蘇陽(yáng)，徐凌川

(山東中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，山東 濟(jì)南 250355)

美洲大蠊PeriplanetaamericanaL.為昆蟲(chóng)綱有翅亞綱蜚蠊目蜚蠊科大蠊屬昆蟲(chóng)[1]，俗名“蟑螂”。始載于我國(guó)的第一部藥物學(xué)專(zhuān)著——《神農(nóng)本草經(jīng)》，位列蟲(chóng)獸部中品，始稱(chēng)“蜚廉”[2]，李時(shí)珍《本草綱目》中亦錄有別名石姜、負(fù)盤(pán)、滑蟲(chóng)、茶婆蟲(chóng)、香娘子等。其味咸、寒、有毒，主治血瘀、癥堅(jiān)、寒熱、喉咽痹、內(nèi)寒無(wú)子，有下氣、利血脈、破積聚的功效[3-7]。美洲大蠊用藥歷史悠久，現(xiàn)已被云南、湖南等多省藥材標(biāo)準(zhǔn)單獨(dú)收錄[8-9]。近年來(lái)，美洲大蠊的研究熱點(diǎn)多側(cè)重于其化學(xué)成分和藥理作用，發(fā)現(xiàn)其主要成分為信息素、氨基酸和各種昆蟲(chóng)神經(jīng)肽[10]，具有抗腫瘤、抗病毒、促進(jìn)組織復(fù)生、鎮(zhèn)痛、抗炎以及保護(hù)心血管方面的作用[11-15]，以美洲大蠊為原藥的康復(fù)新液、心脈隆注射液、肝龍膠囊等中藥制劑現(xiàn)已在臨床應(yīng)用[16]。

中國(guó)已知蜚蠊種類(lèi)近300種[17]，美洲大蠊常以干燥蟲(chóng)體為中藥原料，隨著其臨床應(yīng)用日益廣泛，市場(chǎng)上出現(xiàn)了不少與美洲大蠊形態(tài)相似的品種，如德國(guó)小蠊Blattellagermanica和雄土鱉EupolyphagasinensisW.，存在摻假銷(xiāo)售現(xiàn)象。鑒于此，本文對(duì)美洲大蠊的外觀(guān)形狀特征進(jìn)行了詳細(xì)描述。又因美洲大蠊常以粉末形式在網(wǎng)上銷(xiāo)售，本文將對(duì)其粉末進(jìn)行生藥學(xué)和分子生藥學(xué)鑒定，為該藥材的質(zhì)量控制提供參考依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

Stemi 305高效體視顯微鏡(德國(guó)卡爾·蔡司公司)；PH100-DB500U-IPL生物數(shù)碼顯微鏡，鳳凰PHMIAS2008圖像處理軟件(江西鳳凰光學(xué)股份有限公司)；5424R臺(tái)式離心機(jī) (德國(guó) Eppendorf)；ABI 3730xl DNA 測(cè)序儀(美國(guó) ABI 公司)；Bio-Rad 伯樂(lè)ChemicDocTM XRS+凝膠成像系統(tǒng)(美國(guó)伯樂(lè)公司)；B960 PCR儀(杭州晶格科學(xué)儀器有限公司)。

1.2 藥品與試劑

美洲大蠊干燥蟲(chóng)體，采購(gòu)于濟(jì)南市長(zhǎng)清區(qū)魯明生態(tài)養(yǎng)殖園，經(jīng)山東中醫(yī)藥大學(xué)生藥學(xué)教研室徐凌川教授鑒定為蜚蠊科大蠊屬昆蟲(chóng)美洲大蠊PeriplanetaamericanaL.的干燥蟲(chóng)體。德國(guó)小蠊B.germanica和雄土鱉E.sinensis誘捕于山東中醫(yī)藥大學(xué)長(zhǎng)清校區(qū)，經(jīng)烘干法得干燥蟲(chóng)體。石油醚、水合氯醛、丙三醇均為分析純(天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司)，蒸餾水(山東中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)中心)。OMEGA動(dòng)物組織提取試劑盒(批號(hào)D5625-01) ，EasyTaq Buffer(批號(hào)M20833) EasyTaq聚合酶(批號(hào) M20823)，dNTP Mixture (批號(hào)M20805) 和DNA Marker(BM2000+1.5k， 批號(hào)L61023)，CO1引物(批號(hào)180810B52、18081B53，均購(gòu)于北京全式金生物技術(shù)有限公司，測(cè)序由山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物中心分子測(cè)序中心完成。

2 方法

依照《中國(guó)藥典》2015年版一部中藥材粉末鑒定方法[18]，將藥材樣品粉碎，再對(duì)藥材粗粉用石油醚脫脂處理，揮干醚液，過(guò)4號(hào)篩(65目篩)后，混合均勻[19]。取粉末少許至載玻片上，分別用水合氯醛溶液、稀甘油、蒸餾水裝片后置于生物顯微鏡下觀(guān)察粉末顯微特征，并用顯微鏡配備的鳳凰PHMIAS2008圖像處理軟件對(duì)粉末特征進(jìn)行圖像采集以及測(cè)量分析[20]。

DNA提取及序列擴(kuò)增采用OMEGA動(dòng)物組織提取試劑盒(以下簡(jiǎn)稱(chēng)試劑盒)，具體實(shí)驗(yàn)操作參考使用說(shuō)明書(shū)。昆蟲(chóng)種屬鑒定是基于線(xiàn)粒體細(xì)胞色素C 氧化酶亞基1 (CO1)的DNA 條形碼[21]。

PCR反應(yīng)總體系為25 μL，其中EasyTaq聚合酶0.25 μL， 10×EasyTaq Buffer 2.5 μL， dNTPs(2.5 μmol·L)2.0 μL，上、下游引物各 1.0 μL(10 μmol/L)，DNA 模板2.0 μL(20～50 ng/L)，無(wú)菌超純水補(bǔ)足至 25 μL。PCR擴(kuò)增上游引物L(fēng)CO1490:5'-GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3' HCO2198:5'-TAAACTTCAGGGTGACCAAA AAATCA-3'進(jìn)行PCR擴(kuò)增[22-24]。

PCR反應(yīng)程序?yàn)?4 ℃ 1 min、94 ℃ 1 min、45 ℃ 1.5 min、72 ℃ 1.5 min，5個(gè)循環(huán)；94 ℃ 1 min，50 ℃ 1.5 min，72 ℃ 1 min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 5 min。取5 μL PCR產(chǎn)物利用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增效果。測(cè)序由山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物中心測(cè)序中心完成。數(shù)據(jù)處理：測(cè)序峰圖利用Seq Man、CodonCode Aligner V等軟件進(jìn)行基因序列拼接整理，獲得CO1序列。并與GenBank收錄的美洲大蠊的CO1基因序列進(jìn)行相似性對(duì)比。通過(guò)DNA條形碼檢測(cè)傳統(tǒng)鑒定學(xué)的準(zhǔn)確性。

3 鑒別

3.1 性狀鑒別

美洲大蠊干燥蟲(chóng)體呈類(lèi)卵圓形，赤褐色，頭部略平窄尾部寬。整體長(zhǎng)27～32 mm，寬9～27 mm，厚度6～10 mm，雌體比雄體微大[25]。前胸背板略作梯形，中部有一赤褐以至黑褐蝶形斑，中線(xiàn)前緣有黃色“T”形小斑，后緣緩弧形。雄體腹部各節(jié)背板后側(cè)角為直角，鈍圓，雌體后端數(shù)節(jié)向后略突出。翅發(fā)達(dá)，雄體翅超出腹端，雌體翅伸至腹端。雄體肛上板橫寬，半透明，后緣有較大的三角缺口，腹部第一背板無(wú)毛茸；雌體肛上板略呈長(zhǎng)三角形，不透明，后緣呈三角形切口。足三對(duì)，下足露于蟲(chóng)體外。體較輕，質(zhì)脆易折斷，氣腥，味微咸。

蜚蠊形態(tài)大小有差異，歷代本草中均有記載，基本可從其大小、形狀和顏色等方面與正品進(jìn)行區(qū)分。市場(chǎng)上常見(jiàn)美洲大蠊混淆品主要是德國(guó)小蠊和雄土鱉?，F(xiàn)代性狀鑒別多結(jié)合其前胸背板形狀、翅膀形狀及其氣味等特點(diǎn)進(jìn)行鑒別。鑒別要點(diǎn)見(jiàn)表1。

表1 美洲大蠊及市面上常見(jiàn)偽品的性狀鑒別要點(diǎn)

3.2 顯微鑒別

美洲大蠊粉末顯微實(shí)物圖見(jiàn)圖1。

注：A—體壁碎片；B—橫紋肌碎片；C—粗剛毛；D—細(xì)剛毛；E—復(fù)眼碎片；F—翅膀碎片。圖1 美洲大蠊粉末顯微實(shí)物圖Fig.1 Micrograph of P. americana powder

3.2.1 體壁碎片

黃色或黃棕色[26]體壁碎片，具網(wǎng)狀紋理，有時(shí)可見(jiàn)類(lèi)圓形壁孔，壁孔邊緣顏色變深；黃棕色或淡黃色體壁碎片，具類(lèi)六邊形或魚(yú)鱗狀紋理；黃棕色體壁碎片，表面平滑而附有虛線(xiàn)白點(diǎn)狀紋理，偶見(jiàn)透明類(lèi)圓狀毛窩；黃棕色或黃褐色體壁碎片，表面常見(jiàn)圓點(diǎn)狀毛窩；淺黃色或無(wú)色具魚(yú)鱗狀突起的體壁碎片；淺黃色或無(wú)色體壁碎片，表面圓凸，密布細(xì)短的剛毛；部分體壁碎片有明顯的內(nèi)外壁分層，外壁折斷后突顯出色淡或無(wú)色的內(nèi)壁。

3.2.2 橫紋肌

橫紋肌纖維常見(jiàn)[27]，棕黃色或無(wú)色透明，橫紋排列細(xì)密，有時(shí)或交叉、或垂直、或螺旋狀散在。

3.2.3 剛毛

剛毛有粗細(xì)兩種[28]。粗剛毛：常見(jiàn)，長(zhǎng)圓錐形，平直或略彎曲，深棕色或棕褐色，長(zhǎng)96～217 μm，中段直徑14～31 μm，多斷裂；基部呈類(lèi)圓形，略膨大，后向上略有凹陷；中段顏色加深；頂端鈍圓，顏色與基部顏色大體一致；于高倍鏡下觀(guān)察，剛毛全體自基部凹陷處以上開(kāi)始，附著有緊貼表面且尖部朝上的寬扁形毛刺，延伸至剛毛頂端時(shí)，毛刺逐漸變圓，呈膨弧狀，有時(shí)可見(jiàn)毛刺間的溝壑；髓腔發(fā)達(dá)，基本貫通剛毛全體，基部腔體直徑可達(dá)總直徑的一半，腔內(nèi)中空或殘留黑色毛髓。細(xì)剛毛：常見(jiàn)，披針形或針形，平直或稍彎曲，黃色或黃棕色，長(zhǎng)80～317 μm，中段直徑4～12 μm，多自基部斷裂；完整者可見(jiàn)基部略膨大形似鉚釘；頂端尖銳；表面平滑，無(wú)紋理；髓腔細(xì)長(zhǎng)通透，無(wú)髓質(zhì)。

3.2.4 復(fù)眼碎片

復(fù)眼碎片少見(jiàn)，單眼[29]呈正六邊形或類(lèi)圓形，中央白凈，各單眼相交邊緣呈磨砂粒感的暗灰色。

3.2.5 翅膀碎片

翅膀碎片偶見(jiàn)，黃綠色或淺黃色，表面有鱗狀或波紋狀的紋理密布。

3.2.6 脂肪油滴

脂肪油滴[30]常見(jiàn)，黃色或淺黃色，略顯透亮，類(lèi)圓形或類(lèi)橢圓形，單個(gè)或聚集成團(tuán)狀散在。

3.2.7 常見(jiàn)偽品顯微特征

德國(guó)小蠊與美洲大蠊的體壁碎片及其他碎片顯微觀(guān)察未見(jiàn)明顯差異，兩者主要差異在于剛毛的疏密程度。美洲大蠊剛毛多斷裂散在分布，位于體壁上的剛毛分布較密，而德國(guó)小蠊體壁剛毛分布稀疏。雄土鱉粉末呈深棕色至褐色，與前兩者顏色相比，視野下粉末顏色明顯加深，差異明顯，可作為顯微鑒定的區(qū)分項(xiàng)。另外，雄土鱉偶見(jiàn)表面具刺突的剛毛，是其特有剛毛類(lèi)型。

3.3 PCR擴(kuò)增及序列分析

以提取的美洲大蠊待測(cè)樣本基因組DNA為模板，采用DNA條形碼中的動(dòng)物通用引物CO1進(jìn)行PCR擴(kuò)增，利用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增結(jié)果。用DNA Marker D(100～2000 bp)檢測(cè)擴(kuò)增片段DNA長(zhǎng)度，以確保擴(kuò)增結(jié)果有效。在紫外光下觀(guān)察可擴(kuò)增出一條明顯的特異性條帶，與Marker區(qū)間對(duì)比，DNA長(zhǎng)度為700 bp左右(圖2)，結(jié)果說(shuō)明PCR擴(kuò)增結(jié)果可用。將測(cè)序所得序列進(jìn)行拼接及人工校對(duì)，去除低質(zhì)量序列及引物區(qū)。經(jīng)雙向測(cè)序、拼接，所得序列片段長(zhǎng)度與PCR擴(kuò)增結(jié)果基本一致。用NCBI GenBank進(jìn)行在線(xiàn)BLAST比對(duì)，與P.americana的CO1序列匹配度都很高，同源性100%，表明擴(kuò)增和測(cè)序結(jié)果準(zhǔn)確可靠，分子生藥學(xué)方法能夠準(zhǔn)確鑒別美洲大蠊正品。

注：1—空白；2～4—美洲大蠊樣品；M—DNA Marker。圖2 CO1基因片段擴(kuò)增結(jié)果Fig.2 Amplification results of CO1 gene fragment

4 結(jié)論與討論

美洲大蠊蟲(chóng)體卵圓形，前胸背板近梯形，前胸背板中部的蝶形斑，是其區(qū)別于偽品的顯著特征。雄性美洲大蠊翅膀較長(zhǎng)超出腹端，雌性與腹端齊平。從顯微鑒別特征來(lái)看，美洲大蠊剛毛有粗細(xì)兩種，粗剛毛常見(jiàn)，長(zhǎng)圓錐形，基部略膨大，向上逐漸凹陷，頂端鈍圓，髓腔發(fā)達(dá)貫穿全體，偶見(jiàn)黑色髓質(zhì)。不同部位蟲(chóng)體碎片略有差別，多具網(wǎng)狀或鱗狀紋理。對(duì)不同批次的美洲大蠊顯微鑒別結(jié)果表明，美洲大蠊不同部位的顯微特征不同，相同顯微鑒別特征可能分布在不同部位，其碎片和剛毛可作為區(qū)分其他粉末的主要依據(jù)。結(jié)合分子鑒定，說(shuō)明該生藥學(xué)鑒定方法可以準(zhǔn)確鑒定美洲大蠊?，F(xiàn)有的資料對(duì)美洲大蠊及其常見(jiàn)偽品的鑒別報(bào)道很少，本文首次將美洲大蠊與市面上常見(jiàn)偽品德國(guó)小蠊及雄土鱉進(jìn)行鑒別，所以鑒定結(jié)果的準(zhǔn)確性有力地保障了質(zhì)量控制方面的進(jìn)一步研究。

該實(shí)驗(yàn)對(duì)美洲大蠊中藥材粉末鑒定的前期處理做了優(yōu)化。在實(shí)驗(yàn)初期，未對(duì)美洲大蠊粉末進(jìn)行脫脂處理，發(fā)現(xiàn)顯微視野下粉末的脂肪油滴過(guò)多，對(duì)實(shí)驗(yàn)的正常觀(guān)察造成了不小影響。而脫脂后的美洲大蠊的粉末，在顯微鏡下特征明顯，顏色分明，使實(shí)驗(yàn)達(dá)到了預(yù)期的效果。美洲大蠊粉末碎片種類(lèi)較多，觀(guān)察起來(lái)較為繁瑣，針對(duì)于此種情況，實(shí)驗(yàn)中分別將美洲大蠊翅膀、腹部、頭部、胸部粉碎后各自觀(guān)察。在記錄特征之后，再對(duì)美洲大蠊全身的粉末進(jìn)行顯微鑒別。用此種方法可以較系統(tǒng)全面地識(shí)別美洲大蠊粉末的顯微特征，快速將其與其他粉末區(qū)別。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中還發(fā)現(xiàn)，對(duì)于經(jīng)水合氯醛透化制成的臨時(shí)裝片，實(shí)際的觀(guān)察效果不如水合氯醛、甘油或蒸餾水的冷裝片效果好。所以建議觀(guān)察美洲大蠊粉末前，先將粉末進(jìn)行脫脂處理，再冷裝片觀(guān)察。形態(tài)學(xué)鑒定在中藥鑒定學(xué)研究中仍普遍適用，且短期之內(nèi)其方法不會(huì)被取代。由于CO1基因片段保守性強(qiáng), 適于親緣關(guān)系較近的昆蟲(chóng)分子系統(tǒng)研究，故本實(shí)驗(yàn)未對(duì)其全部種類(lèi)進(jìn)行分子鑒定。本次實(shí)驗(yàn)，筆者總結(jié)了美洲大蠊的性狀及其粉末顯微特征和分子鑒定結(jié)果，希望可以為鑒別美洲大蠊提供參考資料。

美洲大蠊作為傳統(tǒng)藥用昆蟲(chóng)，在抑菌和促進(jìn)傷口愈合方面效果顯著，對(duì)增強(qiáng)心臟功能、治療肝炎和肝纖維化也有作用。目前，云南、四川和山東等地人工養(yǎng)殖美洲大蠊初具規(guī)模，市面上開(kāi)發(fā)出了以美洲大蠊為原料的復(fù)方制劑，以其為中心的產(chǎn)業(yè)鏈已具雛形。美洲大蠊中藥劑型的品質(zhì)和其粉末的質(zhì)量關(guān)系密切[31]，但就目前而言，基礎(chǔ)研究仍有不足，下一步應(yīng)該加強(qiáng)質(zhì)量控制方面的研究，將更多品質(zhì)更佳的美洲大蠊投入市場(chǎng)。