陳 宸, 張 坤, 丁 濤, 馮建國,楊 進, 賀 振, 陳夕軍*,

(1. 揚州大學(xué) 園藝與植物保護學(xué)院，江蘇 揚州 225009；2. 揚州市植保植檢站，江蘇 揚州 225101)

丙硫菌唑(結(jié)構(gòu)式見圖式1)是一種新型廣譜三唑硫酮類殺菌劑，其主要用于防治由子囊菌、擔子菌和無性菌引起的病害，對谷類、豆類的多數(shù)病有較好的防治效果[1-3]。與傳統(tǒng)的三唑類殺菌劑相比，丙硫菌唑殺菌范圍更廣，且增產(chǎn)作用明顯[4]。該產(chǎn)品自2004年上市以來，已成為谷物用殺菌劑市場的第一大產(chǎn)品。2015年11月丙硫菌唑在中國、美國和歐洲的化合物專利權(quán)到期，幾年時間僅中國就有近百個含丙硫菌唑的農(nóng)藥產(chǎn)品獲準田間試驗。截至2020年7月1日，已批準上市的原藥和制劑共有4個廠家的5種產(chǎn)品[5]。但目前在中國，丙硫菌唑單劑僅被登記用于小麥赤霉病的防控，與戊唑醇的復(fù)配劑也僅用于防治小麥白粉病、赤霉病和銹病[5]。

與其他三唑類殺菌劑一樣，戊唑醇(結(jié)構(gòu)式見圖式1)主要作用機理是通過抑制真菌中麥角甾醇的合成，從而抑制病菌生長[6]。但除了抑制麥角甾醇中間體的氧化脫甲基反應(yīng)外，戊唑醇還有其他作用位點，從而干擾反應(yīng)進行的先后順序，這一特點也擴大了其活性譜[7]。目前，戊唑醇已被廣泛應(yīng)用于大田作物[8-10]、蔬菜[11-13]、果樹[14-16]、花卉[17]、林木[18]和牧草[19]等的病害控制。中國登記含有戊唑醇成分的農(nóng)藥共765種，幾乎包括所有劑型，僅在水稻和小麥上登記用來防治紋枯病的劑型就分別有92種和29種[5]。

紋枯病是稻麥上的重要病害。水稻紋枯病更是被稱為水稻“三大病害”之一，僅中國由該病造成的年產(chǎn)量損失就達5億千克，位居水稻各病害之首[20]。一直以來，除戊唑醇外，井岡霉素、噻呋酰胺、苯醚甲環(huán)唑、嘧菌酯、氟環(huán)唑等數(shù)十種藥劑均被用于防治水稻、小麥紋枯病[5]，但作為新型三唑硫酮類殺菌劑的丙硫菌唑還未見有登記，更未有丙硫菌唑與戊唑醇復(fù)配劑在稻麥紋枯病防控上的應(yīng)用。本研究通過測定丙硫菌唑與戊唑醇不同配比對稻麥紋枯病菌的聯(lián)合效力 (聯(lián)合毒力)，選擇最佳配比進一步研制成懸浮劑，并進行田間防效測定，旨在為該藥劑的登記與田間使用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試農(nóng)藥：97%丙硫菌唑 (prothioconazole) 原藥 (安徽久易農(nóng)業(yè)股份有限公司)；98%戊唑醇(tebuconazole) 原藥和430 g/L戊唑醇懸浮劑 (江蘇龍燈化學(xué)有限公司)；40%丙硫菌唑 ? 戊唑醇懸浮劑 (江蘇省溧陽中南化工有限公司)；20%丙硫菌唑懸浮劑 (實驗室自制)。

供試菌株：水稻紋枯病菌YN-7和小麥紋枯病菌CAG-1由本實驗室分離自江蘇水稻和小麥紋枯病病株，并經(jīng)形態(tài)與分子生物學(xué)鑒定，備用。

GS6324磨砂機 (卓英干燥工程技術(shù)有限公司)；BT-9300ST型激光粒度分布儀 (丹東百特有限公司)；DV2TLV黏度計 (美國Brookfield公司)；JK99B型全自動張力儀 (上海中晨數(shù)字技術(shù)設(shè)備有限公司，精度0.05 mN/m)；SL200KB接觸角儀 (美國Kino公司，精度0.01 mm)。

1.2 聯(lián)合效力測定

采用菌絲生長速率法[21]。分別將丙硫菌唑和戊唑醇配制成0.5、1.0、2.5、5.0、10.0 μg/mL和0.25、0.5、1.0、2.5、5.0 μg/mL梯度濃度含藥培養(yǎng)基，將新活化的近長滿平板的病菌Φ6 mm菌絲塊接種至平板中央，以不含藥培養(yǎng)基作對照，待對照菌落近長滿平板時，采用十字交叉法測量各處理菌落直徑。每處理4次重復(fù)，試驗重復(fù)2次，接公式(1)計算菌絲生長抑制率。根據(jù)Wadley法計算各藥劑的毒力，即以藥劑濃度對數(shù)值為自變量(x)，以菌落抑制百分率機率值為因變量(y)，計算毒力回歸方程和相關(guān)系數(shù)(r)，并求出EC50值。

式中，I表示菌落生長抑制率；Dc表示對照菌落直徑；Dt表示處理菌落直徑。

根據(jù)上述試驗確定的2個單劑的抑菌濃度區(qū)間和其EC50值大小，確定丙硫菌唑和戊唑醇的混配質(zhì)量比 (3 : 1、2 : 1、1 : 1、1 : 2、1 : 3) 和5個濃度梯度。接公式(2)和(3)計算不同配比混劑的增效系數(shù)。

式中，A和B分別表示丙硫菌唑和戊唑醇，a和b分別表示兩者的混配比例，EC50(th)和EC50(ob)分別表示混劑的理論EC50值和實測EC50值。SR表示增效系數(shù)，SR ＞ 1.5為增效作用，0.5 ≤SR ≤ 1.5為相加作用，SR ＜ 0.5為拮抗作用[22]。

1.3 懸浮劑的制備與配方優(yōu)化

分別稱取13.20 g丙硫菌唑原藥和6.53 g戊唑醇原藥置于200 mL燒杯中，按一定比例加入潤濕分散劑、增稠劑、防凍劑和消泡劑，加水補足至80 g。攪拌均勻后用高速剪切機分散，并于砂磨機中與鋯珠按體積比1 : 1.2混合，在開通冷循環(huán)水狀態(tài)下，控制研磨溫度不超過35 ℃，研磨2 h。采用流點法[23]篩選潤濕分散劑，對流點法篩選的分散效果接近的潤濕分散劑進一步篩選，通過粒徑大小來確定最佳潤濕分散劑。

1.4 懸浮劑的性能指標測定

粒徑測定：將0.5 mL懸浮劑樣品加入激光粒度儀樣品池中，超聲分散1 min后進行測量，每處理重復(fù)3次。

懸浮率測定：按GB/T 14825方法[23]。

析水率測定：將10 mL樣品注入試管，置于(54 ± 2) ℃下熱貯14 d后測量樣品總高度和透明水層高度，按公式(4)計算析水率。

式中，BR為析水率；HT為樣品總高度，cm；HW為透明水層高度，cm。

入水分散性測定：將自來水裝入250 mL量筒中，用注射器取1 mL待測樣品，從距離量筒水面5 cm處滴入水中，觀察樣品在水中的分散情況。按其分散狀況的好壞分為優(yōu)、良和劣3級。優(yōu)：在水中呈云霧狀，自動分散，無可見顆粒下沉；良：在水中自動分散，有顆粒下沉，下沉顆粒慢慢分散或輕微搖動后分散；劣：在水中不能自動分散，呈顆?；蛐鯛钕鲁粒蟛糠謽悠分苯映寥氲撞?，經(jīng)強烈搖動后才能分散。

黏度測定：利用黏度計測定。將待測樣品置于不小于70 mm的燒杯或直形桶中，準確控制被測液體溫度。將選配好的轉(zhuǎn)子旋入連接螺桿，使轉(zhuǎn)子緩慢浸入被測液體中，直至轉(zhuǎn)子液面標志和液面相平，調(diào)整儀器水平。打開開關(guān)，轉(zhuǎn)動變速旋鈕使所需轉(zhuǎn)速向上，對準速度指示點，放松指針控制桿。待指針趨于穩(wěn)定時讀數(shù)。

表面張力測定：利用全自動張力儀按文獻[24]采用吊片法測定。

接觸角測定：利用SL200KB接觸角儀測定。將待測藥劑吸入微量進樣器中，在水平石蠟表面上方緩慢均勻釋放液滴，液滴體積為4～5 μL，待液滴滴落30 s后通過儀器配套軟件測定其接觸角。

傾倒性和持久起泡性：分別按GB/T 31737—2015和GB/T 28137—2011方法測定[25-26]。

1.5 24%丙硫菌唑 ? 戊唑醇懸浮劑對水稻、小麥紋枯病的防效測定

參照GB/T 17980.20—2000和GB/T 17980.108—2004方法進行[27-28]。2018—2019年在揚州市邗江區(qū)槐泗鎮(zhèn)小麥田和2018年、2020年在水稻田分別進行防治水稻、小麥紋枯病的田間藥效試驗。因2018年市場還未有丙硫菌唑與戊唑醇復(fù)配的商品，故不設(shè)市場同類復(fù)配藥劑對照，僅設(shè)單劑對照，試驗為6個處理。2019年江蘇省溧陽中南化工有限公司獲得40%丙硫菌唑 ? 戊唑醇懸浮劑登記證，故將其列為2019—2020年的對照藥劑，試驗為7個處理 (表1)。每處理重復(fù)3次，每小區(qū)面積20 m2。分別于小麥拔節(jié)前和水稻分蘗末期第一次用藥，7 d后第二次用藥，并于第二次藥后15 d按照國家標準中的方法及病害分級標準調(diào)查發(fā)病程度，按公式(5)和(6)計算病情指數(shù)和防治效果。每小區(qū)采用五點取樣，每點調(diào)查約100株

式中：DI為病情指數(shù)；DN為各級病株數(shù)；DT為調(diào)查總株數(shù)；GN為對應(yīng)的病級；GT為最高病級；CE為防治效果；DIC為對照病情指數(shù)；DIT為處理病情指數(shù)。

表1 不同年份各處理藥劑量 (有效成分g/hm2)Table 1 Dosages of each pesticide used in different years (a.i, g/hm2)

1.6 數(shù)據(jù)處理與分析

所有數(shù)據(jù)采用DPS軟件處理，運用鄧肯氏新復(fù)極差法對試驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，在5%水平上檢驗各處理間的差異顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同比例丙硫菌唑與戊唑醇復(fù)配對稻麥紋枯病菌的聯(lián)合效力

將丙硫菌唑與戊唑醇分別按質(zhì)量比3 : 1、2 :1、1 : 1、1 : 2和1 : 3的配比進行復(fù)配。聯(lián)合效力測定結(jié)果表明，當m(丙硫菌唑) :m(戊唑醇) = 2 :1和1 : 1時，對水稻紋枯病菌聯(lián)合效力的增效系數(shù) (SR) 分別為1.91和1.73，均大于1.5，說明兩者按這兩種比例復(fù)配后有增效作用；其他配比的SR值分別為0.86、1.02和1.13，均處于0.5～1.5之間，為相加作用 (表2)。測定同樣配比藥劑對小麥紋枯病菌的聯(lián)合效力，當m(丙硫菌唑) :m(戊唑醇) = 3 : 1和2 : 1時，其SR值分別為1.88和1.92，均大于1.5；其他配比的SR值分別為1.24、0.55和0.61 (表3)。故選擇2 : 1作為懸浮劑中m(丙硫菌唑) :m(戊唑醇)的最佳配比。

表2 丙硫菌唑與戊唑醇不同配比對水稻紋枯病菌的聯(lián)合毒力Table 2 Combined toxicity of prothioconazole and tebuconazole at different ratios to R. solani

表3 丙硫菌唑與戊唑醇不同配比對小麥紋枯病菌的聯(lián)合毒力Table 3 Combined toxicity of prothioconazole and tebuconazole at different ratios to R. cerealis

2.2 24%丙硫菌唑 ? 戊唑醇懸浮劑的配方篩選

試驗中對12種潤濕分散劑進行流點法測試(表4)，其中潤濕分散劑D425、EFW、Disper984和磷酸酯類Featdis SCP對原藥的流點較低，流點值處于0.55～0.62 mL/g之間，而其他潤濕分散劑的流點值均較高，故選擇這4種潤濕分散劑進行下一步配比優(yōu)化篩選。

表4 潤濕分散劑流點測試結(jié)果Table 4 Test results of the flow point value of different wetting dispersants

將不同配比的4種潤濕分散劑與0.2%黃原膠(XG) 混合，濕法研磨后進行樣品性能測試，根據(jù)懸浮率、熱貯析水率和熱貯后粒徑大小篩選出較好的潤濕分散劑組合。結(jié)果表明，組合2、6、7制備的懸浮劑各項指標較優(yōu) (表5)。

表5 不同潤濕分散劑組合制備的24%丙硫菌唑 ? 戊唑醇懸浮劑的理化性質(zhì)Table 5 Physical and chemical properties of prothioconazole + tebuconazole 240 g/kg SC with different wetting dispersant combinations

進一步測定熱貯前懸浮率、熱貯后析水率、粒徑大小、入水分散性和黏度等指標。結(jié)果表明，組合2的析水率為2.1%，熱貯后粒徑D50最小為0.6 μm，熱貯前懸浮率為93.2%，熱貯后懸浮率為94.3%，黏度為226 mPa·s，入水分散性良好 (表6)。因此，確定組合2 (4% Featdis SCP +3% EFW) 為最佳潤濕分散劑組合。

表6 較優(yōu)潤濕分散劑組合制備的24%丙硫菌唑 ? 戊唑醇懸浮劑的其他理化性質(zhì)Table 6 Other physical and chemical properties of prothioconazole + tebuconazole 240 g/kg SC with better wetting dispersant combinations

在上述最佳組合2中添加不同量的增稠劑黃原膠 (XG) 和硅酸鎂鋁 (SM)，經(jīng)研磨后測定其析水率、分散性、流動性和熱貯后穩(wěn)定性等指標。結(jié)果表明，添加0.2%XG + 1.0%SM的樣品流動性和分散性均較好，經(jīng)熱貯無分層現(xiàn)象 (表7)。

表7 不同增稠劑及其組合制備的24%丙硫菌唑 ? 戊唑醇懸浮劑的流動性、分散性與穩(wěn)定性Table 7 Fluidity, dispersity and stability of prothioconazole + tebuconazole 240 g/kg SC with different thickeners and their combinations

分別以4%乙二醇、丙三醇或尿素作為防凍劑進行優(yōu)化篩選。結(jié)果表明，添加乙二醇的樣品無論是外觀還是粒徑大小均保持良好的狀態(tài)，(0 ±2) ℃冷貯7 d和(54 ± 2) ℃熱貯14 d后，其粒徑變化均較小 (表8)。

表8 不同防凍劑制備的24%丙硫菌唑 ? 戊唑醇懸浮劑的外觀與粒徑Table 8 Appearance and particle sizes of prothioconazole + tebuconazole 240 g/kg SC with different antifreezes

綜上，確定24%丙硫菌唑 ? 戊唑醇懸浮劑的最佳配方為：16%丙硫菌唑、8%戊唑醇、4%Featdis SCP、3% EFW、0.2% XG、1% SM、4%乙二醇，加水補足至100%。

2.3 懸浮劑粒徑與研磨時間的關(guān)系

將最佳配方在轉(zhuǎn)速1 500 r/min條件下研磨，分別于30、60、90、120和150 min時取樣測定粒徑。結(jié)果表明，隨著研磨時間增加粒徑減小。當研磨時間達到120 min時，D50值和D90值變化較小，且遠小于國家標準 (D90≤ 5 μm)，繼續(xù)研磨反而會增加生產(chǎn)成本 (表9)。因此，綜合物理穩(wěn)定性和成本等因素，將研磨時間確定為120 min。

表9 不同研磨時間下24%丙硫菌唑 ? 戊唑醇懸浮劑的粒徑Table 9 Particle sizes of prothioconazole + tebuconazole 240 g/kg SC after different grinding times

2.4 24%丙硫菌唑 ? 戊唑醇懸浮劑的性能指標

分別將24%丙硫菌唑 ? 戊唑醇懸浮劑樣品于(0 ± 2) ℃下冷貯7 d和(54 ± 2) ℃下熱貯14 d后取出測定其主要性能指標。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，經(jīng)冷熱貯后，樣品的懸浮率、持久起泡性、粒徑大小、傾倒性和黏度等均相對穩(wěn)定，且測量數(shù)值均在合格范圍內(nèi)(表10、表11)。

表10 (0 ± 2) ℃冷貯7 d后24%丙硫菌唑 ? 戊唑醇懸浮劑的性能指標Table 10 Performance index of prothioconazole + tebuconazole 240 g/kg SC after cold storage at (0 ± 2) ℃ for 7 days

表11 (54 ± 2) ℃熱貯14 d后24%丙硫菌唑 ? 戊唑醇懸浮劑的性能指標Table 11 Performance index of prothioconazole + tebuconazole 240 g/kg SC after heat storage at (54 ± 2) ℃ for 14 days

藥液的表面張力越小，越有利于其在植物葉片表面鋪展。將24%丙硫菌唑 ? 戊唑醇懸浮劑稀釋為田間施藥濃度時，不同濃度藥液表面張力存在明顯差異，以稀釋600倍時表面張力最低，為52.26 mN/m；當稀釋倍數(shù)為800、1 000和1 200時，表面張力分別為60.31、62.77和63.84 mN/m，但均小于清水對照。采用懸滴法測量各濃度藥液在石蠟表面的接觸角，亦為稀釋600倍時為最小，為46.98°；稀釋倍數(shù)越大，接觸角也越大，但均明顯小于清水對照，表明藥液對疏水表面具有一定的潤濕作用，有利于鋪展 (表12、圖1)。

表12 田間施用濃度下24%丙硫菌唑 ? 戊唑醇懸浮劑的展布性能Table 12 Distribution performance of prothioconazole +tebuconazole 240 g/kg SC at application concentration in the field

2.5 24%丙硫菌唑 ? 戊唑醇懸浮劑對水稻、小麥紋枯病的田間防效

分別于二次施藥后15 d調(diào)查田間病害發(fā)生程度，并計算防效。結(jié)果表明，24%丙硫菌唑 ? 戊唑醇懸浮劑對稻麥紋枯病均有較好防效。2018年和2019年連續(xù)兩年田間試驗，在小麥紋枯病發(fā)生輕或重的年份，有效成分150 g/hm2用量條件下，病害防效均可達85%以上；與丙硫菌唑、戊唑醇單劑用量相同時，其防效明顯好于單劑。2018年和2020年水稻紋枯病防治試驗結(jié)果表明，兩次施藥，有效成分210 g/hm2用量條件下，防效分別近80%和90%；且不同劑量24%丙硫菌唑 ? 戊唑醇懸浮劑對水稻紋枯病的防效均高于單劑。與商品化40%丙硫菌唑 ? 戊唑醇懸浮劑對比，同等使用劑量下，本研究制備的24%丙硫菌唑 ? 戊唑醇懸浮劑對稻麥紋枯病的防效均高于對照藥劑 (表13和表14)。

表13 24%丙硫菌唑 ? 戊唑醇懸浮劑對小麥紋枯病的田間防效Table 13 Control efficacy of prothioconazole + tebuconazole 240 g/kg SC on wheat sharp eyespot in the field

表14 24%丙硫菌唑 ? 戊唑醇懸浮劑對水稻紋枯病的田間防效Table 14 Control efficacy of prothioconazole + tebuconazole 240 g/kg SC on rice sheath blight in the field

3 討論

合理復(fù)配殺菌劑，不僅可以擴大防治譜，還可以延緩病原菌抗藥性的產(chǎn)生，提高防效。殺菌劑復(fù)配除需考慮其相加或增效作用外，還不能引起化學(xué)變化和改變藥劑本身的物理性狀[29]。一般情況下，不同作用方式、不同作用機理、不同作用時效、作用于病菌不同生化位點或生長階段的殺菌劑可用來復(fù)配。丙硫菌唑和戊唑醇雖同為三唑類殺菌劑，但丙硫菌唑是在原有的三唑類殺菌劑基礎(chǔ)上優(yōu)化而來，與傳統(tǒng)三唑類殺菌劑相比，其有更廣泛的抑制譜。而且與氟環(huán)唑、戊唑醇和三唑醇等其他唑類殺菌劑相比，丙硫菌唑有著不同的抑菌機理，它是一種競爭性底物抑制劑，與病菌MgCYP51蛋白 (細胞色素P450) 的結(jié)合能力遠低于其他唑類殺菌劑，形成的結(jié)合產(chǎn)物也非經(jīng)典的低自旋的6配基復(fù)合物[30]。而戊唑醇除與丙硫菌唑一樣，可抑制麥角甾醇合成中間體2,4-亞甲基-二氫羊毛甾醇結(jié)構(gòu)中14位碳原子上的脫氫反應(yīng)，其還有其他作用位點。用戊唑醇處理后，菌絲中出現(xiàn)雙鍵位于第5位C原子的麥角甾醇、豆固醇和豆固二烯醇三種甾醇，可能是因為戊唑醇干擾了反應(yīng)進行的順序，導(dǎo)致雙鍵位于第8位C原子的甾醇中間體向雙鍵位于第7位C原子的甾醇中間體異構(gòu)化反應(yīng)不能正常進行[6]。因此這兩種不同作用機理和不同作用位點的三唑類殺菌劑完全可以用來進行復(fù)配，以提高藥劑的殺菌譜與防效。

懸浮劑是近年來發(fā)展較快的水基化劑型，與乳油、粒劑和可濕性粉劑等傳統(tǒng)劑型相比，其對環(huán)境和使用者相對安全，且生產(chǎn)、貯存和運輸成本低。但由于懸浮劑配方組成復(fù)雜，屬于熱力學(xué)不穩(wěn)定體系，在貯存、運輸與使用過程中容易出現(xiàn)析水、膏化、分層和結(jié)塊現(xiàn)象，而通過添加合適的助劑是解決這一問題的關(guān)鍵[31-33]。本試驗中，通過對潤濕分散劑、增稠劑和防凍劑的逐一篩選，獲得了物理穩(wěn)定性好、質(zhì)量指標合格，且加工工藝簡單的24%丙硫菌唑 ? 戊唑醇懸浮劑，適合大規(guī)模生產(chǎn)與應(yīng)用。

丙硫菌唑自2004年上市以來，被用于多種植物上病害的防控。有報道表明，其除對包括由殼針孢菌、鐮刀菌和喙孢菌等病原真菌引起的所有麥類病害有很好防效外，還能防治花生和油菜等的菌核病、銹病、葉斑病、黑脛病等[2-3]。但有關(guān)其單劑或復(fù)配劑對水稻紋枯病的防控研究還較少。本試驗結(jié)果表明，同等劑量條件下，24%丙硫菌唑 ? 戊唑醇懸浮劑對稻麥紋枯病防效顯著高于丙硫菌唑和戊唑醇單劑；且當將有效成分分別提高至150 g/hm2和210 g/hm2時，復(fù)配劑24%丙硫菌唑 ? 戊唑醇懸浮劑對小麥和水稻紋枯病的2年防效分別高達90.32%、86.26和79.12%、89.01%。說明將丙硫菌唑與戊唑醇復(fù)配，可以用于稻麥紋枯病的防控，有推廣應(yīng)用價值。