曹 玲, 劉沁雨, 鄭豪杰, 張 鯤, 孫 健, 尹曉輝*,, 林榮華

(1. 浙江農(nóng)林大學(xué) 現(xiàn)代農(nóng)學(xué)院，杭州 311300；2. 麗水職業(yè)技術(shù)學(xué)院，浙江 麗水 323000；3. 無規(guī)定馬屬動物疫病區(qū)管理中心，杭州 311500；4. 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)藥檢定所，北京 100125)

0 引言

農(nóng)藥是重要的農(nóng)業(yè)生產(chǎn)要素，合理施用農(nóng)藥能有效控制病蟲草害的發(fā)生，保障糧食和農(nóng)產(chǎn)品產(chǎn)量穩(wěn)定。我國是農(nóng)藥生產(chǎn)和使用大國，2000年至2014年，我國農(nóng)藥的總使用量連續(xù)增加，由73.16萬噸增長至374.4萬噸[1]。盡管從2015年之后，農(nóng)藥的總使用量有所下降，但長期以來，農(nóng)藥的大量使用給生態(tài)環(huán)境和人體健康帶來了一定的潛在危害。研究表明，即使在推薦劑量下使用，一些農(nóng)藥依然對環(huán)境非靶標(biāo)生物存在急性毒性效應(yīng)風(fēng)險[2]，同時還影響著環(huán)境非靶標(biāo)生物的生殖、行為、生理和發(fā)育等[3-5]。此外，大量農(nóng)藥殘留在生物體內(nèi)，長期蓄積會引發(fā)慢性中毒，并通過食物鏈等途徑危害到人類健康[6]，如降低機(jī)體免疫力、誘發(fā)慢性疾病、導(dǎo)致“三致 (致畸、致癌、致突變)” 作用、影響神經(jīng)發(fā)育和干擾內(nèi)分泌系統(tǒng)等[7-8]。

兩棲動物因其特殊的棲息習(xí)性，是濕地和陸地生物群落的重要組成部分，其在水生生態(tài)系統(tǒng)和陸地生態(tài)系統(tǒng)中均扮演著重要的角色，也是生態(tài)圈的重要食物鏈節(jié)點(diǎn)。但隨著人類過度開發(fā)自然資源、大量使用化學(xué)品以及氣候變化等諸多因素，導(dǎo)致兩棲動物的棲息地遭到破壞，其生物多樣性迅速下降，種群規(guī)模嚴(yán)重衰退[9-10]。世界自然保護(hù)聯(lián)盟 (International Union for Conservation of Nature，IUCN) 于2020年頒布的《瀕危物種紅色名錄》指出，約有41%的兩棲動物種群瀕臨滅絕[11]。而我國生態(tài)環(huán)境部和中國科學(xué)院聯(lián)合發(fā)布的《中國生物多樣性紅色名錄——脊椎動物卷》(2015年) 的評估結(jié)果顯示：我國所有的408種兩棲動物中，已經(jīng)滅絕2種，受威脅物種數(shù)為176種，占兩棲動物總數(shù)的43.1%。在我國脊椎動物類群中，兩棲動物受威脅程度最高，遠(yuǎn)高于全球兩棲動物受威脅的平均水平[12]。

作為最易瀕臨滅絕的脊椎動物，大多數(shù)兩棲動物是受保護(hù)的物種，需要被納入特定的環(huán)境風(fēng)險評估 (environmental risk assessment，ERA) 計劃[13]。相關(guān)研究表明，許多農(nóng)藥對兩棲動物均具有致死、致畸、干擾內(nèi)分泌、遺傳毒性以及影響生殖和行為等直接毒性效應(yīng)[14-17]，同時研究者還觀察到了農(nóng)藥的間接毒性效應(yīng)，包括對兩棲動物在食物鏈中上下級生物的影響[18-19]，改變?nèi)肭治锓N和本土兩棲動物之間的競爭關(guān)系[20]等。農(nóng)藥對兩棲動物的個體生存和種群繁衍存在威脅，進(jìn)而影響其所在生態(tài)系統(tǒng)的功能。因此，進(jìn)一步開展農(nóng)藥對兩棲動物的生態(tài)風(fēng)險評估研究，探索科學(xué)有效的農(nóng)藥管控措施，對降低兩棲動物的生態(tài)風(fēng)險具有重要意義。

本文基于近幾年有關(guān)農(nóng)藥對兩棲動物生態(tài)風(fēng)險評估的試驗研究和監(jiān)測調(diào)查進(jìn)展情況，擬對兩棲動物生態(tài)風(fēng)險評估中的問題闡述、暴露評估、效應(yīng)評估以及風(fēng)險表征4個階段的內(nèi)容進(jìn)行概述，旨在為我國農(nóng)藥的合理應(yīng)用、有效管理和對兩棲動物的種群保護(hù)提供科學(xué)依據(jù)。

1 農(nóng)藥生態(tài)風(fēng)險評估概述

1.1 農(nóng)藥生態(tài)風(fēng)險評估現(xiàn)狀

生態(tài)風(fēng)險評估 (ecological risk assessment) 是隨著環(huán)境管理目標(biāo)和環(huán)境觀念的轉(zhuǎn)變而逐漸興起并得到發(fā)展的一個相對較新的研究領(lǐng)域，而農(nóng)藥生態(tài)風(fēng)險評估作為生態(tài)風(fēng)險評估的一部分，其方法是在20世紀(jì)90年代才逐漸系統(tǒng)化和標(biāo)準(zhǔn)化的[21]。1991年，歐盟農(nóng)藥管理指令 (council directive 91/414/EEC) 中明確了農(nóng)藥風(fēng)險評估的要求；1995年，美國環(huán)保局 (United States Environmental Protection Agency，USEPA) 發(fā)布了風(fēng)險表征政策，標(biāo)志著歐美的農(nóng)藥管理體系中正式引入了風(fēng)險評估的概念；2005年，日本環(huán)境保護(hù)署建立了新的農(nóng)藥登記程序，其中水生生態(tài)風(fēng)險評估采用了與美國及歐盟相似的程序[22]。由此，農(nóng)藥風(fēng)險評估被廣泛應(yīng)用于發(fā)達(dá)國家的農(nóng)藥登記和再評價管理中。

我國在相關(guān)行業(yè)層面開展的生態(tài)風(fēng)險評估工作起步較晚。2001年，殷浩文教授主編的《生態(tài)風(fēng)險評價》是我國第一部有關(guān)生態(tài)風(fēng)險評估的專著[23]。2009年，國家水利部發(fā)布了《生態(tài)風(fēng)險評價導(dǎo)則》(SL/Z 463—2009)，并以之作為行業(yè)指導(dǎo)性技術(shù)文件；2011年，生態(tài)環(huán)境部 (原環(huán)境保護(hù)部) 頒布了《化學(xué)物質(zhì)風(fēng)險評估導(dǎo)則》，規(guī)定了化學(xué)物質(zhì)生態(tài)風(fēng)險評估的原則、內(nèi)容、程序、方法和技術(shù)要求等。2016年，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部頒布了《農(nóng)藥環(huán)境風(fēng)險評估指南》(NY/T 2882.2―2016)，明確了我國農(nóng)藥管理對水生生態(tài)系統(tǒng)的保護(hù)目標(biāo)：維護(hù)水生生態(tài)系統(tǒng)中淡水資源的可持續(xù)性，即農(nóng)藥的使用不應(yīng)對水生生態(tài)系統(tǒng)中的初級生產(chǎn)者、無脊椎動物種群和脊椎動物存在短期或長期的影響。同樣，農(nóng)藥的大量使用對陸地生態(tài)系統(tǒng)中的非靶標(biāo)生物也會產(chǎn)生生態(tài)毒性，農(nóng)藥風(fēng)險評估已成為陸地生態(tài)風(fēng)險評估中最重要的問題之一[24]。2017年，國務(wù)院修訂出臺《農(nóng)藥管理條例》及配套規(guī)章，明確了新農(nóng)藥登記需開展環(huán)境生態(tài)風(fēng)險評估，標(biāo)志著我國農(nóng)藥風(fēng)險管理邁上了新的臺階。

1.2 農(nóng)藥生態(tài)風(fēng)險評估基本框架

美國和歐盟的生態(tài)風(fēng)險評估框架制定較早，尤其美國制定的生態(tài)風(fēng)險評估框架是迄今為止影響及應(yīng)用最為廣泛的評估模式[25]，目前大多數(shù)發(fā)展中國家所采用的生態(tài)風(fēng)險評估框架都是在該框架基礎(chǔ)上結(jié)合本國特點(diǎn)修改制定的。我國的農(nóng)藥生態(tài)風(fēng)險評估體系主要包括問題闡述、暴露評估、效應(yīng)評估及風(fēng)險表征4個環(huán)節(jié) (圖1)[26]。在暴露評估和效應(yīng)評估階段采用分級的策略，即先采用較為簡單和保守的危害和暴露參數(shù)進(jìn)行初級風(fēng)險評估 (first tier risk assessment)，如果在該保守情況下的風(fēng)險可接受，則無需進(jìn)一步開展復(fù)雜和昂貴的試驗和模型計算；當(dāng)初級風(fēng)險評估結(jié)果顯示風(fēng)險不能接受時，則需要對效應(yīng)評估和暴露評估進(jìn)行精細(xì)化 (refinement) 處理，或稱之為高級風(fēng)險評估 (high tier risk assessment)[26]。風(fēng)險評估結(jié)果最終由具體進(jìn)行評估的部門反饋給管理部門，由風(fēng)險管理者制定相應(yīng)的降低風(fēng)險的措施。

2 確定保護(hù)目標(biāo)/問題闡述

在問題闡述階段，歐洲委員會 (EC) 第1107/2009號法規(guī)明確了以非靶標(biāo)生物、生物多樣性和生態(tài)系統(tǒng)為保護(hù)目標(biāo)[27]。生態(tài)實(shí)體是生態(tài)系統(tǒng)發(fā)揮生態(tài)服務(wù)功能的驅(qū)動因子，根據(jù)保護(hù)目標(biāo)的不同可分為 “個體”、“種群” 和 “生態(tài)系統(tǒng)” 等實(shí)體級別，旨在明確每一個特定的保護(hù)目標(biāo)[28]。在進(jìn)行暴露評估和效應(yīng)評估時，每一個生態(tài)實(shí)體必須選擇至少一個指標(biāo)作為評估終點(diǎn)。

2.1 以 “個體” 為生態(tài)實(shí)體

當(dāng)選擇 “個體” 作為生態(tài)實(shí)體時，則可把生存率、生長率和繁殖率等作為終點(diǎn)指標(biāo)。通過生態(tài)毒理學(xué)試驗和構(gòu)建物種模型來實(shí)現(xiàn)對目標(biāo)兩棲動物的保護(hù)。Ockleford等[29]建議，把鳳頭蠑螈Triturus cristatus、歐洲本土蟾蜍Epidalea calamita和常見的樹蛙Hyla arborea作為兩棲動物中重要的生態(tài)風(fēng)險評估物種。在我國，澤蛙Rana limnocharis、中華蟾蜍Bufo gargarizans、黑斑蛙Pelophylax nigromaculatus和東北林蛙Rana chensinensis等是最常見且數(shù)量較多的種類，其中中華蟾蜍是我國本土分布較廣泛的蟾蜍種類之一，且由于其作為中藥材入藥，相關(guān)生活史背景資料較全面，也有足夠多的不同類群分布，因此是目前國內(nèi)研究者們重點(diǎn)關(guān)注的生態(tài)毒理學(xué)研究對象，可作為我國兩棲動物生態(tài)風(fēng)險評估研究的重要物種。此外，黑眶蟾蜍Duttaphrynus/Bufo melanostictus作為亞洲蟾蜍的高暴露種群，也是頗受研究者們關(guān)注的兩棲動物生態(tài)毒理學(xué)研究的重要模型物種之一。

2.2 以 “種群” 為生態(tài)實(shí)體

如果以“種群”作為生態(tài)實(shí)體，則可選擇種群密度、多樣性分布、生物量、年齡結(jié)構(gòu)與分布等作為終點(diǎn)指標(biāo)。種群的持久性與物種的豐度和生物量有關(guān)，為了正確預(yù)測農(nóng)藥對物種豐度的影響，Topping等[30]對節(jié)肢動物 (NTA) 進(jìn)行種群動態(tài)監(jiān)測和系統(tǒng)建模，這是傳統(tǒng)的高級風(fēng)險評估方法。2015年，我國環(huán)境保護(hù)部發(fā)布了《生物多樣性監(jiān)測技術(shù)導(dǎo)則——兩棲動物》(HJ 710.6—2014)，可利用柵欄陷阱法、人工覆蓋法和標(biāo)記重捕法等方法監(jiān)測兩棲動物的種類、個體數(shù)、性別及疾病狀況等，以了解兩棲動物多樣性的現(xiàn)狀和變化趨勢[31]。但這些監(jiān)測數(shù)據(jù)目前尚未能形成生態(tài)風(fēng)險評估層面上的種群行為和建模技術(shù)指導(dǎo)規(guī)程。Grimm等[32]從生態(tài)學(xué)角度，采用模式導(dǎo)向建模方法 (POM)，將種群和生態(tài)系統(tǒng)動力學(xué)與個體適應(yīng)性行為聯(lián)系起來，開發(fā)和構(gòu)建了相關(guān)模型，該方法已用于洪泛區(qū)野外林蛙Rana arvalis的種群動態(tài)研究[33]和休斯頓蟾蜍B. houstonensis[34]的行為模型研究。

2.3 以 “生態(tài)系統(tǒng)” 為生態(tài)實(shí)體

若選擇“生態(tài)系統(tǒng)”作為生態(tài)實(shí)體，則可選擇物種組成、繁殖力或生物多樣性等重要終點(diǎn)指標(biāo)，采用微宇宙 (microcosm) 試驗、中宇宙(mesocosm) 試驗和野外試驗等[35]模擬系統(tǒng)進(jìn)行生態(tài)風(fēng)險評估。其中，荷蘭瓦赫寧根大學(xué)采用室外微宇宙，系統(tǒng)研究了毒死蜱 (chlorpyrifos)、多菌靈 (carbendazim)、莠去津 (atrazine) 等多種農(nóng)藥對水生生態(tài)系統(tǒng)的影響[36]；Pereira等[37]則側(cè)重關(guān)注了在不同氣候條件下獲得的微宇宙數(shù)據(jù)外推和相互驗證的可能性。Relyea等[38]利用中宇宙體系，研究了化學(xué)污染物對兩棲動物的影響，重點(diǎn)研究了在農(nóng)藥和天敵共同脅迫下兩棲動物的行為和生存率變化。

3 農(nóng)藥對兩棲動物的暴露評估

暴露評估是生態(tài)風(fēng)險評估的重要組成部分。根據(jù)非靶標(biāo)生物和特定保護(hù)目標(biāo) (SPG)，監(jiān)測得到離暴露區(qū)域不同距離處的環(huán)境預(yù)測濃度值 (predicted environmental concentration，PEC)，并通過PEC值的計算，定義出風(fēng)險區(qū)域和無風(fēng)險區(qū)域，然后針對風(fēng)險區(qū)域進(jìn)行生態(tài)風(fēng)險評估[39]。兩棲動物在水生生態(tài)系統(tǒng)和陸地生態(tài)系統(tǒng)中均存在接觸到環(huán)境中農(nóng)藥的風(fēng)險，故其暴露評估應(yīng)同時涉及到這兩類生態(tài)系統(tǒng)。

3.1 暴露途徑

3.1.1 水生環(huán)境暴露 在水生生態(tài)環(huán)境中，農(nóng)藥進(jìn)入池塘的主要方式是噴霧沉降、徑流或排水。在變態(tài)前期，兩棲動物蝌蚪的外鰓暴露于水環(huán)境中，由于外鰓具有增加氣體交換表面積的作用，因此會導(dǎo)致對水中外源化學(xué)物質(zhì)吸收率的增加[40]。另外，蝌蚪還會通過取食水中染毒的藻類、浮游生物及沉積物中的腐生物等方式在體內(nèi)累積農(nóng)藥。除了水體中的農(nóng)藥殘留，沉積物也會累積農(nóng)藥殘留。美國地質(zhì)調(diào)查局 (United States Geological Survey，USGS) 曾在2009年和2010年收集加利福尼亞州 (California) 的11個地點(diǎn)和科羅拉多州(Colorado)、喬治亞州 (Georgia)、愛達(dá)荷州 (Idaho)、路易斯安那州 (Louisiana)、緬因州 (Maine) 和俄勒岡州 (Oregon) 共18個地點(diǎn)的水和沉積物樣本進(jìn)行檢測，在42個沉積物樣本中共檢測到了22種農(nóng)藥有效成分，其中檢出率較高的農(nóng)藥為咯菌腈(fludioxonil，在17個樣本中有檢出)、聯(lián)苯菊酯(bifenthrin，14個樣本中有檢出) 和戊唑醇 (tebuconazole，10個樣本中有檢出)[41]。應(yīng)夢嬌等[42]研究發(fā)現(xiàn)，稻田底泥對農(nóng)藥等污染物有吸附作用，暴露于底泥提取液和水樣中48 h的熱帶爪蟾胚胎均有不同程度的畸形發(fā)生。因此，經(jīng)口攝入沉積物中的殘留農(nóng)藥可能是蝌蚪暴露的一個重要途徑，而成蛙皮膚具有較高的滲透性，其農(nóng)藥暴露的主要途徑是與池塘水和沉積物的皮膚接觸，同時也有經(jīng)口攝入的可能。

美國先后頒布了兩個用于評估沉積物對兩棲動物蝌蚪毒性效應(yīng)的指南[43]：1) 蝌蚪的沉積物亞慢性毒性試驗OPPTS 850.1800 (USEPA 1996) 是關(guān)于牛蛙Rana catesbianaShaw蝌蚪在沉積物中暴露30 d的研究；2) 兩棲動物的沉積物毒性試驗E2591-07 (ASTM 2013) 描述了美洲蟾蜍Bufo americanus在沉積物中暴露10 d的過程；兩個指南都考慮到了蝌蚪經(jīng)口攝入和經(jīng)皮接觸沉積物存在的風(fēng)險。Snodgrass等[44]在實(shí)驗室條件下，將耐受物種美洲蟾蜍和不耐受物種林蛙Rana sylvatica暴露在微宇宙池塘沉積物中，發(fā)現(xiàn)沉積物中積累的金屬和氯化物等有毒物質(zhì)可導(dǎo)致不耐受物種數(shù)量下降。我國目前關(guān)于兩棲動物沉積物暴露測試方面的研究較少，僅有少量研究關(guān)注了生活在沉積物中的河蜆、蝦和魚，證明其具有富集農(nóng)藥滴滴涕 (DDTs) 和三氯殺螨醇的作用，而有關(guān)沉積物中農(nóng)藥環(huán)境殘留和測定的研究較多，如很多研究者檢測過長江、珠江和黃河中下游等地區(qū)沉積物中的有機(jī)氯類農(nóng)藥殘留[45-46]。

3.1.2 陸地環(huán)境暴露 在陸地生態(tài)環(huán)境中，農(nóng)藥主要施用在土壤和植物莖葉表面，兩棲動物較容易接觸到這些表面的殘留農(nóng)藥，同樣，經(jīng)皮接觸和經(jīng)口攝入也是其主要的暴露途徑，此外還有眼部暴露等。Br?hl等[47]通過陸生脊椎動物微宇宙試驗，發(fā)現(xiàn)暴露在草甘膦 (glyphosate)、異丙隆(isoproturon)、代森錳鋅 (mancozeb)、含硫殺菌劑和噻蟲啉 (thiacloprid) 等農(nóng)藥下的兩棲動物，在陸生階段面臨著極大的風(fēng)險，上述農(nóng)藥在超出推薦劑量和施用頻率時，1 h后幼蛙最高致死率可達(dá)100%，7 d后的致死率在40%～60%之間，表明幼蛙皮膚對農(nóng)藥暴露具有很高的敏感性。此外，該研究還表明，相同有效成分的不同制劑對幼蛙的致死率差異也很大，致死率從20%～100%不等。綜上所述，在水生暴露或陸地暴露下，不同生命階段的兩棲動物對農(nóng)藥的敏感性差異非常大，尤其是形態(tài)學(xué)和生理學(xué)方面，其農(nóng)藥暴露和影響特征具有顯著差異[29,40,48](表1)。與水生階段相比，目前有關(guān)陸地階段幼蛙和成蛙的毒理學(xué)敏感性研究數(shù)據(jù)還需進(jìn)一步完善。

表1 兩棲動物不同生命階段的農(nóng)藥暴露和影響Table 1 Pesticide exposure and impact in different life stages of amphibians

有研究表明，暴露于草甘膦中的兩棲動物在不同生命階段其敏感性存在一定差異。Jones等[49]采用中宇宙模擬試驗，研究了草甘膦在不同用量、不同施用時期和施用頻率下的影響，發(fā)現(xiàn)在該試驗的早期階段，木蛙R. sylvatica和美洲蟾蜍蝌蚪的死亡率顯著高于試驗后期，該結(jié)果表明，隨著時間的推移，蝌蚪對除草劑的敏感性減弱。Zsanett等[50]采用草甘膦對大蟾蜍B. bufo蝌蚪進(jìn)行暴露試驗，發(fā)現(xiàn)幼齡蝌蚪比高齡蝌蚪表現(xiàn)出更高的敏感性。而現(xiàn)有農(nóng)藥法規(guī)中的風(fēng)險評估程序并不能完全覆蓋兩棲動物的全生命周期，因此，通過農(nóng)藥暴露試驗確定蝌蚪早期生命階段的適宜施藥期非常重要，早期生命階段受到的農(nóng)藥干擾少，農(nóng)藥對兩棲動物全生命周期的影響就會減弱，安全性就越高。

3.2 暴露模型

在農(nóng)藥風(fēng)險評估暴露模型研究過程中，各國研究者相繼開發(fā)出了各具特色的風(fēng)險評估模型，其中尤以美國環(huán)保局和歐盟建立的模型最具代表性。

3.2.1 水生環(huán)境農(nóng)藥暴露模型 水生生態(tài)環(huán)境農(nóng)藥暴露模型包括地下水模型和地表水模型兩類，其中針對地下水模型的研究較多。1997年至2011年間，美國主要應(yīng)用地下水估算模型 (screening concentration in ground water，SCI-GROW) 來估算飲用水中農(nóng)藥的濃度，這是當(dāng)時進(jìn)行人體健康風(fēng)險評估的關(guān)鍵因子之一。自2012年以來，美國環(huán)保局確定了農(nóng)藥根區(qū)地下水模型 (pesticide root zone model-ground water，PRZM-GW)，并開始采用分級的方法 (初級和第二級層次的模型) 來測定地下水中農(nóng)藥的濃度。

歐盟先后開發(fā)了多個農(nóng)藥暴露評估模型，如區(qū)域農(nóng)藥釋放/農(nóng)藥遷移評估模型 (pesticide emission assessment at regional and local scales，PEARL)、農(nóng)藥根區(qū)地下水模型 (pesticide root zone modelground water，PRZM-GW)、農(nóng)藥淋溶模型(pesticide leaching model，PELMO) 等[51-52]。這些模型根據(jù)農(nóng)藥的理化性質(zhì)、環(huán)境行為、使用特征以及氣象、水文、土壤和作物種植情況等信息進(jìn)行模擬，為農(nóng)藥的污染預(yù)測預(yù)防提供了強(qiáng)有力的技術(shù)支持。

2010年，我國農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)藥檢定所與荷蘭瓦赫寧根大學(xué)及相關(guān)科研機(jī)構(gòu)合作，以我國典型農(nóng)業(yè)場景信息為背景，開發(fā)了我國自己的地下水暴露評估模型 (China-PEARL)[53]。該模型可以模擬葉面噴霧、土壤表面噴霧、土壤處理及土壤注射等不同的農(nóng)藥施藥方式，對于植物葉面噴霧，該模型還可模擬農(nóng)藥在作物表面的揮發(fā)、滲透、光轉(zhuǎn)化以及雨水沖刷等過程，目前已廣泛應(yīng)用于我國水生生態(tài)風(fēng)險評估中。

此外，有關(guān)地表水模型的研究也受到了大家的關(guān)注。如歐盟的農(nóng)藥根區(qū)地表水模型 (pesticide root zone model-surface water，PRZM-SW)、地表水中有毒物質(zhì)模擬程序 (toxic substances in surface water，TOXSWA)、地表水場景輔助程序 (surface water scenarios help，SWASH) 等。其中，歐盟農(nóng)藥工作組采用水生環(huán)境暴露模型 (forum for the coordination of pesticide fate models and their use，F(xiàn)OCUS) 計算地表水中農(nóng)藥的預(yù)測濃度。西班牙爬行動物學(xué)會[54]將本國兩棲動物棲息池塘的場景與歐盟FOCUS模型的地表水體 (池塘、溝渠和溪流) 場景進(jìn)行比較，通過評估池塘附近環(huán)境中是否存在農(nóng)業(yè)用地，進(jìn)而評估兩棲動物在其水生生態(tài)環(huán)境中的暴露水平。他們分析了兩棲動物分布的151個池塘的相關(guān)數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)有近70個池塘在距離農(nóng)場100 m范圍內(nèi)，其中13個池塘全部被農(nóng)田包圍，表明西班牙兩棲動物生活的池塘中農(nóng)藥暴露風(fēng)險較高，兩棲動物容易受到殘留農(nóng)藥的威脅。同時，目前有關(guān)稻田施用農(nóng)藥后地表水暴露評估模型的研究也較多，主要包括美國開發(fā)的稻田地表水暴露評估模型 (rice water quality，RICEWQ)、Tier I Rice Model和PFAM模型，歐盟開發(fā)的MED-RICE和SWAGW模型，日本開發(fā)的Aquatic PEC、PADDY系列和PCPF系列模型，以及我國開發(fā)的TOP-RICE模型和農(nóng)藥風(fēng)險評估暴露模擬外殼 (pesticide risk assessment exposure simulation shell，PRAESS)[55]，這些模型為完善稻田-地表水暴露評估場景體系，降低稻田中農(nóng)藥對非靶標(biāo)生物的影響提供了重要的支持。

3.2.2 陸地環(huán)境農(nóng)藥暴露模型 兩棲動物在陸地環(huán)境中主要是通過經(jīng)口攝入和經(jīng)皮暴露接觸農(nóng)藥，因此，合理評估食品中及皮膚接觸農(nóng)藥過程中的殘留量，對于確定農(nóng)藥對兩棲動物的風(fēng)險非常必要。

美國環(huán)保局開發(fā)了陸地生物監(jiān)測模型 (terrestrial investigation model，TIM)，用于估算鳥類通過皮膚暴露接觸農(nóng)藥后的死亡率，通過合理調(diào)整參數(shù)后，該模型即可用于兩棲動物在陸地生態(tài)環(huán)境中的農(nóng)藥暴露評估。美國環(huán)保局還開發(fā)了陸地生物殘留物暴露模型 (terrestrial residue exposure，TRex)，用于估算施用殺蟲劑后鳥類部分代表性食物中的農(nóng)藥濃度，通過估算不同體型類別鳥類的飲食攝入水平，從而獲得不同的農(nóng)藥暴露水平[56]。此外，由美國T-Rex模型改進(jìn)而得的陸地爬行類殘留物暴露模型 (terrestrial herpetofaunal exposure residue program，T-Herps)，可根據(jù)農(nóng)藥的施用面積、施用頻率、施藥間隔，以及食物中農(nóng)藥的半衰期和殘留量等指標(biāo)來計算陸生動物食物中的農(nóng)藥殘留水平[57]。

在將以上模型應(yīng)用于兩棲動物的陸地生態(tài)環(huán)境暴露風(fēng)險評估時，均需要相應(yīng)調(diào)整特定的參數(shù)，如接觸量和皮膚吸收系數(shù)等，并且采用這些原本針對鳥類和哺乳動物風(fēng)險評估開發(fā)的模型來評價兩棲動物的農(nóng)藥暴露風(fēng)險時，仍存在很多不確定因素，因此還需要進(jìn)一步研究開發(fā)相應(yīng)的暴露評估模型，以完善兩棲動物在陸生生態(tài)系統(tǒng)階段的暴露風(fēng)險評估體系。

4 農(nóng)藥對兩棲動物的效應(yīng)評估

效應(yīng)評估 (effect assessment) 是進(jìn)行生態(tài)風(fēng)險評估的定量依據(jù)，其目的是建立污染物與生物 (或生態(tài)) 之間的劑量-效應(yīng)關(guān)系，主要依靠生態(tài)毒理學(xué)試驗以及通過模型外推的方式，獲得污染物對生物的毒性效應(yīng)終點(diǎn)，由此確定污染物對生物的閾值效應(yīng)濃度水平 (threshold effect level，TEL)。目前研究較多的方法是標(biāo)準(zhǔn)化測試法，主要包括：1) 兩棲動物蝌蚪的生長和發(fā)育試驗 (the larval amphibian growth and developmental assay，LAGDA)；2) 兩棲動物變態(tài)試驗 (the amphibian metamorphosis assay，AMA)；3) 兩棲動物胚胎致畸試驗-爪蟾(the frog embryo teratogenesis assay-xenopus，F(xiàn)ETAX)。其中，LAGDA是應(yīng)用最廣泛的試驗，可檢測農(nóng)藥對模式物種非洲爪蟾的變態(tài)發(fā)育和性腺發(fā)育毒性[58]。AMA是一種內(nèi)分泌干擾物篩選試驗，旨在識別可能干擾下丘腦-垂體-甲狀腺 (hypothalamus pituitary thyroid，HPT) 軸正常功能的物質(zhì)[59]。FETAX主要用于篩查急性胚胎毒性，包括死亡率、畸形率和生長抑制率等終點(diǎn)指標(biāo)，而其中對胚胎生長的抑制率是FETAX試驗中最敏感的終點(diǎn)，F(xiàn)ETAX試驗可為生態(tài)風(fēng)險評估中的危害評估提供發(fā)育毒性數(shù)據(jù)[60-61]。

然而，上述測試都是在水生環(huán)境中進(jìn)行的，并不適用于陸生階段的評估，也未涵蓋兩棲動物的繁殖能力測試及其完整生命周期測試。比較魚類和兩棲類的標(biāo)準(zhǔn)化測試結(jié)果，發(fā)現(xiàn)雨蛙屬(Hyla) 和木蛙屬 (Lithobates) 的蛙類對被測化合物最敏感；暴露于有毒的有機(jī)化合物中，35%的兩棲動物比虹鱒魚更敏感；暴露于金屬化合物中，52%的兩棲動物表現(xiàn)更為敏感；比較一系列統(tǒng)計指標(biāo)可發(fā)現(xiàn)，兩棲動物對所有測試化學(xué)品的整體敏感度為49%[43]。最新報道顯示，魚類全生命周期的標(biāo)準(zhǔn)化測試結(jié)果與兩棲動物的這些標(biāo)準(zhǔn)化測試結(jié)果相似[62]，其中大部分農(nóng)藥對魚類和水生環(huán)境中兩棲動物的毒性相當(dāng)，但農(nóng)藥對兩棲動物的特殊生理學(xué)作用 (如變態(tài)和生殖影響) 無法用魚類的測試結(jié)果替代，因為兩棲動物對其中45種農(nóng)藥的敏感性是魚類的100倍。因此，進(jìn)一步開展兩棲動物與其他生物物種 (兩棲類與魚類、兩棲類與爬行類) 的對比研究，將有助于研究兩棲動物的完整生命周期。

4.1 一般毒性效應(yīng)評估

農(nóng)藥對個體生物的毒性效應(yīng)是目前生態(tài)風(fēng)險評估主要的考慮因素，相關(guān)研究已比較成熟 (表2)。農(nóng)藥對兩棲動物的毒性作用可分為急性毒性、慢性毒性和介于兩者之間的亞急/亞慢性毒性。其中，急性毒性終點(diǎn) (例如LC50值、EC50值等) 是最常用的評價指標(biāo)，而對于具有特定作用終點(diǎn)的農(nóng)藥如內(nèi)分泌干擾類農(nóng)藥，其毒性作用方式、劑量以及生物本身的新陳代謝能力等都可能影響其毒性效應(yīng)，因此其毒性效應(yīng)終點(diǎn)的選擇也更加復(fù)雜，需要進(jìn)一步闡述。

表2 近年有關(guān)農(nóng)藥對兩棲動物劑量-毒性效應(yīng)關(guān)系的研究Table 2 The dose-effect relationship between some pesticides and amphibians reported in recent years

目前針對兩棲動物的毒性效應(yīng)評估，研究最多的毒性效應(yīng)終點(diǎn)主要是死亡率和致畸率，而選

擇這兩個指標(biāo)的原因是因為兩棲動物的生命活動、行為方式和畸形形態(tài)等與農(nóng)藥的作用具有直接相關(guān)性且易于觀察。雖然形態(tài)發(fā)育的變化的確有助于農(nóng)藥的毒性判定，但是仍需進(jìn)一步研究其毒性作用機(jī)制，補(bǔ)充完善如組織病理學(xué)分析、自動生物特征評估、微觀結(jié)構(gòu)和亞微觀結(jié)構(gòu)分析等研究方法，發(fā)展更多有效的毒性效應(yīng)終點(diǎn)，以得到更準(zhǔn)確、全面的生物特征信息。

續(xù)表2Table 2 (Continued)

4.2 內(nèi)分泌毒性效應(yīng)評估

許多農(nóng)藥都能夠影響兩棲動物內(nèi)分泌系統(tǒng)的正常功能[79]，通過模擬激素行為或與激素競爭受體而干擾內(nèi)分泌系統(tǒng)。而激素水平變化、激素轉(zhuǎn)運(yùn)方式改變等均會導(dǎo)致生物的功能受到影響[80]。

有關(guān)兩棲動物性激素干擾研究常用的毒性效應(yīng)終點(diǎn)是性別比例的改變 (包括完全或部分性別逆轉(zhuǎn))。研究發(fā)現(xiàn)，雄性兩棲動物的趨雌化是由于受到了抗雄激素農(nóng)藥的影響，而幾種廣泛使用的殺蟲劑 (如咪唑類農(nóng)藥) 在體外均具有抗雄激素活性作用[81]。Slaby等[82]發(fā)現(xiàn)，莠去津可導(dǎo)致林蛙精子數(shù)量減少，林丹 (lindane)、馬拉硫磷 (malathion)和對硫磷 (parathion) 等農(nóng)藥會影響受精卵的生理生化指標(biāo)，而乙烯菌核利 (vinclozolin) 可降低兩棲動物的交配能力。賽林霖[83]研究發(fā)現(xiàn)，除草劑西瑪津 (simazine) 可導(dǎo)致中華大蟾蜍卵巢組織的卵細(xì)胞溶解、壞死，形成空泡，使得生殖細(xì)胞減少；導(dǎo)致睪丸組織中出現(xiàn)睪丸卵母細(xì)胞；并且暴露組中出現(xiàn)了發(fā)育顯著遲緩無法辨認(rèn)性別的性腺。

甲狀腺功能的正常運(yùn)行對于無尾兩棲類完成變態(tài)發(fā)育至關(guān)重要。Dang[84]綜述了57個具有甲狀腺激素功能的活性物質(zhì)和非活性物質(zhì)，其中12個甲狀腺活性物質(zhì)[包括農(nóng)藥百菌清 (chlorothalonil)、滅線磷 (ethoprophos)、蚊蠅醚 (pyripropoxyfen) 等]可影響蛙類的體重、體長、后肢肢體發(fā)育和發(fā)育階段，并對蛙的下丘腦-垂體-甲狀腺軸具有潛在的干擾作用；45個非甲狀腺活性物質(zhì)可影響蛙類體重、體長和后肢肢體發(fā)育，對發(fā)育階段影響小，且沒有干擾HPT軸的作用，其中39個非活性物質(zhì) [包括農(nóng)藥2,4-D、聯(lián)苯菊酯(bifenthrin)、毒死蜱、氟氯氰菊酯 (cyfluthrin)、樂果 (dimethoate)、克百威 (carbofuran)、百菌清(chlorothalonil) 和甲草胺 (alachlor) 等] 能夠分別促進(jìn)或抑制蝌蚪后肢和吻泄距 (長) 的發(fā)育；僅4個農(nóng)藥可使甲狀腺發(fā)生病變，分別為西瑪津、戊唑醇、聯(lián)苯菊酯和滅蟲威 (mesurol)。

5 農(nóng)藥對兩棲動物的風(fēng)險表征

風(fēng)險表征 (risk characterization) 是指在確定的暴露條件下，有關(guān)化學(xué)污染物對一種生物個體、種群或系統(tǒng)造成有害效應(yīng)的綜合判斷和表達(dá)，是生態(tài)風(fēng)險評估的最后階段。其中定性風(fēng)險表征主要給出化學(xué)污染物對環(huán)境及其中的生物屬于高風(fēng)險、中風(fēng)險和低風(fēng)險的評估結(jié)論；而定量風(fēng)險表征則是通過相關(guān)數(shù)據(jù)的量化分析，描述及推斷風(fēng)險的可能性和后果，其評價結(jié)果更加準(zhǔn)確且具有重現(xiàn)性。

目前，風(fēng)險商值法 (RQ) 是使用最普遍、最廣泛的定量風(fēng)險表征方法。首先采用預(yù)測環(huán)境濃度(PEC) 或測定環(huán)境濃度 (measured environmental concentration，MEC) 進(jìn)行暴露評估，然后再采用生態(tài)毒性的劑量-效應(yīng)關(guān)系推導(dǎo)所得預(yù)測無影響濃度 (predicted no effect concentration，PNEC) 進(jìn)行效應(yīng)評估，最后以 RQ 值進(jìn)行風(fēng)險表征[85]。RQ值為PEC或MEC與PNEC的比值，若RQ大于1表明風(fēng)險較高，反之則風(fēng)險較低。周怡彤等[86]采用風(fēng)險商值法對我國太湖流域西北部地表水中殘留農(nóng)藥的生態(tài)風(fēng)險進(jìn)行了評估，發(fā)現(xiàn)豐水期地表水中農(nóng)藥對水生生物的威脅大于枯水期，其中有機(jī)磷類殺蟲劑和苯并咪唑類殺菌劑殘留對水生生物具有高風(fēng)險。歐洲食品安全局 (European Food Safety Authority，EFSA) 則提出了生態(tài)閾值選項(ecological threshold option，ETO) 和生態(tài)恢復(fù)選項(ecological recovery option，ERO) 指標(biāo)，采用水生生態(tài)基準(zhǔn)允許的水中農(nóng)藥含量水平——又稱法規(guī)可接受濃度 (regulatory acceptable concentrations，RACS) 來表征其風(fēng)險。如Bernabo等[64]采用 RACS濃度的嘧菌胺 (mepanioyrim) 進(jìn)行試驗，觀察到了其存在危害意大利樹蛙Hyla intermedia生存和延遲蝌蚪變態(tài)發(fā)育的風(fēng)險?？傊瑢︼L(fēng)險表征方法的研究將有助于將暴露評估和效應(yīng)評估更好地結(jié)合，從而合理表征農(nóng)藥對兩棲動物的風(fēng)險。

6 展望

本文重點(diǎn)介紹了美國和歐盟有關(guān)生態(tài)環(huán)境中農(nóng)藥對兩棲動物的暴露評估、效應(yīng)評估及風(fēng)險表征方面的研究進(jìn)展，相關(guān)研究成果促進(jìn)了生態(tài)風(fēng)險評估框架和方法體系向科學(xué)化發(fā)展?？傮w而言，美國和歐盟的兩棲動物生態(tài)風(fēng)險評估方法體系相對較為完善，在暴露模型研發(fā)及毒性效應(yīng)測試等方面更加科學(xué)化，評價工具更加模型化，評估方法為定性和定量相結(jié)合，并且已進(jìn)入大尺度空間的區(qū)域生態(tài)風(fēng)險評估新階段。目前我國也已經(jīng)建立起相應(yīng)的兩棲動物農(nóng)藥暴露風(fēng)險評估體系，有了一定的理論及技術(shù)基礎(chǔ)，但是與美國和歐盟的評估方法體系相比， 我國的兩棲動物生態(tài)風(fēng)險評估還處于初級階段，慢性評估的第一手?jǐn)?shù)據(jù)資料較為匱乏，定量模型開發(fā)還有待加強(qiáng)，評估方法體系仍不夠完善，因此，我國應(yīng)盡快制定相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)和補(bǔ)充風(fēng)險評估數(shù)據(jù)資料，積極完善相關(guān)方法體系，以適應(yīng)生態(tài)風(fēng)險評估的未來發(fā)展趨勢。

展望我國的兩棲動物農(nóng)藥暴露風(fēng)險評估未來發(fā)展，筆者認(rèn)為有以下幾方面需要加強(qiáng)：兩棲動物的生態(tài)風(fēng)險評估體系，有了一定的理論及技術(shù)基礎(chǔ)，但是與美國和歐盟的兩棲動物農(nóng)藥風(fēng)險評估方法體系相比，我國的兩棲動物生態(tài)風(fēng)險評估還處于初級階段，慢性評估的第一手?jǐn)?shù)據(jù)資料匱乏，評估方法尚不完善，定量模型還有待開發(fā)，評估體系仍不夠完善。因此，未來我國兩棲動物生態(tài)風(fēng)險評估應(yīng)積極完善評估體系，以滿足生態(tài)風(fēng)險評估的發(fā)展趨勢，因此亟待制定相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)和補(bǔ)充風(fēng)險評估數(shù)據(jù)資料。展望我國的兩棲動物農(nóng)藥風(fēng)險評估未來發(fā)展，筆者認(rèn)為有以下幾方面需要加強(qiáng)：

1) 在兩棲動物保護(hù)目標(biāo)的物種模型選擇上，常用本土物種澤蛙、黑斑蛙和東北林蛙等現(xiàn)有的背景數(shù)據(jù)有限，需要進(jìn)一步篩選敏感物種，建立種群評估模型。2) 在暴露評估階段，首先需要對不同物種進(jìn)行深入的對比研究，如兩棲類和魚類、爬行類的比較，將有助于解決兩棲動物全生命周期測試缺失的問題；其次在農(nóng)藥地表水風(fēng)險評估中，需要不斷豐富模型評估手段，研究開發(fā)有針對性的、與我國生產(chǎn)實(shí)際相適應(yīng)的地表水模型。3) 在效應(yīng)評估階段，目前描述毒理學(xué)試驗測試方法及研究結(jié)果的較多，但有關(guān)模型外推的研究卻較少。當(dāng)前最普遍的兩種外推法分別是評估因子法 (assessment factor，AF) 和物種敏感度分布法 (species sensitive distribution，SSD)，然而從實(shí)驗室到現(xiàn)實(shí)場景的外推仍然比較困難，還需加強(qiáng)暴露設(shè)計、試驗因素控制及暴露終點(diǎn)指標(biāo)確定等相關(guān)研究，以盡可能接近真實(shí)的生態(tài)環(huán)境。此外，對于高層次的效應(yīng)評估還需進(jìn)一步研究，目前關(guān)于初級風(fēng)險評估的研究較多，涉及較高層次風(fēng)險評估的研究相對較少。4) 在風(fēng)險表征方面，量化農(nóng)藥的生態(tài)危害是非常重要的表征手段，但是目前有關(guān)定量分析方法的研究還較少，因此需要探索更多定量的分析方法，用于表征暴露和效應(yīng)評估的結(jié)果。

生態(tài)風(fēng)險評估在區(qū)域和景觀生態(tài)中發(fā)揮著越來越重要的作用，同時也必定會向更高層次發(fā)展。國內(nèi)未來的研究應(yīng)積極跟蹤和掌握世界范圍內(nèi)不斷更新的生態(tài)風(fēng)險評估動態(tài)，進(jìn)而發(fā)展適合我國農(nóng)業(yè)生產(chǎn)實(shí)際的農(nóng)藥生態(tài)風(fēng)險評估體系，為農(nóng)藥的有效管理和降低兩棲動物的生存風(fēng)險提供切實(shí)可行的方案。