夏 劍 楊 敏 趙 剡

(1 武漢大學(xué)中南醫(yī)院急救中心，2 湖北省急救與復(fù)蘇臨床醫(yī)學(xué)研究中心，武漢市 430071，電子郵箱：jianjian_1998@sina.com)

心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧在臨床上非常多見，如心肺復(fù)蘇術(shù)后以及感染性休克、各種原因心力衰竭導(dǎo)致低心排、心肌梗死等治療后。多項(xiàng)研究顯示，復(fù)氧后的心肌細(xì)胞出現(xiàn)損傷表現(xiàn)，導(dǎo)致部分細(xì)胞發(fā)生凋亡[1-2]，從而影響了心肌的協(xié)調(diào)性和順應(yīng)性，引起心肌運(yùn)動(dòng)功能異常，最終影響心肌的泵血功能，嚴(yán)重情況下可出現(xiàn)心力衰竭，影響患者后期生活質(zhì)量。脂氧素A4(lipoxin A4，LXA4)作為脂氧素家族的一員，參與機(jī)體細(xì)胞的各項(xiàng)調(diào)節(jié)作用，包括細(xì)胞凋亡、增殖趨化、免疫調(diào)節(jié)等[3-5]。本實(shí)驗(yàn)旨在探討LXA4是否可以通過結(jié)合其相關(guān)受體來調(diào)節(jié)缺氧/復(fù)氧過程中心肌細(xì)胞的凋亡，減少心肌細(xì)胞的損傷，從而起到保護(hù)心肌細(xì)胞的作用。

1 材料和方法

1.1 材料與儀器 大鼠心肌細(xì)胞H9C2(美國(guó)菌種保藏中心)；杜氏改良伊格爾培養(yǎng)基(Dulbecco′s modified Eagle medium，DMEM,Gibco Invitrogen公司,批號(hào)：11965092)；臺(tái)氏液(Procell公司，批號(hào)：PH19JAN019)；LXA4(Sigma-Aldrich公司,批號(hào)：L0521)；TRIzol試劑(Aidlab公司，批號(hào)：252250AX)，反轉(zhuǎn)錄試劑(GeneCopoeia公司，批號(hào)：R101-01/02)；cDNA合成試劑盒(賽默飛公司，批號(hào)：K1672)。ABI7900實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(ABI公司)。TUNEL細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(Abcam公司,批號(hào)：ab66110);大鼠甲?；氖荏w(formyl peptide receptor，F(xiàn)PR)2上游引物(5′-GCCAACTATTCCGTCCCTCT-3′)和下游引物(5′-CGGAATCCAGCTACCCAGAT-3′)、內(nèi)參基因甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)上游引物(5′-ACAGCAACAGGGTGGTGGAC-3′)和下游引物(5′-TTTGAGGGTGCAGCGAACTT-3′)由擎科生物技術(shù)有限公司合成。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)：將大鼠心肌細(xì)胞系H9C2細(xì)胞置于含有10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 μg/mL四環(huán)素的DMEM中培養(yǎng)2 h,每隔24 h更換培養(yǎng)液1次，每2～3 d傳代1次。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞(2×107個(gè)/L)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧模型的建立：向瓶底覆蓋有單層心肌細(xì)胞的培養(yǎng)瓶中加入用混合氮?dú)?95% N2和5% CO2)飽和30 min的臺(tái)氏液2 mL(PO2≤0.67 kPa)，向瓶中充入混合氮?dú)庖灾脫Q瓶中剩余的空氣，封閉瓶口密閉3 h，此期為缺氧期。隨后加入經(jīng)混合空氣(95%含量空氣和5%含量CO2)飽和的含15%胎牛血清的DMEM 2 mL(PO2在17.33～20.00 kPa之間)，并持續(xù)向瓶中通入低流量(3 L/min)混合空氣2 h，此期為復(fù)氧期，以此達(dá)到缺氧/復(fù)氧損傷的目的。

1.2.3 實(shí)驗(yàn)分組:將細(xì)胞分為3組，每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔。(1)空白對(duì)照組，不做缺氧處理；(2)缺氧/復(fù)氧組，僅給予缺氧/復(fù)氧處理；(3)LXA4處理組，在缺氧/復(fù)氧處理后正常培養(yǎng)條件下培養(yǎng)24 h，然后給予10 nmol/L的LXA4處理12 h。

1.2.4 FPR2 mRNA表達(dá)水平的檢測(cè):運(yùn)用TRIzol法(Aidlab，252250AX)提取各組每孔細(xì)胞的RNA后，將其反轉(zhuǎn)錄成cDNA(GeneCopoeia，R101-01/02)。取cDNA，以GAPDH為內(nèi)參進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR，反應(yīng)體系包括cDNA(10×稀釋)4 μL、上游引物(100 μM)0.4 μL、下游引物(100 μM)0.4 μL、SYBR Green/Flourescein qPCR Master Mix(2×)10 μL、H2O25.2 μL；反應(yīng)條件為50℃ 2 min,95℃ 10 min；95℃ 30 s，60℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)，采集溶解曲線。以2-ΔΔCt法計(jì)算FPR2 mRNA的相對(duì)表達(dá)量。

1.2.5 心肌細(xì)胞的凋亡檢測(cè):將無菌玻片放在細(xì)胞培養(yǎng)板中，24 h后光鏡下觀察細(xì)胞爬片狀態(tài)，將爬好細(xì)胞的玻片浸入4%的多聚甲醛(pH 7.4)溶液中室溫固定25 min，隨后用磷酸緩沖鹽溶液洗滌3次，5 min/次。將細(xì)胞爬片浸入用磷酸緩沖鹽溶液配制的0.1%的Triton X-100溶液中2 min(冰上操作)，隨后用磷酸緩沖鹽溶液洗滌2次，5 min/次。按照TUNEL檢測(cè)試劑盒說明書操作對(duì)心肌細(xì)胞進(jìn)行染色，然后在熒光顯微鏡(奧林巴斯BX53型生物顯微鏡)下觀察并采集圖像，綠色為凋亡細(xì)胞，在400倍視野下觀察4個(gè)視野并計(jì)算凋亡指數(shù)(凋亡細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以(x±s)表示，組間比較采用單因素方差分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 3組細(xì)胞FPR2 mRNA表達(dá)量的比較 空白對(duì)照組、缺氧/復(fù)氧組、LXA4處理組FPR2 mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為1.15±0.14、0.52±0.10、0.81±0.09，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=23.737，P=0.014)。缺氧/復(fù)氧組、LXA4處理組、空白對(duì)照組的mRNA相對(duì)表達(dá)量依次升高(均P<0.05)。

2.2 3組心肌細(xì)胞的凋亡情況比較 空白對(duì)照組中可見綠色熒光的少量凋亡心肌細(xì)胞，而LXA4處理組中凋亡心肌細(xì)胞較空白對(duì)照組稍有增加，但明顯少于缺氧/復(fù)氧組(見圖1)。空白對(duì)照組、缺氧/復(fù)氧組、LXA4處理組的凋亡指數(shù)分別為7.14±0.38、24.34±1.27、12.34±1.09，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=237.767,P<0.001)，缺氧/復(fù)氧組、LXA4處理組、空白對(duì)照組細(xì)胞的凋亡指數(shù)依次降低(均P<0.05)。

圖1 各組心肌細(xì)胞的凋亡情況(×200)

3 討 論

心肌細(xì)胞缺血后主要導(dǎo)致心肌細(xì)胞的供氧缺乏，在復(fù)氧后隨之出現(xiàn)心肌細(xì)胞代謝紊亂、細(xì)胞內(nèi)離子失衡、線粒體損傷等表現(xiàn)，從而導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)各細(xì)胞器損傷及功能障礙，誘導(dǎo)凋亡通路激活后將出現(xiàn)心肌細(xì)胞凋亡。目前，研究表明多個(gè)信號(hào)通路及凋亡因子均參與了凋亡的發(fā)生及發(fā)展過程，包括B細(xì)胞淋巴瘤-2、磷酸化B淋巴細(xì)胞瘤-2基因相關(guān)啟動(dòng)子、絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)、胞內(nèi)磷脂酰肌醇激酶/蛋白激酶B、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3等[6-7]。

LXA4作為脂氧素家族的一員，可通過結(jié)合其受體發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)。其主要的受體包括脂氧素受體(lipoxin A4 receptor,ALX)、芳烴受體以及半胱氨酸白三烯受體。ALX為FPR家族成員之一，F(xiàn)PR包括FPR1、FPR2和FPR33個(gè)成員，其中鼠科FPR2/3與人FPR2同源[8]，LXA4可通過結(jié)合FPR2來影響MAPK信號(hào)通路的亞族p38和c-Jun氨基末端激酶的磷酸化，而這兩者的信號(hào)通路控制著相關(guān)細(xì)胞凋亡和細(xì)胞自噬的平衡[9-10]，因此，LXA4有可能通過結(jié)合FPR2啟動(dòng)MAPK信號(hào)通路，從而影響心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。目前，大量研究提示LXA4可通過與其特異性受體FPR2的結(jié)合影響腸黏膜細(xì)胞、肝臟細(xì)胞、肺泡細(xì)胞、各種類白細(xì)胞、牙周韌帶細(xì)胞等多系統(tǒng)細(xì)胞的凋亡及炎癥反應(yīng)[11]，也有研究提表明LXA4通過影響心肌細(xì)胞鉀離子通道、血紅素加氧酶1、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、T-黏鈣蛋白等起到調(diào)節(jié)缺氧/復(fù)氧后的心肌細(xì)胞凋亡情況[12]。但是目前LXA4是否通過結(jié)合其特異性FPR2對(duì)缺氧/復(fù)氧后的心肌細(xì)胞起到相關(guān)作用，并沒有相關(guān)的系統(tǒng)研究報(bào)告。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，給予缺氧/復(fù)氧處理后，大鼠心肌細(xì)胞系H9C2細(xì)胞FPR2 mRNA的表達(dá)降低，而應(yīng)用LXA4干預(yù)缺氧/復(fù)氧的心肌細(xì)胞后，細(xì)胞中FPR2 mRNA的表達(dá)量升高，且細(xì)胞凋亡指數(shù)亦低于缺氧/復(fù)氧組，其凋亡趨勢(shì)與FPR2 mRNA在心肌細(xì)胞的表達(dá)是一致的，這提示LXA4可減少由心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，其可能通過結(jié)合大鼠心肌細(xì)胞系H9C2細(xì)胞上的FPR2來達(dá)到調(diào)節(jié)作用。因此，LXA4對(duì)缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡而導(dǎo)致的心肌損傷或有一定的治療作用。但是LXA4結(jié)合FPR2后影響的凋亡信號(hào)通路是p38和(或)c-Jun氨基末端激酶相關(guān)通路，目前還尚未完全清楚，需要進(jìn)一步研究。

綜上所述，LXA4的特異性受體FPR2在心肌細(xì)胞有表達(dá)，LXA4可能通過與FPR2結(jié)合調(diào)控缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡信號(hào)通路，亦抑制心肌細(xì)胞凋亡，從而起到保護(hù)心肌損傷的作用。