趙宗耀，王 堯，逄洪波，金 明，陳 強(qiáng)，李玥瑩，楊慶文，鄭曉明

(1.沈陽師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，遼寧 沈陽 110034；2.沈陽師范大學(xué) 實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心，遼寧 沈陽 110034；3.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 作物科學(xué)研究所，北京 100081)

水稻(Oryza sativaL.)是重要的糧食作物，全世界有一半以上的人口以水稻為主食[1]，其產(chǎn)量對(duì)世界糧食安全有著舉足輕重的影響。水稻是一種喜溫植物，其祖先種為主要生長在熱帶的普通野生稻(O.rufipgonGriff.)[2-3]。近幾十年來，隨著氣候?qū)ψ匀画h(huán)境的影響及農(nóng)業(yè)發(fā)展?fàn)顩r的改變，水稻種植地向北部溫帶乃至寒帶擴(kuò)張是其產(chǎn)量和品質(zhì)的保障需求。在水稻不同發(fā)育階段，低溫均會(huì)對(duì)其發(fā)育過程產(chǎn)生影響，如芽期低溫影響水稻的發(fā)芽率[4]，苗期使葉片發(fā)黃、卷曲變形直至植株死亡[5]，開花期使花粉敗育[6]以及孕穗期使其結(jié)實(shí)率降低[7]等。低溫使水稻大幅度減產(chǎn)乃至絕收，是限制水稻生產(chǎn)分布的直接因素[8-9]，故研究水稻低溫耐受性(耐寒性)的分子機(jī)制具有非常重要的理論意義和實(shí)用價(jià)值[10-12]。

篩選耐寒品種是解決水稻低溫傷害最簡單、直接和有效的科學(xué)方法之一。在豐富的水稻種質(zhì)資源庫中，蘊(yùn)藏著許多耐寒性強(qiáng)的優(yōu)良品種，它們也是分子育種優(yōu)異等位基因的來源[13]。熊建華等[14]利用自然低溫條件對(duì)中國云南和日本的30 個(gè)水稻品種的耐寒性進(jìn)行了鑒定，共篩選出18 個(gè)不同熟期的耐寒性品種；王蘭等[15]從84 個(gè)水稻核心種質(zhì)中初步篩選了13 個(gè)苗期耐寒材料，其中粳87-304 屬于一級(jí)耐寒品種；周新橋等[16]以廣東種質(zhì)資源庫和南方稻區(qū)的150 個(gè)品種為研究對(duì)象，最終篩選出了3 個(gè)苗期耐寒性品種；丁國華等[17]于2017 年黑龍江省發(fā)生的“倒春寒”時(shí)期，在大田試驗(yàn)條件下從888 個(gè)材料中篩選鑒定出130 個(gè)苗期極耐冷水稻材料。在這些研究中，有些是針對(duì)某一地區(qū)的地方品種和育成品種，有些只研究水稻的某一個(gè)亞種，缺乏對(duì)整個(gè)物種和分布區(qū)水稻品種耐寒性的整體了解。

本研究以14 個(gè)亞洲國家的187 個(gè)水稻核心種質(zhì)資源作為試驗(yàn)材料，以秧苗黃葉率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，對(duì)這些水稻品種的苗期耐寒性進(jìn)行鑒定，篩選不同遺傳背景下耐寒性較強(qiáng)的水稻品種，為抗寒種質(zhì)資源的鑒定以及遺傳改良提供參考，同時(shí)也為進(jìn)一步的全基因組關(guān)聯(lián)分析(GWAS)的試驗(yàn)條件打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

本研究收集包括中國24 個(gè)省市區(qū)及其他13 個(gè)亞洲國家的187 個(gè)水稻核心種質(zhì)資源為材料，其中秈稻125 個(gè)，粳稻62 個(gè)(表1)，覆蓋中國、南亞和東南亞等水稻品種。種子均為當(dāng)年采集。試驗(yàn)開始前將種子放入培養(yǎng)箱50 ℃烘干72 h，打破種子休眠。

表1 試驗(yàn)材料詳細(xì)信息Tab.1 Detail information for the materials

表1(續(xù))

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 材料種植

每個(gè)水稻品種選取30 粒種子，要求種子顆粒飽滿、未遭到機(jī)械損傷、霉變和蟲害等，以保證良好的發(fā)芽率。種植前對(duì)營養(yǎng)土進(jìn)行高壓滅菌，以減少水稻幼苗感染霉菌的概率。營養(yǎng)土和蛭石以8∶1 (V∶V) 混合，保證土的透氣性。30 粒種子均分為2 份，1 份為處理組，另1 份為對(duì)照組。播種之前將土裝入花盆中浸水12 h，用鑷子小心將種子放到花盆表面，密度適中，蓋約1 cm 厚的土，插上標(biāo)牌，做好記錄。將育苗盆放入組培室中進(jìn)行培養(yǎng)(溫度30 ℃，12 h 光照/12 h黑暗)。

1.2.2 低溫處理

參考前人關(guān)于水稻幼苗期耐寒處理的研究[10-11,18]，本試驗(yàn)選取水稻黃葉率作為苗期耐寒指標(biāo)，以三葉期幼苗(自播種起之后的第14 天)作為試驗(yàn)材料，進(jìn)行低溫4 ℃脅迫。根據(jù)水稻的亞種分類和地理位置等信息將其分成4 組，各處理組處理時(shí)間分別是24、36、48 和60 h，以確保每組水稻品種的平行性。試驗(yàn)重復(fù)3 次。計(jì)算黃葉率：黃葉率=黃葉數(shù)/總?cè)~數(shù)×100%，植株全部死亡的黃葉率記為100%。

1.2.3 耐寒性評(píng)價(jià)及等級(jí)分布圖繪制

在低溫處理后再經(jīng)過7 d 緩苗期，對(duì)水稻幼苗進(jìn)行耐寒性評(píng)價(jià)[10,18]。根據(jù)處理組與對(duì)照組相比的黃葉率將水稻分為5 個(gè)等級(jí)：黃葉率＜5%，0 級(jí)；5%≤黃葉率＜25%，1 級(jí)；25%≤黃葉率＜50%，3 級(jí)；50%≤黃葉率＜75%，5 級(jí)；黃葉率≥75%，7 級(jí)。統(tǒng)計(jì)各處理組每個(gè)耐寒等級(jí)的品種數(shù)量，利用Excel 2013 繪制每個(gè)處理組各耐寒等級(jí)分布圖。

1.2.4 水稻苗期表型豐富度的計(jì)算

在水稻群體水平上對(duì)苗期耐寒表型進(jìn)行GWAS 關(guān)聯(lián)分析時(shí)，表型豐富度與關(guān)聯(lián)分析結(jié)果準(zhǔn)確性成正相關(guān)[19]，故本研究進(jìn)行表型豐富度的測定。表型豐富度借用生態(tài)學(xué)中物種豐富度的概念，將每個(gè)處理組作為1 個(gè)群體，以耐寒等級(jí)的數(shù)量(S)、全部品種的個(gè)體數(shù)(N)及每個(gè)耐寒等級(jí)中的個(gè)體數(shù)(Ni)來綜合表示多樣性。本研究采用遺傳學(xué)中的表型豐富度Hill 多樣性指標(biāo)[20]進(jìn)行計(jì)算：，可以準(zhǔn)確得出表型豐富度最高的處理組，進(jìn)而為下一步的GWAS 分析打下基礎(chǔ)。

1.2.5 亞種間耐寒性差別分析

統(tǒng)計(jì)各處理組粳、秈2 個(gè)亞種的黃葉率及其品種數(shù)量，分別使用R 語言和Excel 2013 進(jìn)行箱線圖和柱狀圖的繪制，分析亞種間耐寒性的差異。

1.2.6 耐寒性品種的地理分布

水稻是具有一定群體遺傳結(jié)構(gòu)和地理分布的作物，其遺傳距離和地理距離正相關(guān)[21-22]。本試驗(yàn)根據(jù)種植區(qū)域?qū)颖具M(jìn)行分組。在同一區(qū)域內(nèi)，各品種對(duì)當(dāng)?shù)厣鷳B(tài)環(huán)境的適應(yīng)性較類似，故對(duì)這些品種進(jìn)行了不同時(shí)長的處理，以便得到更多的耐寒信息。同時(shí)，為了推測水稻品種耐寒性與地理位置的相關(guān)性，利用R 語言繪制了全部水稻品種耐寒性的地理分布圖。由于各品種是在不同處理時(shí)間梯度進(jìn)行的耐寒等級(jí)鑒定，故通過處理時(shí)長系數(shù)(60 h 與其他3 組處理時(shí)間的比值)對(duì)其他3 組中每個(gè)品種的黃葉率進(jìn)行重新估算(即：原黃葉率×系數(shù))，進(jìn)而統(tǒng)一所有品種的耐寒等級(jí)。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

每個(gè)品種的黃葉率均重復(fù)測定3 次，取其平均值進(jìn)行耐寒等級(jí)鑒定和各指標(biāo)的計(jì)算。圖形的繪制采用Excel 2013 和R 語言進(jìn)行，并用Adobe Illustrator CS6 軟件對(duì)矢量圖進(jìn)行編輯。

2 結(jié)果與分析

2.1 低溫處理后各耐寒等級(jí)的形態(tài)學(xué)變化

全部水稻品種在低溫脅迫后均出現(xiàn)株高變矮現(xiàn)象，說明其生長發(fā)育受阻，但各個(gè)品種受到的抑制程度均不相同。由圖1 可知：0 級(jí)強(qiáng)耐寒品種經(jīng)低溫脅迫后，處理組與對(duì)照組相比株型明顯變矮，但葉片上僅表現(xiàn)為少量葉尖發(fā)黃；1 級(jí)較耐寒和3 級(jí)中耐寒品種除了表現(xiàn)為株高變矮外，葉片也出現(xiàn)了不同程度的卷曲、變脆及發(fā)黃現(xiàn)象，且這2 個(gè)級(jí)別品種的黃葉率與0 級(jí)相比差異較大，1 級(jí)較耐寒品種的黃葉率最高達(dá)到了25%，而3 級(jí)中耐寒品種的黃葉率更為嚴(yán)重，在≥25%～50% 之間；5 級(jí)中敏感和7 級(jí)敏感品種中，植株不僅出現(xiàn)嚴(yán)重的葉片黃化問題，一些植株還出現(xiàn)不同程度的死亡，乃至所有植株全部死亡。

圖1 4 ℃處理不同時(shí)間后水稻品種的形態(tài)變化Fig.1 Performance of rice cultivars under different treatment time in 4 ℃

2.2 水稻品種低溫處理后各處理組的耐寒等級(jí)分布及表型豐富度

由圖2 可知：隨著低溫處理時(shí)間的延長，死亡的水稻品種逐漸增多。由24 h 處理組的14 個(gè)品種逐漸增至36 h 處理組的18 個(gè)品種(占觀測品種數(shù)的35%)，48 h 處理組有28 個(gè)品種死亡(占觀測品種數(shù)的65%)，而60 h 處理組死亡品種高達(dá)40 個(gè)(占觀測品種數(shù)的85%)。每個(gè)低溫處理組內(nèi)部的耐寒等級(jí)所占的百分比也各不相同。24 h 組內(nèi)0～7 級(jí)耐寒品種所占的比例分別是9%、20%、21%、20% 和30%，而36 h 組中各耐寒等級(jí)由強(qiáng)到弱的百分比則為18%、21%、16%、10% 和35%。隨著處理時(shí)間的增加，48和60 h 處理組中品種的耐寒等級(jí)分布發(fā)生了明顯變化，表現(xiàn)為0、1 和3 級(jí)的耐寒品種逐漸減少；7 級(jí)低溫敏感品種顯著增多，占所有觀測樣品數(shù)的比例均超過50%。4 個(gè)低溫處理時(shí)長的表型多樣性指標(biāo)分別是4.77、4.56、2.25 和1.37，說明隨著低溫處理時(shí)間的延長，品種間的表型豐富度逐漸降低。

圖2 187 個(gè)水稻品種在不同處理時(shí)間的耐寒等級(jí)情況Fig.2 The cold tolerance level distribution of 187 rice cultivars in different treatment time

2.3 秈稻和粳稻2 個(gè)亞種的耐寒性差異

由圖3a 可知：在不同的處理時(shí)間內(nèi)，均是秈稻的黃葉率明顯高于粳稻，且隨著處理時(shí)長的增加，秈稻的黃葉率逐漸升高，黃葉率中位線從24 h 的67.5%增加到60 h 的100%。粳稻的耐寒性較強(qiáng)，黃葉率的中位線由24 h 的30%、36 h的7.5% 和48 h 的10% 增加至60 h 的70%。由圖3b 可知：0 級(jí)強(qiáng)耐寒品種總計(jì)有21 個(gè)，僅有2 個(gè)為秈稻，其余均為粳稻，耐寒品種中粳稻百分比達(dá)到了91%；1 級(jí)較耐寒品種有24 個(gè)，而秈稻只有7 個(gè)，其余均為粳稻，耐寒品種中粳稻百分比達(dá)到了71%。

圖3 粳稻和秈稻的耐寒性差異Fig.3 The difference of cold tolerance between O.sativa ssp.japonica and O.sativa ssp.indica

2.4 品種耐寒性與地理分布的關(guān)系

研究進(jìn)一步篩選出11 個(gè)耐寒品種，分別是印度尼西亞秈稻品種Sepah (126345)、韓國粳稻品種eo 和Chalbyeo (15020 和125698)、馬來西亞粳稻品種Ers468396 和Puthi (125877 和126231)、日本粳稻品種Kotobuki Mochi (117518)、不丹粳稻品種Dagpa Mras (127043)以及中國河北省粳稻品種水原300 粒(02-00294)、云南省粳稻品種毫巴永1 (21-01853)、浙江省粳稻品種Wutounuo 和秀水115 (204 和ZD-01559)。

由圖4 可知：11 個(gè)0 級(jí)耐寒品種中僅有1 個(gè)是秈稻，屬于48 h 處理組的印度尼西亞品種。10 個(gè)粳稻品種分別來自5 個(gè)國家，中國最多有4 個(gè)，韓國和馬來西亞各2 個(gè)，日本和不丹各1 個(gè)。中國的4 個(gè)品種中，2 個(gè)品種分布于浙江省，云南省和河北省各1 個(gè)。經(jīng)黃葉率校正后的1 級(jí)較耐寒品種總計(jì)21 個(gè)，主要分布于中國的東北部以及韓國、日本一帶，在中國西南邊陲(如云南省和貴州省)以及菲律賓、尼泊爾等國也有零星分布。

圖4 187 個(gè)品種綜合耐寒等級(jí)的地理分布示意圖Fig.4 Geographic distribution of 187 cultivars of complex cold tolerance

3 討論

水稻是冷敏感作物，中國每年因低溫造成的水稻減產(chǎn)高達(dá)500 萬t，占水稻總產(chǎn)量的2.5%[11]。因此，開展水稻種質(zhì)資源耐寒性的精準(zhǔn)鑒定和評(píng)價(jià)是培育耐寒水稻品種的重要前提。

水稻秧苗素質(zhì)對(duì)物質(zhì)轉(zhuǎn)化和分配有重要影響，苗期耐寒性強(qiáng)弱直接決定水稻產(chǎn)量。研究人員已經(jīng)對(duì)水稻苗期耐寒鑒定評(píng)價(jià)開展了大量工作[13-18]，主要分為田間和實(shí)驗(yàn)室兩大類。田間具有大批量鑒定的優(yōu)勢(shì)，但同時(shí)受氣候和環(huán)境變化的直接影響，具有不穩(wěn)定性和難重復(fù)等弊端；實(shí)驗(yàn)室內(nèi)人工氣候培養(yǎng)箱可以精確調(diào)控低溫脅迫的溫度和時(shí)間，具有實(shí)驗(yàn)條件穩(wěn)定和可重復(fù)性好等優(yōu)勢(shì)。水稻耐寒性屬于多基因位點(diǎn)決定的數(shù)量性狀，受環(huán)境因素等多方面影響[4-6]，故本研究采用室內(nèi)人工氣候培養(yǎng)箱方法作為水稻苗期低溫鑒定條件。為了更接近于水稻在實(shí)際生產(chǎn)中的種植方式，本研究均采用8 cm×8 cm×10 cm 型號(hào)的黑色塑料花盆盆栽，營養(yǎng)土與蛭石以8∶1 的體積比混勻，土質(zhì)統(tǒng)一。

低溫影響水稻生長發(fā)育，引發(fā)一系列生理生化變化，光合、電導(dǎo)率、活性氧和丙二醛、可溶性糖含量、冷脅迫誘導(dǎo)相關(guān)氨基酸及抗氧化酶等相關(guān)生理生化指標(biāo)均可以作為水稻苗期耐寒鑒定指標(biāo)[23-24]，但耗時(shí)費(fèi)力，對(duì)于大規(guī)模鑒定群體種質(zhì)資源耐寒性具有一定的局限性。而形態(tài)學(xué)指標(biāo)簡單易行。諸多學(xué)者對(duì)以自然低溫或者氣候培養(yǎng)箱低溫處理不同時(shí)間后的黃葉率作為衡量水稻苗期耐寒等級(jí)的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)[15,18]，證實(shí)黃葉率是研究水稻苗期耐寒的可靠指標(biāo)。因此，本研究以水稻苗期黃葉率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，在4 ℃條件下對(duì)187 個(gè)水稻品種進(jìn)行24～60 h 低溫脅迫，摸索最適合的低溫處理時(shí)間。結(jié)果顯示：隨著低溫處理時(shí)間的延長，植株的營養(yǎng)生長受損逐漸加重，死亡的品種數(shù)大幅升高，到60 h 后，除了極耐寒品種外，絕大部分水稻品種已經(jīng)接近全部死亡。全基因組關(guān)聯(lián)分析(GWAS)是基于連鎖不平衡原理，通過分子標(biāo)記和性狀表型進(jìn)行相關(guān)性分析，以鑒定與目標(biāo)性狀緊密相連的位點(diǎn)或者候選基因，目前已廣泛應(yīng)用于作物的農(nóng)藝性狀的遺傳解析中[21,25]。本研究中，24 和36 h 處理組中形態(tài)性狀的多樣性是其他處理組的2 倍以上，說明此條件更適于進(jìn)一步的GWAS 分析。

亞洲栽培稻分為秈稻和粳稻。秈稻主要種植于熱帶和亞熱帶低緯度地區(qū)，而粳稻在長期的人工馴化及適應(yīng)性進(jìn)化過程中具備了耐寒特性，種植在高緯度和高海拔等溫度較低的環(huán)境[26]。研究表明：水稻最初向寒冷地區(qū)擴(kuò)張可能與某些耐冷基因有關(guān)，促進(jìn)了其對(duì)低溫的適應(yīng)性[10-12,27]。MA等[10]發(fā)現(xiàn)：COLD1第四外顯子的變異在粳稻馴化過程的向北擴(kuò)張中起重要作用，生長在溫帶的粳稻在馴化過程中，人工選擇保留了CTB4a基因的野生稻單倍型；進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)：親本啟動(dòng)子變異是引起耐冷性差異的根本原因，單倍型分析發(fā)現(xiàn)耐冷單倍型Tej-Hap-KMXBG 是溫帶粳稻在低溫環(huán)境馴化產(chǎn)生的。LIU 等[27-28]利用641 個(gè)水稻和野生稻群體確定bZIP73的表達(dá)量升高能提高水稻幼苗和生育期的耐寒能力，且該基因的等位變異和秈稻與粳稻的分化相關(guān)。MAO 等[12]的研究顯示：基因HAN1的啟動(dòng)子中獲得了1 個(gè)MYB順式作用元件，增強(qiáng)了溫帶粳稻的抗寒性，使其能夠適應(yīng)溫帶氣候。本研究表明：耐寒性較好的品種主要分布于中國的東北部及日本，而低溫敏感材料則分布于印度、菲律賓、越南和泰國等東南亞國家及中國的長江以南地區(qū)，也說明水稻品種的耐寒性與其地理分布密切相關(guān)。溫帶地區(qū)水稻品種的耐寒性較強(qiáng)，而熱帶、亞熱帶地區(qū)的品種耐寒性較差，可能與其適應(yīng)當(dāng)?shù)氐臍夂驐l件和種植策略有關(guān)。各處理組篩選的21 個(gè)0 級(jí)強(qiáng)耐寒品種中，只有2 個(gè)是秈稻品種；同時(shí)7 級(jí)低溫敏感品種中，高達(dá)88%是秈稻，均說明粳稻比秈稻具有更好的耐寒性，這也與以往的研究結(jié)果[11-12]相一致。本研究中篩選出的2 個(gè)強(qiáng)耐寒秈稻品種分別是云南地方傳統(tǒng)品種雞血糯21-03781 和印度尼西亞品種126345。云南省是獨(dú)特的高原氣候，為了增加水稻產(chǎn)量，常會(huì)選擇種植苗期耐寒性較強(qiáng)的早秈稻，說明水稻的耐寒性不僅與其所處的地理位置有關(guān)，也與當(dāng)?shù)氐姆N植策略密切相關(guān)。而印度尼西亞雖然地跨赤道，但是屬于海洋間多個(gè)島嶼組成的群島國家，也存在高山高海拔地區(qū)，而伴隨著海拔的逐步升高，氣溫逐漸下降，故不同品種的耐寒性差異雖然與其遺傳背景相關(guān)，但是其所處的具體地理位置也對(duì)品種耐寒性有著一定程度的影響。因此，本研究中鑒定的1 級(jí)耐寒的秈稻和低緯度地區(qū)的品種也可作為耐寒品種，可為秈稻和低緯度地區(qū)的水稻育種提供資源和信息。

4 結(jié)論

本研究以14 個(gè)亞洲國家的187 個(gè)水稻品種資源作為研究對(duì)象，黃葉率作為鑒定指標(biāo)，鑒定了其苗期耐寒等級(jí)，篩選到11 個(gè)強(qiáng)耐寒的水稻品種，包括10 個(gè)粳稻品種和1 個(gè)秈稻品種，得出了粳稻的耐寒性普遍強(qiáng)于秈稻的結(jié)論。同時(shí)，也發(fā)現(xiàn)品種的耐寒性除了取決于自身的遺傳信息外，還與其具體的地理分布及當(dāng)?shù)氐姆N植策略等密切相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)：4 ℃低溫處理下可用于全基因組關(guān)聯(lián)分析的最適條件為24 h 或36 h。研究結(jié)果對(duì)于水稻耐寒種質(zhì)資源的評(píng)價(jià)及分子育種均具有重要的理論和現(xiàn)實(shí)意義。