張晶 舒琦瑾 項宗漢

Let-7a-3p是一種來自Let-7a-1或 Let-7a-3干環(huán)左臂的成熟微小RNA（miRNA），且Let-7a作為抑癌基因在癌癥中被廣泛研究。周恩等［1］研究提示，Let-7a-3p的同源類似物L(fēng)et-7a能顯著抑制Hep-2細(xì)胞的增殖，并使細(xì)胞凋亡率明顯升高。吳源周等［2］研究表明Let-7a-3p靶向IGF1R抑制人肺癌A549細(xì)胞中腫瘤干細(xì)胞的活性。但Let-7a-3p對肺癌細(xì)胞的能量代謝及機(jī)制尚未見報道，因此本研究采用Let-7a-3p模擬物基金項目：浙江省中醫(yī)藥管理局重點(diǎn)項目（2009ZA003）作者單位：311200 浙江省杭州市蕭山區(qū)中醫(yī)院（Let-7a-3p mimics）轉(zhuǎn)染人肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549細(xì)胞，觀察其對肺癌細(xì)胞糖酵解和葡萄糖攝取及凋亡的影響，并通過研究其對肺癌細(xì)胞相關(guān)功能蛋白及AMPK蛋白表達(dá)水平的影響，進(jìn)一步明確其分子生物學(xué)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 人肺癌細(xì)胞株A549（購自ATCC）；DMEM高糖培養(yǎng)基和胎牛血清（上海微科生物技術(shù)有限公司）；Real-time PCR 逆轉(zhuǎn)錄-聚合鏈酶反應(yīng)試劑盒（TaKaRa）；CCK-8試劑盒（日本同仁公司）。Bcl-2、Caspase-3、Ras及AMPK抗 體（Abcam）；Let-7a-3p mimics及其陰性對照（negative control mimic）、Let-7a-3p 及內(nèi)參照U6的PCR引物（百奧邁科生物技術(shù)有限公司）；轉(zhuǎn)染試劑脂質(zhì)2000（上海聯(lián)碩寶為生物科技有限公司）；XF糖酵解壓力測試試劑盒、XF細(xì)胞線粒體壓力測試試劑盒和XF基礎(chǔ)培養(yǎng)液均購自美國SeahorseB ioscience公司。

1.2 方法 （1）miRNA轉(zhuǎn)染及各組細(xì)胞系中Let-7a-3p水平的RT-qPCR檢測：用DMEM高糖培養(yǎng)基（含10%胎牛血清）常規(guī)培養(yǎng)A549細(xì)胞。按照轉(zhuǎn)染試劑的說明書進(jìn)行，在細(xì)胞融合度約為70%時以miRNA mimics終濃度為80 nmol/L轉(zhuǎn)染Let-7a-3p mimics和negative control mimic，分別作為Let-7a-3p組和negative control（NC）組，轉(zhuǎn)染48 h；以未轉(zhuǎn)染的A549細(xì)胞作為對照組。根據(jù)北京百奧公司的組織細(xì)胞miRNA 提取試劑盒說明書進(jìn)行RNA 提取操作，參照Thermo Scientific反轉(zhuǎn)錄說明書，合成cDNA。并以雙標(biāo)準(zhǔn)曲線的相對定量法進(jìn)行qPCR定量分析，以人U6作為內(nèi)參照，反應(yīng)條件為：95 ℃ 30 s 1循環(huán)；95℃ 5 s，62 ℃ 30 s，72℃ 30 s 40循環(huán)；實驗設(shè)置3個平行復(fù)孔，結(jié)果用2-ΔΔCt法進(jìn)行分析計算。實驗所需引物如下：Let-7a-3p：F：5'-GCGCGTAGTCTGAGAGGTTG-3' R：5'-CCAGGGAGTGTCCGAGGT-3'；U6：F：5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'，R：5'-CGCTTCACGAATTTGCGT-3'。（2）CCK-8法檢測細(xì)胞活性：取轉(zhuǎn)染后各實驗組處于對數(shù)生長期的A549細(xì)胞，用胰酶進(jìn)行消化，待細(xì)胞皺縮逐漸懸浮時可以終止消化，在培養(yǎng)基中調(diào)整細(xì)胞密度為1×104/ml，接種于96孔板，每孔100 μl，培養(yǎng)24 h、48 h和72 h后，每孔加10 μl CCK-8置于培養(yǎng)箱中孵育4 h，用酶標(biāo)儀測定450 nm處的吸光值。最后計算不同實驗組和作用時間下的活細(xì)胞數(shù)。每組設(shè)3個復(fù)孔，實驗重復(fù)3次。（3）能量代謝分析儀檢測各組細(xì)胞能量代謝的改變：將各實驗組生長狀態(tài)良好的細(xì)胞制成密度為1.2×105/ml的細(xì)胞懸液，每孔80 μl接種于Seahorse專用96孔板。室溫靜置1 h后，放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)23 h。糖酵解壓力測試試驗：分別向探針板A、B和C孔加入葡萄糖 、寡霉素和2-DG；線粒體壓力測試試驗：分別向探針板A、B和C孔加入寡霉素 、FCCP、抗霉素和魚藤酮。校正探針板后，加入細(xì)胞培養(yǎng)板檢測。（4）流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡：取轉(zhuǎn)染后各組肺癌細(xì)胞，用胰酶對A549細(xì)胞進(jìn)行消化，待細(xì)胞皺縮逐漸懸浮時可以終止消化，加入PBS反復(fù)洗滌離心后，收集到相應(yīng)的15 ml離心管中。1000 rpm的速度離心5 min并將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至1.5 ml的EP管中，用預(yù)冷的PBS洗2遍細(xì)胞。細(xì)胞調(diào)亡試劑盒FITC染色0.5 h。所得流式結(jié)果采用FlowJo軟件進(jìn)行分析。（5）Western blot 法檢測細(xì)胞蛋白表達(dá)的變化：收集分組轉(zhuǎn)染后的肺癌A549細(xì)胞，用預(yù)冷PBS洗2遍，然后用RIPA裂解液于4 ℃裂解細(xì)胞，提取總蛋白。用Lowry法測定蛋白濃度并調(diào)至統(tǒng)一濃度后，加入5×蛋白上樣緩沖液后煮沸10 min，加到4%濃縮膠濃縮，10%分離膠分離進(jìn)行常規(guī)電泳，轉(zhuǎn)膜2 h（200 mA）。轉(zhuǎn)印膜封閉24 h（5%脫脂乳），洗液清洗轉(zhuǎn)印膜3次（10 min/次），標(biāo)記基因?qū)?yīng)的一抗（Bcl-2、Caspase-3、Ras及AMPK；1000倍稀釋）室溫1.5 h，洗液清洗轉(zhuǎn)印膜3次，辣根過氧化物沒標(biāo)記的二抗（1000倍稀釋），洗液清洗轉(zhuǎn)印膜3次，ECL顯影。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 18.0統(tǒng)計軟件。Light Cycler480II軟件進(jìn)行RT-PCR數(shù)據(jù)分析，計量資料以（±s）表示，組間比較采用t檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞后Let-7a-3p表達(dá)水平 Let-7a-3p組Let-7a-3p表達(dá)水平明顯上調(diào)（P<0.01）。見圖1。

圖1 轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞后Let-7a-3p表達(dá)水平

2.2 轉(zhuǎn)染Let-7a-3p后對A549細(xì)胞活性的影響 與A549、NC組比較，轉(zhuǎn)染Let-7a-3p后A549活細(xì)胞相對數(shù)明顯減少（P<0.01），且隨著處理時間延長，Let-7a-3p組活細(xì)胞相對數(shù)逐漸減少。見圖2。

圖2 轉(zhuǎn)染Let-7a-3p后A549細(xì)胞的活性

2.3 轉(zhuǎn)染Let-7a-3p后對A549細(xì)胞糖酵解和葡萄糖氧化的影響 采用海馬細(xì)胞能量代謝實時測定儀XF分析測定氧耗率（OCR）和細(xì)胞外酸化率（ECAR）結(jié)果所示，與A549、NC組比較，Let-7a-3p組OCR和ECAR減少（P<0.01）。見圖3。

圖3 各組細(xì)胞的能量代謝

2.4 轉(zhuǎn)染Let-7a-3p后對A549細(xì)胞凋亡影響 與A549組比較，Let-7a-3p組細(xì)胞凋亡率增多（P<0.01）；而NC組與A549組比較無明顯變化。見圖4。

圖4 各組細(xì)胞凋亡情況

2.5 轉(zhuǎn)染Let-7a-3p后對A549細(xì)胞Bcl-2、Caspase-3、Ras及AMPK蛋白的影響 與A549、NC組比較，轉(zhuǎn)染Let-7a-3p后 A549細(xì)胞中Bcl-2與Ras蛋白下調(diào)（P<0.01）；而Caspase-3與AMPK蛋白上調(diào)（P<0.01）。見圖5。

圖5 各組細(xì)胞中Bcl-2、Caspase-3、Ras及AMPK蛋白表達(dá)

3 討論

肺癌細(xì)胞的侵襲、轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)是目前肺癌患者綜合治療失敗甚至致死的主因，如何有效抑制肺癌細(xì)胞的侵襲、轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)一直是肺癌研究的重要方向。近年來，人們發(fā)現(xiàn)在代謝和炎癥反應(yīng)方面的變化是由miRNAs調(diào)控的，miRNA是一種大小接近19~25個核苷酸的非編碼RNA。越來越多的證據(jù)證實，在腫瘤細(xì)胞中miRNA異常表達(dá)，由于其在細(xì)胞增殖、凋亡、分化等多種生物學(xué)功能中發(fā)揮關(guān)鍵作用［3-5］。大量miRNA參與了肺癌的發(fā)生發(fā)展過程［6-7］。Let-7家族的基因定位，這些位點(diǎn)與癌癥的發(fā)生密切相關(guān)，尤其是肺癌。因此，研究Let-7a-3p在肺癌發(fā)生過程中的功能作用及其確切機(jī)制具有重要意義。

目前研究表明，不同的miRNAs在各種癌癥中均有差異表達(dá)，并作為癌基因或腫瘤抑制因子發(fā)揮功能。Let-7a在目前抑癌 miRNA 研究中受到關(guān)注［1］。然而，Let-7a-3p的表達(dá)對肺癌細(xì)胞能量代字謝的影響及確切分子機(jī)制尚未被深入研究。本研究顯示，Let-7a-3p表達(dá)在肺癌細(xì)胞系中下調(diào)。此外，Let-7a-3p轉(zhuǎn)染后，成功提高肺癌A549 細(xì)胞中Let-7a-3p 的水平。并發(fā)現(xiàn)高水平Let-7a-3p可抑制A549 細(xì)胞的活性及能量代謝，并促進(jìn)其凋亡。表明Let-7a-3p mimic具有抑制肺癌發(fā)展的潛能。進(jìn)而，對其抑制肺癌細(xì)胞潛能的機(jī)制進(jìn)行深入探索。近年來，研究表明AMPK作為一種燃料感應(yīng)酶，在能量不足時激活，在能量過剩時被抑制。因此，AMPK的激活會關(guān)閉消耗ATP的合成代謝過程，并開啟分解代謝過程，為產(chǎn)生ATP以應(yīng)對壓力提供替代途徑。AMPK已經(jīng)成為公認(rèn)的治療代謝綜合征的靶點(diǎn)，并逐漸成為治療癌癥的靶點(diǎn)［8-9］。AMPK可被臨床使用的多種藥理學(xué)藥物激活，包括二甲雙胍、黃連素和阿司匹林，這意味著影響AMPK的實驗結(jié)果可轉(zhuǎn)化為相關(guān)疾?。?0］的治療策略。本研究證實 Let-7a-3p mimics可以上調(diào)肺癌A549細(xì)胞中AMPK并誘導(dǎo)其凋亡，而阻斷AMPK的激活可以防止肺癌細(xì)胞凋亡的發(fā)生。有研究表明，激活A(yù)MPK明顯促進(jìn)小鼠肺癌細(xì)胞系LLC1和人腺癌細(xì)胞系A(chǔ)549的凋亡。同樣CAO等［8］發(fā)現(xiàn)narciclasine通過調(diào)節(jié)AMPK-ULK1信號軸促進(jìn)自噬依賴的細(xì)胞凋亡，顯示對三陰性乳腺癌的治療潛力。另一方面，癌細(xì)胞需氧糖酵解增加是癌癥進(jìn)展的普遍特征，其增加大分子生物合成的葡萄糖攝取和代謝中間體，以支持細(xì)胞快速生長。AMPK的激活在調(diào)控癌細(xì)胞需氧糖酵解中起關(guān)鍵作用。與之前報道一致，本研究發(fā)現(xiàn)調(diào)控Let-7a-3p的表達(dá)可以影響肺癌細(xì)胞的糖酵解和葡萄糖攝取。可見Let-7a-3p 過表達(dá)可能是通過調(diào)節(jié)AMPK而導(dǎo)致線粒體葡萄糖氧化和細(xì)胞質(zhì)糖酵解的抑制、最終產(chǎn)生ATP耗竭和細(xì)胞凋亡。然而AMPK在細(xì)胞存活中的確切作用是有爭議的［11-12］。較多研究表明，AMPK可以保護(hù)細(xì)胞免受營養(yǎng)剝奪、氧化應(yīng)激和能量應(yīng)激［13］的影響。甚至有研究報道AMPK可以維持線粒體mPTP和MMP的完整性［14-15］。一些研究認(rèn)為AMPK在這些方面的作用相反［16］。產(chǎn)生這些不同現(xiàn)象可能是因為在腫瘤發(fā)生的早期，由于血液供應(yīng)不足，出現(xiàn)腫瘤或腫瘤中心缺氧、營養(yǎng)供應(yīng)不足，AMPK在這些情況下被瞬間激活，起到保護(hù)作用，而AMPK的持續(xù)激活可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡；亦或是AMPK在誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡的同時，保護(hù)正常細(xì)胞不受應(yīng)激的影響。

綜上所述，Let-7a-3p過表達(dá)可以通過下調(diào)Bcl-2與Ras蛋白的表達(dá)，上調(diào)Caspase-3及AMPK蛋白的表達(dá)影響肺癌A549細(xì)胞的活性、凋亡及能量代謝，從而抑制肺癌的發(fā)生和發(fā)展。Let-7a-3p在改變肺癌代謝、調(diào)控肺癌細(xì)胞的增殖和凋亡潛能方面具有重要作用?？赡転榉伟┑脑\斷提供一個潛在的標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)。