。通過轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，抑制IGF-1R具有抑制增殖和促進(jìn)凋亡的多效性[17]。

甲狀腺癌是內(nèi)分泌系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤之一，隨著經(jīng)濟(jì)飛速發(fā)展、生活方式改變、社會人口老齡化等問題，該病在我國的發(fā)生率逐年增加[18]。腫瘤相關(guān)信號通路調(diào)節(jié)異常、表觀遺傳學(xué)修飾等因素均參與了甲狀腺癌的發(fā)生發(fā)展過程[19]。本研究顯示隨訪到2020年1月1日，良性組患者都存活；甲狀腺癌組中存活67例，存活率85.9%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；在156例患者中，ROC曲線分析microrna-675、LncRNA LUCAT1、Actinin-4、IGF-1R鑒別診斷甲狀腺癌的AUC值分別為0.843、0.807、0.811和0.837。

當(dāng)前隨著城市化進(jìn)程的加快，甲狀腺癌的發(fā)病率顯著升高。不過該病的增殖與侵襲是1個多步驟、多因素相互作用的復(fù)雜過程，具體的機(jī)制尚不清楚，明確甲狀腺癌的轉(zhuǎn)移與侵襲機(jī)制是當(dāng)前研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)[20]。基因異常和環(huán)境因素對甲狀腺癌的影響已經(jīng)被廣泛研究，但是疾病進(jìn)展過程中所包含的分子機(jī)制并不明確。大量miRNAs作為原癌基因或抑癌基因，參與了腫瘤的惡性發(fā)展進(jìn)程[21]。本研究Pearson分析顯示microrna-675、LncRNA LUCAT1、Actinin-4、IGF-1R表達(dá)水平與臨床分期、組織學(xué)分化、遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移、預(yù)后都存在相關(guān)性(P<0.05)；多因素Logistic回歸分析顯示臨床分期、組織學(xué)分化、遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移、microrna-675、LncRNA LUCAT1、Actinin-4、IGF-1R表達(dá)水平都為影響患者預(yù)后的主要因素(P<0.05)。LUCAT1位于8號染色體長臂2區(qū)4帶，其位于MYC原癌基因3端60 KB的位置，不過LUCAT1和MYC對一些疾病的發(fā)生可發(fā)揮獨(dú)立的作用[22]。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)microrna-675、在甲狀腺癌細(xì)胞系中表達(dá)降低，過表達(dá)microrna-675后可以抑制細(xì)胞活性、遷移和入侵能力，結(jié)果表明microrna-675作為腫瘤抑制因子，可調(diào)節(jié)甲狀腺癌發(fā)生發(fā)展進(jìn)程[23,24]。不過本研究也有一定的不足，沒有進(jìn)行臨床分析與實(shí)驗(yàn)動物模型分析，并沒有系統(tǒng)篩選LUCAT1可能作用的蛋白質(zhì)，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)收集存在差異，可能也會影響結(jié)果的準(zhǔn)確性，存在一定的研究偏倚，將在后續(xù)研究中深入分析。

綜上所述，甲狀腺癌患者伴隨有microrna-675、LncRNA LUCAT1、Actinin-4、IGF-1R的影響表達(dá)，與患者的臨床特征顯著相關(guān)，可用于鑒別診斷甲狀腺癌，且都是影響患者預(yù)后的重要因素。