黃科文，曹藝蘭，鄭陽(yáng)霞，李 良，劉 繼，林立金，廖明安

(1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 園藝學(xué)院，四川 成都 611130；2.甘孜藏族自治州農(nóng)技土肥站，四川 康定 626000；3.成都市農(nóng)林科學(xué)院，四川 成都 611130；4.四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 果蔬研究所，四川 成都 611130)

硒 (selenium，Se) 是一種必需元素，在動(dòng)物及人體中發(fā)揮著重要的生物學(xué)作用，具有抗氧化、防癌、增強(qiáng)人體免疫及生殖能力等多種功能[1]。人體硒含量不足易引起GSH-Px 等抗氧化酶活性的降低，從而增加類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、心肌病和癌癥等疾病發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)[2]。中國(guó)是典型的缺硒國(guó)家，自東北(黑龍江)到西南(云南)地區(qū)均屬于貧硒地帶[3]，多地曾爆發(fā)過(guò)大規(guī)模的地方性缺硒癥狀[4]。適當(dāng)補(bǔ)硒不僅可以有效防治缺硒病癥的發(fā)生，還能維持人體免疫系統(tǒng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)以及神經(jīng)系統(tǒng)的穩(wěn)態(tài)，增強(qiáng)人體的抗性[5]。硒在自然界中賦存多種形態(tài)，與無(wú)機(jī)硒相比，硒代半胱氨酸以及硒代蛋氨酸等有機(jī)硒可被人體直接吸收利用，被認(rèn)為是最理想的硒源[6]。在自然環(huán)境中，植物不僅在硒的化學(xué)循環(huán)中扮演著重要角色，更是將無(wú)機(jī)硒轉(zhuǎn)化為有機(jī)硒的主要承擔(dān)者。盡管通過(guò)添加外源硒肥可以有效提高農(nóng)產(chǎn)品的硒含量，但據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，目前可面向市場(chǎng)推廣的富硒農(nóng)產(chǎn)品只有40 余種[7]，遠(yuǎn)遠(yuǎn)達(dá)不到人們對(duì)硒的需求。因此，篩選及選育優(yōu)良的富硒品種以及通過(guò)農(nóng)藝措施增強(qiáng)植物對(duì)硒的富集能力是富硒農(nóng)產(chǎn)品的重要研究方向。

雜交選育多指具有不同遺傳性狀個(gè)體間的有性交配，可以通過(guò)雙親基因的重新組合進(jìn)而綜合親本的優(yōu)良性狀，獲得具有雜種優(yōu)勢(shì)的新品種(系)[8]。優(yōu)勢(shì)雜種的目標(biāo)性狀主要通過(guò)其親本傳遞，選擇性狀互補(bǔ)或累加的高親和親本雜交可以有效提高育種效率，克服雙親的不利性狀[9]。因此，在雜交育種中，親本的正確選擇以及合理的組配是成功獲得親本優(yōu)良性狀的重要基礎(chǔ)。生態(tài)型是指同一物種受生態(tài)適應(yīng)性、種植模式以及地理隔離等因素的影響表現(xiàn)出具有一定結(jié)構(gòu)或功能差異的不同類群[10]。不同生態(tài)型的植株在同一生長(zhǎng)環(huán)境中仍能保持穩(wěn)定的遺傳差異，以其為雜交材料不僅可以增加其后代的遺傳變異還能克服當(dāng)?shù)仄贩N基因貧乏單一的弱點(diǎn)[9]。王堅(jiān)等[11]以9 個(gè)生態(tài)類型的59 份粳稻主栽品種為親本材料，通過(guò)雙列雜交試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)華北粳、日本粳以及韓國(guó)粳這3 個(gè)生態(tài)型材料相互結(jié)合可有效提高后代稻米的整精米率，為粳稻親本的選擇提供了參考。朱建榮等[12]發(fā)現(xiàn)：利用云南不同生態(tài)型甘蔗細(xì)莖野生種與甘蔗栽培種雜交對(duì)后代經(jīng)濟(jì)性狀的影響存在較大差異，其中云割83-174、瑞割83-160 及云南1 號(hào)野生種可作為蔗糖高糖育種的優(yōu)良種質(zhì)。目前，國(guó)內(nèi)外有關(guān)富硒農(nóng)產(chǎn)品的研究主要集中在富硒農(nóng)作物的資源篩選，并成功選育了谷豐優(yōu)8312[13]、晉糯8 號(hào)[14]和青雜2 號(hào)[15]等具有高富硒潛力的作物良種，但有關(guān)不同生態(tài)型野菜資源的富硒研究尚未見(jiàn)報(bào)道。少花龍葵(Solanum photeinocarpum)又名白花菜，為茄科茄屬一年生直立草本植物，可作蔬菜食用，其嫩葉富含粗蛋白、粗纖維、維生素以及多種營(yíng)養(yǎng)元素，被認(rèn)為是一種具有較高開(kāi)發(fā)價(jià)值的野生植物資源[16]。另外，研究表明：少花龍葵地上部分的硒含量可在外源硒處理下超過(guò)富硒植物的臨界值并對(duì)高濃度硒表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗逆性，是一種理想的富硒野菜[17]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)：農(nóng)田生態(tài)型和礦山生態(tài)型少花龍葵的生長(zhǎng)及抗逆性在相同生長(zhǎng)條件下具有較大差異，并通過(guò)雜交試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)少花龍葵F1代對(duì)鎘脅迫的抗逆性表現(xiàn)出較強(qiáng)的雜種優(yōu)勢(shì)，為少花龍葵親本的選擇提供了參考[18]。因此，本試驗(yàn)以農(nóng)田生態(tài)型和礦山生態(tài)型少花龍葵為親本，研究正反雜交對(duì)2 種生態(tài)型少花龍葵F1代生長(zhǎng)及硒積累的影響，以期篩選出既能提高少花龍葵后代硒含量又能促進(jìn)其生長(zhǎng)的雜交組合，為富硒野生蔬菜的雜交選育提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試材料

2017 年8 月，分別在四川農(nóng)業(yè)大學(xué)雅安校區(qū)農(nóng)場(chǎng)(N30°23′，E103°48′)和四川省漢源縣唐家山鉛鋅礦區(qū)(N29°24′，E102°38′)收集少花龍葵的種子保存。

四川農(nóng)業(yè)大學(xué)雅安校區(qū)農(nóng)場(chǎng)，平均海拔620 m，屬亞熱帶濕潤(rùn)季風(fēng)氣候區(qū)，多年平均氣溫16.2 ℃，多年平均降雨量1 743.3 mm，多年平均日照時(shí)間1 035 h，多年平均蒸發(fā)量1 011.2 mm[19]。唐家山鉛鋅礦區(qū)，平均海拔890 m?，F(xiàn)保有鉛鋅礦儲(chǔ)量145.8 萬(wàn) t，年采礦10 萬(wàn) t，已連續(xù)開(kāi)采15年，零星堆積了60 多萬(wàn)t廢礦渣。礦區(qū)地處北溫帶與季風(fēng)帶之間的山地亞熱帶氣候區(qū)，具有典型的干熱河谷氣候特點(diǎn)，多年平均氣溫17.9 ℃，多年平均降雨量741.8 mm，多年平均日照時(shí)間1 475.8 h，多年平均蒸發(fā)量1 248.2 mm[19]。

供試土壤取自四川農(nóng)業(yè)大學(xué)成都校區(qū)周圍農(nóng)田，基本理化性質(zhì)為：pH 7.09，全氮含量為1.50 g/kg，全磷含量為0.76 g/kg，全鉀含量為18.02 g/kg，堿解氮含量為94.82 mg/kg，有效磷含量為6.30 mg/kg，速效鉀含量為149.59 mg/kg[20]。將土壤風(fēng)干、碾碎，稱取4.0 kg 裝于21 cm×20 cm(高×直徑) 的塑料盆內(nèi)，加入分析純Na2SeO3溶液，使土壤硒含量為10 mg/kg，保持土壤田間持水量的80%，自然放置平衡4 周，期間不定期翻土混合，使土壤充分混合均勻。

1.2 試驗(yàn)方法

2018 年4 月，分別將農(nóng)田生態(tài)型和礦山生態(tài)型少花龍葵的種子播種于穴盤中催芽，待少花龍葵幼苗高約5 cm、2 片真葉完全展開(kāi)時(shí)分別移栽至干凈土壤中，不定期澆水，保持土壤田間持水量的60%。待少花龍葵進(jìn)入花蕾期后，選擇花冠微露、圓潤(rùn)飽滿、色澤泛黃的花苞用鑷子去雄后立即套袋，并在去雄的1～3 d 內(nèi)用蘸取了少量少花龍葵父本花粉的毛筆在去雄母本的柱頭上均勻涂抹。雜交后約1 周，當(dāng)少花龍葵花瓣開(kāi)始凋謝、幼果成形時(shí)去除套袋并做好標(biāo)記，待果實(shí)成熟后及時(shí)采收并收集種子保存?zhèn)溆?。農(nóng)田生態(tài)型少花龍葵(♀)× 礦山生態(tài)型少花龍葵(♂) 的后代記為正交F1代；礦山生態(tài)型少花龍葵(♀)× 農(nóng)田生態(tài)型少花龍葵(♂)的后代記為反交F1代；農(nóng)田生態(tài)型少花龍葵自交的后代記為農(nóng)田生態(tài)型F1代；礦山生態(tài)型少花龍葵自交的后代記為礦山生態(tài)型F1代。

2018 年7 月，分別將少花龍葵正交F1代、反交F1代、農(nóng)田生態(tài)型F1代和礦山生態(tài)型F1代的種子播種于穴盤中催芽，待少花龍葵幼苗高約5 cm、2 片真葉完全展開(kāi)時(shí)，分別選擇長(zhǎng)勢(shì)一致的幼苗移栽至準(zhǔn)備好的含硒塑料盆中，每盆種植少花龍葵4 株，每個(gè)處理重復(fù)3 次。不定期澆水，保持土壤田間持水量的60%。整個(gè)生長(zhǎng)過(guò)程中不定期交換盆與盆的位置以減弱邊際效應(yīng)的影響，及時(shí)去除雜草并防治病蟲(chóng)害，待少花龍葵果實(shí)成熟后收獲材料，測(cè)定相關(guān)指標(biāo)。

1.3 樣品收集與測(cè)定分析

2018 年8 月，收集少花龍葵從上往下第3～4片功能葉，采用1∶1 乙醇丙酮浸泡法測(cè)定葉綠素a、葉綠素b 以及類胡蘿卜素含量，采用氮藍(lán)四唑法測(cè)定超氧化物歧化酶(SOD)活性，采用愈創(chuàng)木酚法測(cè)定過(guò)氧化物酶(POD)活性，采用高錳酸鉀滴定法測(cè)定過(guò)氧化氫酶(CAT)活性，采用考馬斯亮藍(lán)染色法測(cè)定可溶性蛋白含量[21]。之后整株收獲少花龍葵并拆分成根、莖、葉，用自來(lái)水洗凈后再用去離子水沖洗3 次，于110 ℃殺青15 min，80 ℃條件下烘干至恒質(zhì)量，用電子天平稱量、粉碎、過(guò)0.15 mm 篩。稱取0.50 g 烘干樣品，經(jīng)硝酸—高氯酸溶液消煮至透明后定容，采用氫化物原子熒光光譜法分別測(cè)定少花龍葵根、莖、葉的硒含量[22]。

1.4 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)采用DPS 進(jìn)行方差分析(Duncan 新復(fù)極差法進(jìn)行多重比較)，并用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示；采用以下公式進(jìn)行計(jì)算：

轉(zhuǎn)運(yùn)系數(shù)=植物地上部分硒含量/根系硒含量；

轉(zhuǎn)運(yùn)量系數(shù)=植物地上部分硒積累量/根系硒積累量；

硒積累量=植物硒含量×植物生物量。

2 結(jié)果與分析

2.1 正反雜交對(duì)少花龍葵F1 代生物量的影響

由表1 可知：在外源硒處理下，少花龍葵的根冠比及各部位生物量從大到小的順序均為：正交F1代＞反交F1代＞農(nóng)田生態(tài)型F1代＞礦山生態(tài)型F1代。少花龍葵正反雜交F1代根、莖及地上部分的生物量均顯著高于2 種生態(tài)型少花龍葵(P＜0.05)。少花龍葵正交F1代根、莖、葉及地上部分的生物量在所有處理中最大，分別較礦山生態(tài)型F1代少花龍葵顯著提高了29.84%、37.99%、11.97%和24.96% (P＜0.05)。另外，少花龍葵正反雜交F1代的根冠比均高于親本，說(shuō)明雜交對(duì)少花龍葵F1代根系發(fā)育的促進(jìn)作用更顯著。

2.2 正反雜交對(duì)少花龍葵F1 代葉片光合色素含量的影響

由表2 可知：在外源硒處理下，少花龍葵葉片的葉綠素a、葉綠素b 以及類胡蘿卜素含量從大到小的順序均為：礦山生態(tài)型F1代＞正交F1代＞農(nóng)田生態(tài)型F1代＞反交F1代。礦山生態(tài)型F1代葉片的葉綠素a、類胡蘿卜素以及葉綠素總量分別較少花龍葵反交F1代顯著提高了11.19%、16.19%和10.48% (P＜0.05)。各處理少花龍葵葉片的葉綠素b 含量無(wú)顯著差異(P＞0.05)。少花龍葵的葉綠素a/b 從大到小的順序?yàn)椋赫籉1代＞礦山生態(tài)型F1代＞農(nóng)田生態(tài)型F1代＞反交F1代，表明不同雜交組合對(duì)少花龍葵后代耐陽(yáng)性的影響存在差異。

2.3 正反雜交對(duì)少花龍葵F1 代抗氧化酶活性及可溶性蛋白含量的影響

由表3 可知：在外源硒處理下，少花龍葵葉片的SOD、POD 和CAT 活性以及可溶性蛋白含量從大到小的順序均為：正交F1代＞反交F1代＞農(nóng)田生態(tài)型F1代＞礦山生態(tài)型F1代。其中，農(nóng)田生態(tài)型F1代少花龍葵的SOD 及CAT 活性均顯著高于礦山生態(tài)型F1代少花龍葵(P＜0.05)。與礦山生態(tài)型F1代少花龍葵相比，少花龍葵正交F1代的SOD、POD 和CAT 活性以及可溶性蛋白含量分別顯著提高了24.95%、53.09%、35.49%和44.07% (P＜0.05)。

2.4 正反雜交對(duì)少花龍葵F1 代硒含量的影響

由表4 可知：各處理下少花龍葵根系的硒含量無(wú)顯著差異(P＞0.05)。少花龍葵莖、葉及地上部分的硒含量從大到小的順序均為：正交F1代＞反交F1代＞礦山生態(tài)型F1代＞農(nóng)田生態(tài)型F1代。與農(nóng)田生態(tài)型F1代少花龍葵相比，少花龍葵正交F1代莖、葉以及地上部分的硒含量分別顯著提高了24.37%、31.61% 和24.86% (P＜0.05)。另外，少花龍葵的轉(zhuǎn)運(yùn)系數(shù)從大到小的順序?yàn)椋赫籉1代＞反交F1代＞礦山生態(tài)型F1代＞農(nóng)田生態(tài)型F1代，表明少花龍葵正反雜交F1代將硒從根系轉(zhuǎn)運(yùn)到地上部分的能力均強(qiáng)于2 種生態(tài)型少花龍葵的F1代。

表1 正反雜交對(duì)少花龍葵F1 代單株生物量和根冠比的影響Tab.1 Effects of positive and negative hybridization on the biomass per plant in F1 generation and root/shoot ratio of S.photeinocarpum

表2 正反雜交對(duì)少花龍葵F1 代光合色素含量的影響Tab.2 Effects of positive and negative hybridization on the photosynthetic pigment contents in F1 generation of S.photeinocarpum

2.5 正反雜交對(duì)少花龍葵F1 代硒積累量的影響

由表5 可知：少花龍葵莖、葉以及地上部分的硒積累量從大到小的順序均為：正交F1代＞反交F1代＞礦山生態(tài)型F1代＞農(nóng)田生態(tài)型F1代，根系的硒積累量從大到小的順序?yàn)椋赫籉1代＞反交F1代＞農(nóng)田生態(tài)型F1代＞礦山生態(tài)型F1代。少花龍葵正反雜交F1代各部位的硒積累量均顯著高于2 種生態(tài)型少花龍葵的F1代(P＜0.05)。與農(nóng)田生態(tài)型F1代少花龍葵相比，少花龍葵正交F1代莖、葉以及地上部分的硒積累量顯著提高了60.28%、37.75% 和45.76% (P＜0.05)。少花龍葵正交F1代的轉(zhuǎn)運(yùn)量系數(shù)達(dá)到最大值，而農(nóng)田生態(tài)型F1代少花龍葵的轉(zhuǎn)運(yùn)量系數(shù)最低。

表3 正反雜交對(duì)少花龍葵F1 代抗氧化酶活性及可溶性蛋白含量的影響Tab.3 Effects of positive and negative hybridization on the antioxidant enzyme activity and soluble protein content in F1 generation of S.photeinocarpum

表4 正反雜交對(duì)少花龍葵F1 代硒含量和轉(zhuǎn)運(yùn)系數(shù)的影響Tab.4 Effects of positive and negative hybridization on the selenium content in F1 generation and translocation factor of S.photeinocarpum

表5 正反雜交對(duì)少花龍葵F1 代單株硒積累量和轉(zhuǎn)運(yùn)量系數(shù)的影響Tab.5 Effects of positive and negative hybridization on the selenium accumulation in F1 generation per plant and translocation amount factor of S.photeinocarpum

3 討論

雜交能夠積累親本中控制同一性狀的不同微效基因，可使雜交種在產(chǎn)量、品質(zhì)以及抗逆性方面表現(xiàn)出較強(qiáng)的雜種優(yōu)勢(shì)，培育出生長(zhǎng)更旺、代謝更快和抗性更強(qiáng)的雜交后代[23-24]。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)少花龍葵正反雜交F1代根和地上部分的生物量均顯著高于其親本，在生物量上具有顯著的雜交優(yōu)勢(shì)，與前人的結(jié)果[18]相似。光合作用是植物碳同化及干物質(zhì)積累的基礎(chǔ)，而光合色素是限制高等植物光合作用的關(guān)鍵因素[25]。余顯權(quán)等[26]指出雜交水稻的葉綠素含量與其產(chǎn)量呈正相關(guān)關(guān)系，暗示了光合色素含量是影響植物雜交后代生長(zhǎng)的因素之一。本試驗(yàn)結(jié)果表明：2 種生態(tài)型少花龍葵的F1代與其正交F1代的光合色素含量均無(wú)顯著差異，而少花龍葵反交F1代的葉綠素總量和類胡蘿卜素含量都低于其他處理，與前人的研究結(jié)果[27]不同，可能與植株的遺傳背景存在差異有關(guān)。

雖然適宜濃度的外源硒可以增強(qiáng)植株的抗逆性[27]，但長(zhǎng)期暴露在高硒環(huán)境下的植株不僅會(huì)產(chǎn)生明顯的脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)[28]，其滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的形成也會(huì)受到抑制[29]。因此，抗氧化系統(tǒng)和滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)既是植物抵御高硒環(huán)境的基礎(chǔ)，也是影響植物生長(zhǎng)和硒積累的重要因素。孟杰等[30]發(fā)現(xiàn)：耐低鋅基因型水稻和鋅敏感基因型水稻的雜交后代對(duì)低鋅環(huán)境表現(xiàn)出更強(qiáng)的抗逆性，與其親本相比，雜交水稻的SOD 活性降幅更小，POD、CAT 及APX 活性顯著提高。丁在松等[31]的研究也表明：雜交可以通過(guò)提高旱稻后代的抗氧化酶活性來(lái)改善植株對(duì)滲透脅迫的抗逆性。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：2 種生態(tài)型少花龍葵的正反雜交F1代在抗逆性狀中均表現(xiàn)出了超親優(yōu)勢(shì)。另外，農(nóng)田生態(tài)型F1代和正交F1代少花龍葵的抗氧化酶活性和可溶性蛋白含量分別高于礦山生態(tài)型F1代及反交F1代。這表明與礦山生態(tài)型少花龍葵相比，農(nóng)田生態(tài)型少花龍葵對(duì)硒的抗逆性更強(qiáng)，并且以其作為母本雜交對(duì)少花龍葵F1代抗逆性的促進(jìn)作用更好，這可能是因?yàn)榧?xì)胞質(zhì)遺傳效應(yīng)在雜交過(guò)程中發(fā)揮了一定作用，使其表現(xiàn)出一定的母系遺傳傾向。農(nóng)田生態(tài)型和礦山生態(tài)型F1代少花龍葵的各部分硒含量均無(wú)顯著差異，而正反雜交F1代地上部分的硒含量及轉(zhuǎn)運(yùn)系數(shù)均高于親本。這表明雜交有利于少花龍葵F1代對(duì)土壤中硒的吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)，其相關(guān)機(jī)制有待進(jìn)一步深入研究。硒的積累量不僅可以真實(shí)反映植物對(duì)土壤中硒的富集能力，也是評(píng)價(jià)富硒農(nóng)產(chǎn)品的重要參數(shù)。本試驗(yàn)結(jié)果表明：少花龍葵正反雜交F1代根、莖、葉的硒積累量均顯著高于親本，其中少花龍葵正交F1代地上部分的單株硒積累量最大，達(dá)到46.06 μg。說(shuō)明以2 種生態(tài)型少花龍葵為親本雜交對(duì)其F1代的富硒能力具有明顯的雜交優(yōu)勢(shì)，且以農(nóng)田生態(tài)型少花龍葵為母本的雜交組合對(duì)其F1代富硒能力的提升效果更好。

4 結(jié)論

在硒含量為10 mg/kg 的土壤中，以農(nóng)田生態(tài)型和礦山生態(tài)型少花龍葵為親本雜交使其正反雜交F1代在生長(zhǎng)、抗逆性以及硒積累方面均表現(xiàn)出了超親優(yōu)勢(shì)。少花龍葵正交F1代的生物量、光合色素含量、抗氧化酶活性、可溶性蛋白含量和硒含量均不同程度高于少花龍葵反交F1代，表明以農(nóng)田生態(tài)型少花龍葵為母本、礦山生態(tài)型少花龍葵為父本的雜交組合對(duì)其F1代的生長(zhǎng)及富硒能力具有更強(qiáng)的提升作用，可為高富硒少花龍葵的選育工作提供理論依據(jù)。