黃溢問(wèn) 吳 鳳 陽(yáng) 聯(lián) 張文峰 賈家寶 孫 易 龐偉毅

(桂林醫(yī)學(xué)院公共衛(wèi)生學(xué)院，廣西桂林市 541000，電子郵箱：1278769309@qq.com)

據(jù)《全球癌癥數(shù)據(jù)2018》[1]的統(tǒng)計(jì)結(jié)果，肺癌的全球發(fā)病率和全球死亡率在所有癌癥中均居首位，其中2018年有210萬(wàn)例新發(fā)肺癌患者，180萬(wàn)例患者死于肺癌，由此可見(jiàn)該病嚴(yán)重增加了全球衛(wèi)生體系的負(fù)擔(dān)。肺癌可分為小細(xì)胞肺癌和非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)，以后者最為常見(jiàn)。以吉非替尼為代表的肺癌靶向藥物出現(xiàn)后，患者中位生存期顯著延長(zhǎng)，不良反應(yīng)也大大減少[2-3]。吉非替尼是一種表皮生長(zhǎng)因子受體(epidermal growth factor receptor,EGFR)酪氨酸激酶抑制劑(tyrosine kinase inhibitor，TKI)，可抑制腫瘤生長(zhǎng)，但由于腫瘤的異質(zhì)性等眾多因素，吉非替尼也出現(xiàn)了耐藥現(xiàn)象，但其機(jī)制至今仍未完全闡明[4]。近年來(lái)，基因芯片和測(cè)序亦作為新興技術(shù)之一，可以在極短的時(shí)間內(nèi)產(chǎn)生大量的數(shù)據(jù)；但同時(shí)這些數(shù)據(jù)也夾雜著大量的錯(cuò)誤信息，傳統(tǒng)的逐個(gè)基因的探索方法也因此顯得耗時(shí)且低效[5]。這使得學(xué)者們開(kāi)始重視信息的規(guī)范化，以及對(duì)數(shù)據(jù)的管理及分析，因此傳統(tǒng)的生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)室逐漸向生物信息學(xué)領(lǐng)域發(fā)展，也由此衍生了計(jì)算生物學(xué)、生物信息學(xué)等新型分析方法；這些方法已被用于腫瘤的分類和其相關(guān)分子機(jī)制的探索，其有效性及高效性在一定程度上規(guī)避了傳統(tǒng)生物化學(xué)方法的弊病。本研究利用基因芯片數(shù)據(jù)，運(yùn)用生物信息學(xué)工具分析肺癌耐藥相關(guān)的通路和基因，為吉非替尼耐藥機(jī)制的研究提供線索和依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 數(shù)據(jù)來(lái)源 在GEO數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)中下載基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)集GSE122005。該數(shù)據(jù)集以人NSCLC細(xì)胞HCC827作為樣本，一共6份樣本，由3份吉非替尼敏感細(xì)胞樣本(Gefitinib1、Gefitinib2、Gefitinib3)和3份獲得性吉非替尼耐藥細(xì)胞樣本(Acquired1、Acquired2、Acquired3)構(gòu)成，該基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)集采用Affymetrix公司的平臺(tái)GPL570[HG-U133_Plus_2]Affymetrix Human Genome U133 Plus 2.0 Array進(jìn)行測(cè)定。

1.2 數(shù)據(jù)質(zhì)量檢測(cè) 使用R語(yǔ)言3.5.2處理原數(shù)據(jù)集，將基因探針I(yè)D轉(zhuǎn)化為對(duì)應(yīng)的基因名稱后獲得表達(dá)矩陣，繪制表達(dá)分布圖、樣本聚類圖，并進(jìn)行主成分分析，從而進(jìn)行數(shù)據(jù)質(zhì)量分析。

1.3 差異表達(dá)基因的篩選 使用R語(yǔ)言的Limma包對(duì)表達(dá)矩陣進(jìn)行差異分析，并篩選出差異表達(dá)基因。

1.4 差異表達(dá)基因的富集及通路分析 使用在線工具DAVID 6.7(https://david.ncifcrf.gov/)和KOBAS 3.0(https://kobas.cbi.pku.edu.cn/kobas3)，導(dǎo)入差異表達(dá)基因，查看并導(dǎo)出基因本體論(Gene Ontology,GO)富集分析和京都基因與基因組百科全書(shū)(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)信號(hào)通路分析結(jié)果[6]。

1.5 蛋白質(zhì)互相作用網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 將差異表達(dá)基因批量導(dǎo)入在線工具STRING 11.0(https://string-db.org/)，生成并導(dǎo)出蛋白質(zhì)互相作用(protein-protein interaction,PPI)網(wǎng)絡(luò)，使用CytoScape 3.7.1中的cytoHubba插件計(jì)算每個(gè)節(jié)點(diǎn)的核心程度，根據(jù)評(píng)分進(jìn)行排名，取排名前10的基因作為關(guān)鍵基因。

1.6 生存曲線分析 選取關(guān)鍵基因，以基因的中位表達(dá)水平作為分組界限，以總生存期作為統(tǒng)計(jì)指標(biāo)，利用在線工具Kaplan-Meier Plotter(http://www.kmplot.com/)繪制不同基因表達(dá)水平的NSCLC患者的生存曲線。

2 結(jié) 果

2.1 數(shù)據(jù)質(zhì)量的檢測(cè)結(jié)果 數(shù)據(jù)集的表達(dá)分布圖顯示各樣本的表達(dá)量恒定，樣本聚類圖、主成分分析可以清晰地區(qū)分出非替尼敏感細(xì)胞樣本(Gefitinib1、Gefitinib2、Gefitinib3)和獲得性吉非替尼耐藥細(xì)胞樣本(Acquired1、Acquired2、Acquired3)。見(jiàn)圖1。

圖1 吉非替尼敏感細(xì)胞樣本和耐藥細(xì)胞樣本的芯片數(shù)據(jù)質(zhì)量檢測(cè)

2.2 差異表達(dá)基因的篩選結(jié)果 本研究以調(diào)整后P值≤0.01、|log2FC|≥1.5作為篩選差異表達(dá)基因的條件，最終獲得604個(gè)差異表達(dá)基因，其中表達(dá)上調(diào)基因332個(gè)，表達(dá)下調(diào)基因272個(gè)，見(jiàn)圖2。

圖2 兩個(gè)樣本間差異表達(dá)基因的火山圖

2.3 GO富集分析結(jié)果 以P<0.01作為檢驗(yàn)水準(zhǔn)，結(jié)果共富集到98項(xiàng)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的GO條目。其中，涉及9種分子功能，包括生長(zhǎng)因子結(jié)合、糖蛋白結(jié)合等；17種細(xì)胞組成，包括核小體、細(xì)胞外空隙、細(xì)胞外區(qū)域部分、質(zhì)膜部分等; 72種生物過(guò)程，包括核小體裝配、創(chuàng)傷反應(yīng)等。見(jiàn)表1。

表1 差異表達(dá)基因的部分GO富集分析結(jié)果

2.4 KEGG信號(hào)通路分析結(jié)果 以調(diào)整后P值<0.01作為檢驗(yàn)水準(zhǔn)，共發(fā)現(xiàn)37條通路具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，包括癌癥中的轉(zhuǎn)錄失調(diào)、腫瘤壞死因子信號(hào)通路等。見(jiàn)表2。

表2 差異表達(dá)基因的部分KEGG信號(hào)通路分析

2.5 PPI網(wǎng)絡(luò) PPI網(wǎng)絡(luò)中共有555個(gè)節(jié)點(diǎn)，1 446個(gè)相互作用，見(jiàn)圖3；排名前10的基因包括C-X-C基序趨化因子配體[chemokine(C-X-C motif)ligand,CXCL]8、Erb-B2受體酪氨酸激酶(Erb-B2 receptor tyrosine kinase 2,ERBB2)、組織金屬蛋白酶抑制劑1(tissue inhibitor of metalloproteinases 1,TIMP1)、分泌性磷蛋白(secreted phosphoprotein 1，SPP1)、CXCL1、鈣黏著蛋白2(cadherin 2,CDH2)、C-C基序趨化因子配體[chemokine(C-C motif)ligand,CCL]2、內(nèi)皮素1(endothelin 1，EDN1)、CCL20、集落刺激因子2(colony-stimulating factor 2,CSF2)，見(jiàn)圖4。

圖3 差異表達(dá)基因的PPI網(wǎng)絡(luò)

圖4 關(guān)鍵基因

2.6 生存分析結(jié)果 Kaplan-Meier Plotter分析結(jié)果顯示，與預(yù)后相關(guān)的基因包括CXCL8、EDN1、SPP1、TIMP1，log-rank檢驗(yàn)提示均P<0.01，見(jiàn)圖5。CXCL8、SPP1、TIMP1高表達(dá)或EDN1低表達(dá)的NSCLC患者，總生存期更短，預(yù)后較差；與差異分析結(jié)果進(jìn)行對(duì)比，在耐藥細(xì)胞中CXCL8、SPP1、TIMP1為表達(dá)上調(diào)基因，EDN1為表達(dá)下調(diào)基因。

圖5 生存曲線

3 討 論

吉非替尼等EGFR-TKI藥物的出現(xiàn)極大地改善了EGFR變異的NSCLC患者的生存狀況，然而如大多數(shù)腫瘤一樣，NSCLC對(duì)吉非替尼也產(chǎn)生了耐藥性。耐藥的產(chǎn)生是一個(gè)多因素誘導(dǎo)的復(fù)雜過(guò)程，有文獻(xiàn)表明，最早發(fā)現(xiàn)的耐藥機(jī)制與EGFR二次突變(T790M突變等)有關(guān)，其中超過(guò)一半的EGFR-TKI變異所致耐藥病例為T790M突變；此外，選擇性旁路的激活、下游目標(biāo)的激活和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化也被證實(shí)與吉非替尼耐藥存在一定相關(guān)性[7]。

本研究共篩選出與NSCLC對(duì)吉非替尼耐藥有關(guān)的差異表達(dá)基因604個(gè)，其中表達(dá)上調(diào)基因332個(gè)，表達(dá)下調(diào)基因272個(gè)。利用篩選出的差異表達(dá)基因進(jìn)行富集分析和通路分析，結(jié)果顯示這些差異基因主要參與生長(zhǎng)因子結(jié)合、糖蛋白結(jié)合、磷脂轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性、脂質(zhì)結(jié)合、脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性等分子功能，參與氧水平反應(yīng)、創(chuàng)傷反應(yīng)、系統(tǒng)過(guò)程的調(diào)控、核小體裝配、激素刺激反應(yīng)等生物過(guò)程，其細(xì)胞組分主要有細(xì)胞外間隙、核小體、質(zhì)膜部分、細(xì)胞外區(qū)域部分、細(xì)胞碎片等；信號(hào)通路分析顯示代謝途徑、癌癥通路、補(bǔ)體系統(tǒng)、癌癥中的轉(zhuǎn)錄失調(diào)、腫瘤壞死因子等與吉非替尼耐藥有關(guān)，但仍需進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)研究以證實(shí)。

根據(jù)PPI網(wǎng)絡(luò)獲得10個(gè)核心基因，包括CXCL8、ERBB2、TIMP1、SPP1、CXCL1、CDH2、CCL2、EDN1、CCL20、CSF2。(1)CDH2與多種腫瘤進(jìn)展、轉(zhuǎn)移有關(guān)。肺鱗癌和肺腺癌有著完全不一樣的預(yù)后結(jié)局，有學(xué)者對(duì)肺腺癌和肺鱗癌之間的表達(dá)差異蛋白質(zhì)進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，CDH2在肺腺癌中顯著上調(diào)，而在肺腺癌的血管內(nèi)皮細(xì)胞中上調(diào)更為顯著；肺腺癌血管生成現(xiàn)象明顯，絲裂原活化蛋白激酶/胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶和絲裂原活化蛋白激酶/c-Jun氨基末端激酶信號(hào)通路可能在CDH2誘導(dǎo)的低氧誘導(dǎo)因子1α和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子介導(dǎo)的血管生成過(guò)程中扮演重要角色，這可能是肺腺癌總生存期相對(duì)較短的原因[8]。(2)ERBB2和EGFR類似，都是生長(zhǎng)因子受體酪氨酸激酶亞家族的成員，也是乳腺癌和卵巢癌的高危基因。臨床上約有10%的肺腺癌患者存在REBB2突變，該型患者的預(yù)后差，生存期短[9]。(3)SPP1又稱骨橋蛋白，基因定位于人染色體4q上，主要參與調(diào)節(jié)生理過(guò)程，如發(fā)育、分化、炎癥和傷口愈合[10]，其表達(dá)對(duì)多種癌癥的發(fā)生和轉(zhuǎn)移有重大意義，如肺癌、卵巢癌、胃腸癌、前列腺癌等，且可以作為NSCLC分期和預(yù)后評(píng)估的指標(biāo)，其中SPP1高表達(dá)的NSCLC患者預(yù)后較差[11]。(4)EDN1是促炎性細(xì)胞因子，具有血管收縮活性、促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)合成的作用，在器官纖維化和氧化應(yīng)激方面也起著很重要的作用[12-13]。由于EDN1能誘導(dǎo)黑色素瘤細(xì)胞凋亡，以及前列腺癌中EDN1受體沉默，故有學(xué)者推測(cè)EDN1表達(dá)量的降低有利于腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)[14]。目前已有生物信息學(xué)分析結(jié)果提示EDN1與NSCLC的發(fā)生機(jī)制有密切關(guān)系[15]，但尚無(wú)與吉非替尼耐藥相關(guān)性的證據(jù)。(5)TIMP 是基質(zhì)金屬蛋白酶的抑制因子，作用于細(xì)胞外基質(zhì)，減少基質(zhì)金屬蛋白酶的降解，增強(qiáng)細(xì)胞間粘連，與腫瘤的轉(zhuǎn)移和患者預(yù)后相關(guān)[16]。TIMP1是其成員之一，其靶分子為基質(zhì)金屬蛋白酶1。在臨床中高表達(dá)TIMP1常常是多種腫瘤預(yù)后不良的征象[17]，但同屬于一個(gè)家族的TIMP2的高水平表達(dá)卻提示預(yù)后良好，惡性程度較低[18]。(6)CCL2、CCL20、CXCL1、CXCL8都是趨化因子的成員。CCL2是趨化因子CC亞家族成員之一，是一類在人體的生理機(jī)能中發(fā)揮著重要作用的小分子蛋白，多由免疫細(xì)胞和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞等分泌，具有化學(xué)趨化活性。近年來(lái)，有研究表明CCL2受到血小板源性生長(zhǎng)因子的自分泌回路調(diào)控，導(dǎo)致腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)基因表達(dá)量的增加，從而增強(qiáng)腫瘤的侵襲性[19]。CCL20 可以自分泌的方式通過(guò)絲裂原活化蛋白激酶和磷脂酰肌醇 3-激酶信號(hào)通路，與腫瘤細(xì)胞增殖及擴(kuò)散有關(guān)[20]，高水平表達(dá)的CCL20與肺癌患者預(yù)后不良有關(guān)[21]。CXCL1 在肺癌組織中通常呈高表達(dá)，隨著其表達(dá)量升高，腫瘤相關(guān)中性粒細(xì)胞數(shù)量增加并浸潤(rùn)肺癌組織，從而促使腫瘤生長(zhǎng)[22]。有研究顯示，在合并惡性胸腔積液的NSCLC患者中，T細(xì)胞數(shù)量和CXCL1水平顯著增高；CXCL1的表達(dá)受到微小RNA-141調(diào)控，微小RNA-141通過(guò)微小RNA-141-CXCL1-CXCR2通路可調(diào)控T細(xì)胞向胸腔積液轉(zhuǎn)移[23]。CXCL8 主要作用于C-X-C基序趨化因子受體1 和2、達(dá)菲抗原趨化因子受體，其也與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)[24]。由此可見(jiàn)，上述差異表達(dá)的核心基因都與肺癌等多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、預(yù)后相關(guān)。此外，我們還在生存分析中發(fā)現(xiàn)CXCL8、SPP1、TIMP1高表達(dá)和EDN1低表達(dá)的NSCLC患者總生存期短于相應(yīng)的低表達(dá)組或高表達(dá)組，這4個(gè)基因在預(yù)后較差組的表達(dá)水平恰好與耐藥樣本的表達(dá)水平相一致(同為高表達(dá)或同為低表達(dá))，提示了CXCL8、SPP1、TIMP1和EDN1可能在吉非替尼耐藥機(jī)制中發(fā)揮重要作用。但是目前尚無(wú)相關(guān)研究報(bào)告其中的作用機(jī)制；同時(shí)在吉非替尼耐藥的機(jī)制中，有關(guān)這些基因或蛋白的研究也相對(duì)較少。因此本研究結(jié)果雖然提示這些差異表達(dá)的基因在吉非替尼耐藥機(jī)制中可能扮演重要角色，但其中的作用機(jī)制還需進(jìn)一步研究以探討。

綜上所述，本研究篩選出的差異表達(dá)基因中，CXCL8、SPP1、TIMP1、EDN1可能在NSCLC對(duì)吉非替尼耐藥的機(jī)制中起重要作用，但具體的作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。本研究結(jié)果存在一定局限性：所分析的樣本僅來(lái)源于細(xì)胞，樣本量少，且僅從計(jì)算生物學(xué)方法的角度進(jìn)行分析，因而所得差異表達(dá)基因在NSCLC對(duì)吉非替尼耐藥中的作用還需進(jìn)一步研究驗(yàn)證。