張霜

B 族鏈球菌(GBS)即無(wú)乳鏈球菌主要定植于女性生殖道和消化道,是造成孕生婦圍生期感染的主要病原菌之一。GBS 可能會(huì)造成孕婦早產(chǎn)、胎膜早破,還可能傳染給胎兒,導(dǎo)致胎兒宮內(nèi)感染,出現(xiàn)腦膜炎、敗血癥等嚴(yán)重并發(fā)癥［1］。因此做好GBS 定植的篩查,積極進(jìn)行針對(duì)性的抗生素干預(yù),對(duì)于保障母嬰的生命安全有重要的意義。本次研究對(duì)于常規(guī)血瓊脂培養(yǎng)法、顯色培養(yǎng)法及PCR法篩查孕婦GBS的效果進(jìn)行了比較,報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2017 年3 月～2019 年12 月本院產(chǎn)科門診的715 例孕晚期孕婦作為研究對(duì)象。孕婦年齡22～45 歲,平均年齡(30.1±5.0)歲；其中初產(chǎn)婦 420 例(58.74%),經(jīng)產(chǎn)婦295 例(41.26%)。

1.2 儀器與試劑

1.2.1 儀器 選用ABI 公司的7500 RES-TIME 型熒光定量PCR 擴(kuò)增儀、梅里埃公司的VITEK 2 Compact 全自動(dòng)細(xì)菌鑒定及藥敏分析系統(tǒng),以及其配套的GP 鑒定卡。

1.2.2 試劑 梅里埃公司的GBS 分群凝集試劑盒、哥倫比亞血瓊脂培養(yǎng)基。泰普生物科學(xué)公司的GBS 核酸檢測(cè)試劑盒和GBS 顯色培養(yǎng)基。金黃色葡萄球菌(ATCC25923)和無(wú)乳鏈球菌(ATCC12386)的質(zhì)控菌株由中國(guó)醫(yī)學(xué)微生物菌種保藏中心提供。選擇性T-H 增菌肉湯由英國(guó)OXOID 公司提供。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)本采集 對(duì)所有孕婦均采集其陰道和肛周分泌物標(biāo)本。陰道和肛周分泌物樣本采集的位置在陰道口1/3 處、括約肌上面3 cm 左右處。使用無(wú)菌拭子,小心旋轉(zhuǎn)1 圈取得分泌物樣本。

1.3.2 樣本檢測(cè) 采集樣本分別采用常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)法、顯色培養(yǎng)法及熒光PCR 法進(jìn)行GBS 篩查,并以T-H 肉湯增菌培養(yǎng)法為參考標(biāo)準(zhǔn)。①常規(guī)血瓊脂培養(yǎng)法：將標(biāo)本接種至哥倫比亞血瓊脂培養(yǎng)基上,分區(qū)劃線后,放入CO2培養(yǎng)箱,在35℃,5%～6% CO2下孵育24 h。取出培養(yǎng)皿,通過(guò)觀察菌落的形態(tài)特征和β 溶血特性進(jìn)行尋找GBS 菌落。選取β 溶血灰白色,且革蘭染色為陽(yáng)性的可疑菌落,進(jìn)行進(jìn)一步的觸酶試驗(yàn)、CAMP 試驗(yàn)和溶血試驗(yàn),以篩選GBS 菌落。對(duì)于篩選出的GBS 菌落采用VITEK 2 Compact 細(xì)菌鑒定及藥敏分析系統(tǒng)進(jìn)行最終的鑒定和確認(rèn)。②顯色培養(yǎng)法：將標(biāo)本接種至顯色培養(yǎng)基上,分區(qū)劃線,置入CO2培養(yǎng)箱,以同樣條件孵育24 h。孵育完成后,挑選紅色的可疑菌落進(jìn)行CAMP 試驗(yàn),對(duì)于CAMP 試驗(yàn)陽(yáng)性的菌落采用VITEK 2 Compact 細(xì)菌鑒定及藥敏分析系統(tǒng)進(jìn)行最終的鑒定和確認(rèn)。③熒光PCR 法：將標(biāo)本加入緩沖液高速震蕩搖勻制備成標(biāo)本懸浮液。離心5 min (13000 r/min)取沉淀物。加入緩沖液再次以同樣轉(zhuǎn)速離心5 min,保留沉淀物。加入100 μl 的TE 緩沖液進(jìn)行重懸,并加入內(nèi)參物。高速震蕩5 min 后先干浴120 s,再進(jìn)行冰浴300 s,最后再進(jìn)行離心60 s 留取上清液。取5 μl 上清液作為PCR 檢測(cè)樣本加入反應(yīng)管中進(jìn)行PCR 擴(kuò)增,按照GBS 核酸檢測(cè)試劑盒的說(shuō)明書進(jìn)行結(jié)果的判斷。④T-H 肉湯增菌培養(yǎng)法：將取的拭子標(biāo)本加入T-H 增菌肉湯中,充分混勻后,放入CO2培養(yǎng)箱,在35℃,CO2濃度為5%～6%的條件下進(jìn)行孵育24 h左右。然后接種至血平板上,尋找可疑菌落,并對(duì)可疑菌落進(jìn)行處理,處理方法與常規(guī)血瓊脂培養(yǎng)法相同。

1.4 觀察指標(biāo) 以T-H 肉湯增菌培養(yǎng)法為參考標(biāo)準(zhǔn),比較不同檢測(cè)方法篩查GBS 的靈敏度、特異度。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS17.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件處理數(shù)據(jù)。計(jì)數(shù)資料以率(%)表示,采用χ2檢驗(yàn)。P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

715 例孕晚期孕婦經(jīng)T-H 肉湯增菌培養(yǎng)法檢測(cè)陽(yáng)性68 例,陽(yáng)性率為9.51%。以T-H 肉湯增菌培養(yǎng)法為參考標(biāo)準(zhǔn),常規(guī)細(xì)菌培養(yǎng)法檢測(cè)的GBS 的靈敏度、特異度分別為64.71%、99.85%；顯色培養(yǎng)法分別為91.18%、99.69%,熒光PCR 法分別為95.59%、99.85%。顯色培養(yǎng)法及熒光PCR 法篩查GBS 的靈敏度均高于常規(guī)細(xì)菌培養(yǎng)法,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。見表1。

表1 不同檢測(cè)方法的GBS 篩查結(jié)果比較(n)

3 討論

常規(guī)血瓊脂平板細(xì)菌培養(yǎng)是目前GBS 篩查的常用手段。但是其對(duì)于菌落的最低檢測(cè)量要求較高,而樣本中細(xì)菌種類過(guò)多,未經(jīng)挑選進(jìn)行培養(yǎng),一些腸桿菌繁殖迅速,會(huì)限制GBS 的生長(zhǎng),使得GBS 的菌量未達(dá)到最低檢測(cè)量,容易發(fā)生漏檢［2］。且常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)的耗時(shí)長(zhǎng),需孵育過(guò)夜,且培養(yǎng)結(jié)果容易受到標(biāo)本采集和運(yùn)送過(guò)程影響。而顯色培養(yǎng)法利用GBS 在厭氧條件下能合成橙紅色的類胡蘿卜素,從而形成橙紅色菌落進(jìn)行GBS 的篩選,再對(duì)特征性顏色的菌落進(jìn)行鑒定和檢驗(yàn),具有較高的靈敏度。不過(guò)一些鏈球菌如化膿鏈球菌等在同樣條件下會(huì)形成類似顏色的色素,另外還有較少比例的GBS 不會(huì)產(chǎn)生類胡蘿卜素,約在5%左右,故還是存在一定的漏檢或誤檢［3］,本次研究中即有2 例化膿鏈球菌被誤檢為GBS。而熒光PCR 是針對(duì)GBS 設(shè)計(jì)特異性引物,在體外通過(guò)PCR 反應(yīng)擴(kuò)增得到特定的DNA 片段,加以熒光染料標(biāo)記探針,從而檢測(cè)GBS 的核酸片段。熒光PCR 檢測(cè)的靈敏度極佳,陽(yáng)性率高,且檢測(cè)迅速。賈忠蘭等［4］的研究結(jié)果顯示,熒光PCR 篩查GBS 的靈敏度最佳。本次研究對(duì)于常規(guī)血瓊脂培養(yǎng)法、顯色培養(yǎng)法及熒光PCR 法三種方法篩查孕婦GBS 的效果進(jìn)行了比較,結(jié)果顯示顯色培養(yǎng)法及熒光PCR 法的GBS 篩查靈敏度高于常規(guī)細(xì)菌培養(yǎng)法(P＜0.05)。這與既往高坎坎等［5］的研究一致,熒光PCR 法和顯色培養(yǎng)法在孕婦GBS 篩查中的應(yīng)用價(jià)值較高,而常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)的篩查效果不夠理想。熒光PCR法檢測(cè)迅速,靈敏性好,但成本較高,而顯色培養(yǎng)法操作簡(jiǎn)單,成本低,且在篩選純化GBS 后,還可進(jìn)一步進(jìn)行藥敏試驗(yàn)但相對(duì)耗時(shí),臨床可根據(jù)具體情況選用。

綜上所述,熒光PCR 法和顯色培養(yǎng)法在孕婦GBS篩查中的應(yīng)用價(jià)值較好,臨床可根據(jù)具體情況選用。