張華麗，周洪亮 ，孫家昌

(1.濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院 山東省出生缺陷研究與轉(zhuǎn)化協(xié)同創(chuàng)新中心，山東 濟(jì)寧 272067； 2.濟(jì)寧市婦幼保健計(jì)劃生育服務(wù)中心，山東 濟(jì)寧 272000)

土鱉蟲為鱉蠊科昆蟲地鱉 (EupolyphagasinensisWalker)或冀地鱉(Steleophagaplancyia(Boleny))的雌蟲干燥體[1]，又稱土鱉、簸箕蟲、地鱉蟲、地烏龜、土元等[2]。土鱉蟲在我國《神農(nóng)本草經(jīng)》等各種古代醫(yī)藥學(xué)典籍中均有詳細(xì)記載，其性寒味咸，有活血散瘀、消腫止痛、接骨連筋之功效，可用于淤血癥、跌打損傷、慢性肝炎等[3-4]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究證明，土鱉蟲有抗凝血和抗血栓、肝臟保護(hù)[5]、提高免疫力[6]、抗氧化、抗衰老[7]、抗腫瘤[8-9]、促進(jìn)骨骼愈合[10]等作用，作為傳統(tǒng)的藥食兩用資源，具有良好的開發(fā)前景。

土鱉蟲中富含多種氨基酸，總質(zhì)量分?jǐn)?shù)占蟲體的40%[11-13]，其游離和水解氨基酸包含了17種以上主要氨基酸，其中7種是人體所必需的氨基酸，占其氨基酸總量的30%以上[14]，其中以谷氨酸、丙氨酸及酪氨酸含量最高，在活血化瘀、消腫止痛、抗氧化等方面發(fā)揮著重要的藥理作用[15-16]。近年來對土鱉蟲中氨基酸的研究主要集中在藥理活性方面，如何準(zhǔn)確并快速地檢測土鱉蟲中的氨基酸含量，對其質(zhì)量控制及開發(fā)應(yīng)用具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

氨基酸含量測定方法較多，包括可見分光光度法[17]、氣質(zhì)聯(lián)用儀技術(shù)[18]、柱前衍生化高效液相色譜法和氨基酸自動(dòng)分析儀法[19]等?？梢姺止夤舛确ㄖ荒軠y定總氨基酸含量，氣質(zhì)聯(lián)用儀技術(shù)前處理步驟復(fù)雜，柱前衍生化高效液相色譜法存在衍生化試劑不穩(wěn)定、衍生化反應(yīng)受溶液pH影響大等缺點(diǎn)。而氨基酸分析儀法有選擇性、專屬性強(qiáng)，靈敏度高，檢測速度快等優(yōu)點(diǎn)，操作簡便，適用于多種組分中單一組分的快速檢測分析，因而本研究以谷氨酸為指標(biāo)性成分，采用氨基酸自動(dòng)分析儀，優(yōu)化土鱉蟲中谷氨酸的提取檢測方法，為其質(zhì)量控制及資源深入開發(fā)提供技術(shù)支持。

1 儀器與材料

1.1 實(shí)驗(yàn)儀器

DFT-200手提式小型粉碎機(jī)(北京科偉永興儀器有限公司)；L-8900氨基酸分析儀(日立公司)；SHZ-DIII循環(huán)水真空泵(鄭州予華儀器制造有限公司)；204E/02電子天平(梅特勒-托利多上海有限公司)；GZX-9023MBZ電熱鼓風(fēng)干燥箱(上海博訊實(shí)業(yè)有限公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)材料

谷氨酸標(biāo)準(zhǔn)液(日本和光純藥株式會(huì)社)；鹽酸溶液(萊陽經(jīng)濟(jì)開發(fā)區(qū)精細(xì)化工廠)；重蒸水(自制)。土鱉蟲購自中藥店(10批次樣品產(chǎn)地見表1)，60 ℃干燥至恒重，粉碎，過40目篩，細(xì)粉備用。

表1 土鱉蟲樣品來源

2 方法與結(jié)果

2.1 供試品溶液的制備

精密稱取土鱉蟲粉末50 mg，將其粉碎，置于安瓿內(nèi)，加入6 mol/L的鹽酸20 mL密封，恒溫100 ℃水解22 h，將水解產(chǎn)物置于蒸發(fā)皿中蒸干，加入7～8 mL蒸餾水，再蒸干，重復(fù)3次。加入0.2 g活性炭脫色，過濾水洗至澄清。稀釋至50 mL 后，用氨基酸自動(dòng)分析儀測定含量。

2.2 對照品溶液的制備

取谷氨酸標(biāo)準(zhǔn)液(2.5 μmol/mL)2 mL稀釋至50 mL，作為標(biāo)樣對照液(0.1 μmol/mL)。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精密移取谷氨酸標(biāo)準(zhǔn)液(2.5 μmol/mL)10、15、30、60、120 μL于5個(gè)樣品管中，稀釋至1200 μL，配置成濃度分別為0.020 83、0.031 25、0.062 50、0.125 0、0.250 0 μmol/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液。氨基酸分析儀自動(dòng)依次進(jìn)樣，進(jìn)樣量為20 μL。以峰面積為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)做回歸曲線，得回歸方程為Y=29 999 644X+84 962,R2=0.999 9，線性關(guān)系良好。

2.4 鹽酸濃度對氨基酸提取的影響

精密稱取4份過40目篩的土鱉蟲細(xì)粉各50 mg，置于試管中，分別加入1、2、4、6、8 mol/L 的鹽酸溶液20 mL，恒溫100 ℃水解22 h，按2.1項(xiàng)下方法處理。稀釋至50 mL后用氨基酸自動(dòng)分析儀檢測，結(jié)果見圖1，橫坐標(biāo)為鹽酸濃度cHCl，縱坐標(biāo)為谷氨酸提取量m。由圖1可知，當(dāng)鹽酸濃度為6 mol/L時(shí)提取率達(dá)到最高。

圖1 鹽酸濃度對谷氨酸提取量的影響Fig.1 Effect of HCl concentration on glutamic acid extraction

2.5 料液比對土鱉蟲氨基酸提取的影響

2.6 提取時(shí)間對土鱉蟲氨基酸提取的影響

精密稱取4份過40目篩的土鱉蟲細(xì)粉各50 mg，置于試管中，分別加入6 mol/L的鹽酸溶液20 mL，密封，在100 ℃恒溫條件下，分別提取14、18、22、26 h，然后按2.1項(xiàng)下方法處理。稀釋至50 mL后用氨基酸自動(dòng)分析儀定量分析，結(jié)果見圖3，橫坐標(biāo)為提取時(shí)間，縱坐標(biāo)為谷氨酸提取量m。由圖3可知，土鱉蟲中谷氨酸的提取時(shí)間22 h為宜。

圖3 提取時(shí)間對谷氨酸提取量的影響Fig.3 Effect of extraction time on glutamic acid extraction

2.7 精密度試驗(yàn)

取2.2中濃度為0.1 μmol/mL的谷氨酸標(biāo)樣對照液重復(fù)進(jìn)樣6次，每次20 μL，分析精密度試驗(yàn)結(jié)果,見表2，得到相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為0.24%(n=6)，說明該儀器的性能良好，誤差較小，適用于快速分析。

表2 精密度試驗(yàn)

2.8 重復(fù)性試驗(yàn)

精密稱取同一批次的土鱉蟲粉末樣品6份，按照2.1項(xiàng)下的方法配置溶液并進(jìn)行含量測定，結(jié)果見表3，計(jì)算RSD為3.18%，表明本法重復(fù)性較好。

表3 重復(fù)性試驗(yàn)

2.9 加樣回收率試驗(yàn)

表4 回收率試驗(yàn)

2.10 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取樣品按2.1制備供試品溶液，按2.8條件在0、2、4、6、8 h后進(jìn)行測定，分析結(jié)果見表5，由數(shù)據(jù)可知此方法穩(wěn)定性良好。

表5 穩(wěn)定性試驗(yàn)

2.11 谷氨酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)測定

采用建立的方法對不同產(chǎn)地和批次的土鱉蟲樣品進(jìn)行分析，測定谷氨酸含量，結(jié)果見表6。不同地區(qū)土鱉蟲中谷氨酸含量存在較明顯差異，含量范圍為72.61～78.12 μmol/g，換算為質(zhì)量分?jǐn)?shù)(w)即1.068%～1.149% ，其中浙江、山東樣品谷氨酸含量較高，云南、廣西樣品含量較低。

表6 10批次土鱉蟲氨基酸含量的測定結(jié)果

3 討論

3.1 鹽酸濃度對氨基酸提取量的影響

由圖1可知，谷氨酸提取量隨鹽酸濃度的增加呈先上升后下降的趨勢，變化幅度較大，當(dāng)鹽酸濃度為6 mol/L時(shí)提取率達(dá)到最高。隨著鹽酸濃度增加，蛋白質(zhì)的水解程度增加，氨基酸的提取率增加，而鹽酸濃度過高時(shí)，過量的鹽酸可破壞氨基酸的結(jié)構(gòu)，從而導(dǎo)致氨基酸的提取率下降。結(jié)果表明，6 mol/L的鹽酸濃度有利于土鱉蟲中谷氨酸的提取，同時(shí)又可節(jié)省溶劑用量和生產(chǎn)成本。

3.2 料液比對土鱉蟲氨基酸提取的影響

3.3 提取時(shí)間對土鱉蟲氨基酸提取的影響

由圖3可知，隨著提取時(shí)間的增加，土鱉蟲中谷氨酸的提取量逐漸增大，當(dāng)時(shí)間為22 h時(shí)提取量最大，之后提取量有所降低，推測可能是由于經(jīng)過一定時(shí)間的提取，蛋白質(zhì)已充分消解，繼續(xù)延長提取時(shí)間會(huì)破壞氨基酸的結(jié)構(gòu)，提取量無法增加反而因長時(shí)間的作用而逐漸降低，故選時(shí)間22 h為宜。

4 結(jié)論