王 曉 茹，杜 夢(mèng) 鴿，胡 木 子，姜 珊，張 春 枝

(大連工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院,遼寧 大連 116034)

0 引 言

L-阿拉伯糖異構(gòu)酶(L-AI，EC 5.3.1.4)是一種胞內(nèi)酶，它能催化L-阿拉伯糖生成L-核酮糖，由于D-半乳糖和L-阿拉伯糖在結(jié)構(gòu)上具有相似性，因此該酶也可以將D-半乳糖催化為D-塔格糖[1]。

D-塔格糖是一種存在于自然界，但含量極少的低熱量糖，可廣泛應(yīng)用于食品和醫(yī)藥領(lǐng)域。D-塔格糖甜度為蔗糖的92%，熱量為蔗糖的1/3[2]。從甜度、口感及其他方面綜合評(píng)價(jià)，它是有可能替代蔗糖的低能量糖。2001年，美國食品和藥物管理局(FDA)確定D-塔格糖為普遍公認(rèn)安全食品(GRAS)[3]。2014年，根據(jù)《中華人民共和國食品安全法》和《新食品原料安全性審查管理辦法》有關(guān)規(guī)定，塔格糖被批準(zhǔn)為新食品原料。D-塔格糖的生產(chǎn)方法有化學(xué)合成法和生物轉(zhuǎn)化法[4]，但化學(xué)法副產(chǎn)物較多，純化困難，環(huán)境不友好。生物法轉(zhuǎn)化效率高、專一性強(qiáng)、副產(chǎn)物少、純化步驟簡單，是生產(chǎn)D-塔格糖的主要研究方向[5]。L-阿拉伯糖異構(gòu)酶轉(zhuǎn)化D-半乳糖生產(chǎn)D-塔格糖，是一種簡便、高效、環(huán)保的方法，采用食品安全菌株生產(chǎn)D-塔格糖尤為重要。實(shí)驗(yàn)室先前篩選獲得了一株產(chǎn)L-AI的乳酸菌，鑒定為短乳桿菌。本研究優(yōu)化了該菌株的培養(yǎng)條件和產(chǎn)酶條件，以期提高菌株產(chǎn)酶能力。

1 材料與方法

1.1 材 料

短乳桿菌L.brevisD-tag1(MF 465792)，實(shí)驗(yàn)室分離保藏。

固體培養(yǎng)基(%)：L-阿拉伯糖2.0，酵母浸粉0.5，牛肉膏1.0，蛋白胨1.0，乙酸鈉0.5，檸檬酸二銨0.2，K2HPO40.2，MgSO40.058；吐溫80 0.1 mL，pH 6.0～6.2，瓊脂粉2.0。121 ℃濕熱滅菌20 min。

種子培養(yǎng)基(%)：L-阿拉伯糖2.0，酵母浸粉0.5，牛肉膏1.0，蛋白胨1.0，乙酸鈉0.5，檸檬酸二銨0.2，K2HPO40.2，MgSO40.058，吐溫80 0.1 mL，pH 6.0～6.2，加入滅菌CaCO31.0。121 ℃濕熱滅菌20 min。

發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基(%)：L-阿拉伯糖0.5，乙酸鈉1.0，磷酸三鉀0.02，蛋白胨1.0，酵母浸粉1.0，MgSO40.05，pH 6.0～6.2。121 ℃濕熱滅菌20 min。

1.2 方 法

1.2.1 D-塔格糖質(zhì)量濃度的測(cè)定

采用間苯二酚顯色法測(cè)定D-塔格糖的含量[6]。取7支試管，標(biāo)準(zhǔn)品D-塔格糖終質(zhì)量濃度分別為0、10、20、30、40、50、60 μg/mL，每個(gè)試管中分別加入等量間苯二酚顯色劑，振蕩混勻，沸水浴20 min，迅速冷卻至室溫。以1號(hào)管作空白，400 nm測(cè)定吸光度。以D-塔格糖質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，不同質(zhì)量濃度下對(duì)應(yīng)顯色樣品的吸光度為縱坐標(biāo)，繪制D-塔格糖濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.2 L-AI酶活力測(cè)定

取100 mL發(fā)酵液，4 ℃，8 000 r/min，離心10 min，棄去上清，菌體沉淀用pH 6.0～7.0的磷酸鹽緩沖液洗滌兩遍，離心，菌體沉淀用于酶活力測(cè)定。

酶活力測(cè)定：菌體用1 mL 0.5 mol/L D-半乳糖懸浮，置于60 ℃恒溫水浴中振蕩反應(yīng)48 h，8 000 r/min離心10 min，取上清。適當(dāng)稀釋后取2 mL與等量間苯二酚顯色劑混合，在400 nm測(cè)定吸光度。在相同條件下，以稀釋相同倍數(shù)的0.5 mol/L D-半乳糖作為空白對(duì)照。

L-AI酶活定義：以D-半乳糖為底物，每毫升發(fā)酵液每分鐘發(fā)酵生成1 μg D-塔格糖所需的酶量為一個(gè)酶活力單位，以U/mL表示。酶活力取3次平行實(shí)驗(yàn)的平均值。

1.2.3 種子液的制備

挑取37 ℃培養(yǎng)2 d的平板上單菌落，接種于裝有50 mL種子培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，于37 ℃、180 r/min下振蕩培養(yǎng)12 h。

1.2.4 產(chǎn)酶發(fā)酵條件

將3%的種子液接種于裝有100 mL發(fā)酵液的250 mL三角瓶中，37 ℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)24 h。

1.2.5 單因素試驗(yàn)優(yōu)化產(chǎn)酶條件

發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，改變L-阿拉伯糖的添加量，其余條件不變來優(yōu)化碳源；改變氮源及其添加量，其余條件不變來優(yōu)化氮源；改變初始pH，其余條件不變優(yōu)化發(fā)酵初始pH。發(fā)酵溫度和時(shí)間的優(yōu)化采用優(yōu)化后的發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基。

1.2.6 全細(xì)胞轉(zhuǎn)化D-半乳糖制備D-塔格糖

根據(jù)全細(xì)胞轉(zhuǎn)化條件優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，9.0%的D-半乳糖10 mL，加入適量L.brevisD-tag1濕菌體，pH 7.0、55 ℃反應(yīng)48 h，測(cè)定D-塔格糖的生成量。

2 結(jié)果與討論

2.1 碳源的優(yōu)化

L-AI是短乳桿菌L.brevisD-tag1在培養(yǎng)基中含有誘導(dǎo)物時(shí)方可產(chǎn)生的誘導(dǎo)酶，因此實(shí)驗(yàn)選用L-阿拉伯糖作碳源，僅對(duì)其添加量進(jìn)行優(yōu)化。在L-阿拉伯糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.5%～2.0%進(jìn)行發(fā)酵試驗(yàn)，如圖1所示。結(jié)果表明，當(dāng)L-阿拉伯糖使用量為0.5%時(shí)，菌體生成量和酶活力均達(dá)到最大，酶活力為3.0 U/mL。

2.2 氮源的優(yōu)化

發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的氮源分別換成質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.0%的牛肉膏、蛋白胨、玉米漿、硫酸銨和尿素進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如圖2所示。從圖2可以看出，牛肉膏、蛋白胨和玉米漿明顯優(yōu)于硫酸銨和尿素，有機(jī)氮源更加適合菌體生長和產(chǎn)酶。玉米漿優(yōu)于牛肉膏和蛋白胨，這可能是因?yàn)橛衩诐{中的生物素、維生素等微量營養(yǎng)成分，更適合L.brevisD-tag1的生長和產(chǎn)酶。

圖2 氮源對(duì)菌體生長和產(chǎn)酶的影響Fig.2 Effect of nitrogen sources in cell growth and enzyme production

對(duì)玉米漿添加量進(jìn)行了優(yōu)化，如圖3所示。在玉米漿添加量1%～5%，菌體生長量隨著玉米漿用量的增加而增大，但產(chǎn)酶量卻在玉米漿用量2%時(shí)達(dá)到最大，此后不再增大。分別收集玉米漿使用量為2%和4%的菌體細(xì)胞，破壁后測(cè)定酶活力，結(jié)果后者大于前者，說明酶活力不隨菌體量增加而增大的原因可能是高濃度玉米漿中生物素含量較高，細(xì)胞膜致密，通透性差，不利于底物和產(chǎn)物的進(jìn)出。

圖3 玉米漿添加量對(duì)菌體生長和產(chǎn)酶的影響Fig.3 Effect of corn steep liquor content on cell growth and enzyme production

2.3 發(fā)酵溫度的優(yōu)化

在15～60 ℃測(cè)定L.brevisD-tag1的生長和產(chǎn)酶情況，如圖4所示。37 ℃時(shí)菌株生長和產(chǎn)酶均達(dá)到最大。但該菌株耐熱性較差，當(dāng)發(fā)酵溫度接近50 ℃時(shí)，該菌株幾乎不生長和產(chǎn)酶。

圖4 發(fā)酵溫度對(duì)菌體生長和產(chǎn)酶的影響Fig.4 Effect of fermentation temperature on cell growth and enzyme production

2.4 發(fā)酵初始pH的優(yōu)化

在初始pH 3～10測(cè)定L.brevisD-tag1的生長和產(chǎn)酶情況，如圖5所示。菌株在pH 6時(shí)生長和產(chǎn)酶均達(dá)到最大。pH低于5或高于7，生長和產(chǎn)酶量急劇下降。

圖5 發(fā)酵pH對(duì)菌體生長和產(chǎn)酶的影響Fig.5 Effect of fermentation pH on cell growth and enzyme production

2.5 L.brevis D-tag1產(chǎn)L-AI過程曲線

L.brevisD-tag1采用優(yōu)化后條件發(fā)酵60 h，測(cè)定不同時(shí)間的菌體量、酶活力和pH，如圖6所示。從圖6中可以看出，24 h菌體量和酶活力均達(dá)到最大，酶活力為6.8 U/mL，此后保持不變。發(fā)酵過程中pH呈下降趨勢(shì)，可能是發(fā)酵產(chǎn)酸所致。L-AI活力在24 h達(dá)到最大，隨后逐漸降低。主要原因不是L-AI迅速失活，而是長時(shí)間培養(yǎng)細(xì)胞膜致密，通透性降低所致。圖中還可看出，發(fā)酵初期(6 h)菌株即可產(chǎn)生L-AI，初步確定短乳桿菌L.brevisD-tag1產(chǎn)L-AI為同步合成型。

圖6 L.brevis D-tag1產(chǎn)L-AI過程曲線Fig.6 Time-course of L-AI production by Lactobacillus brevis D-tag1

2.6 L.brevis D-tag1催化D-半乳糖生成D-塔格糖

發(fā)酵液4 L，離心收獲菌體細(xì)胞，催化900 mg D-半乳糖異構(gòu)化生成390～400 mg D-塔格糖，轉(zhuǎn)化率為43%～44%。

目前報(bào)道的產(chǎn)L-AI的菌株有20多種[7-9]，但產(chǎn)酶活力不足以用于D-塔格糖的生產(chǎn)。為提高L-AI產(chǎn)量，也進(jìn)行了大腸桿菌基因工程異源表達(dá)的研究[10]。本試驗(yàn)所用L.brevisD-tag1是乳酸菌家族成員，產(chǎn)L-AI最適反應(yīng)溫度為65 ℃，最適pH為7.0，75 ℃以下、pH 6.0～9.0酶活力穩(wěn)定[11]。具有D-塔格糖生產(chǎn)潛力和良好的食品安全性。

3 結(jié) 論

采用單因素試驗(yàn)對(duì)實(shí)驗(yàn)室已篩選的L.brevisD-tag1發(fā)酵生產(chǎn)L-阿拉伯糖異構(gòu)酶條件進(jìn)行優(yōu)化，在初始pH 6.0、發(fā)酵溫度37 ℃、發(fā)酵時(shí)間24 h的最適條件下，優(yōu)化后菌株產(chǎn)酶活力為6.8 U/mL，是優(yōu)化前產(chǎn)酶能力的2.3倍。催化D-半乳糖生成D-塔格糖的轉(zhuǎn)化率為43%～44%。L.brevisD-tag1產(chǎn)L-AI為同步合成型。