吳維圣，張照慶，吳曦

（1.湖北中醫(yī)藥大學針灸骨傷學院，湖北 武漢 430000 ；2.湖北省十堰市人民醫(yī)院中西醫(yī)結合科，湖北 十堰 442000；3.武漢市第三醫(yī)院疼痛科，湖北 武漢 430000 ）

0 引言

臭氧在醫(yī)學領域應用的深度和廣度日益增加，臭氧灌腸在炎癥性腸病上可發(fā)揮積極作用[1]，但其機制及安全性均不明確。因臭氧的強氧化性，其灌腸后是否對腸道組織及大便性狀、球桿比等產(chǎn)生負面影響目前尚無深入研究。本研究采用不同濃度臭氧對正常大鼠進行灌腸，觀察臭氧灌腸對大鼠腸道組織及及大便性狀、球桿比的影響。

1 材料與方法

1.1 6月齡SPF級雄性大鼠（體重394.8±18.7g）40只（購自湖北省疾病控制中心動物中心），分籠飼養(yǎng)，水、飼料、光照、濕度均符合SPF實驗室標準條件，適應性飼養(yǎng)5天后，按隨機分段數(shù)字表法分為A、B、C、D組，每組各10支（其中B組大鼠實驗中死亡一只，原因不明）。A、B、C組分別每日接受20ug/mL、40ug/mL、56ug/mL常壓下臭氧與空氣混合氣體3mL（德國赫爾曼臭氧發(fā)生器）灌腸，連續(xù)15天；D組：每日接受常壓下空氣3mL灌腸。

1.2 所有動物于第16日收集糞便：實驗者一人固定大鼠，另一人輕柔的對大鼠腹部進行按摩，約3分鐘左右，大鼠自行排便，直接將糞便收集于無菌便盒內(nèi)，1小時內(nèi)送檢，每日收集1次，連續(xù)3日。

1.3 所有動物于第19日采用水合氯醛過度麻醉處死，處死后立即打開腹腔，并于距離肛門3cm處截取腸道5cm，立即預冷PBS沖洗，并置于10%中性甲醛溶液中固定。1.1-1.3操作均于每日上午9時開始執(zhí)行，操作者均具備動物實驗資格。

1.4 觀察大便的顏色、外觀、性狀；稀釋糞便直接涂片法涂片；革蘭氏染色；油鏡（10×100）下觀察并記錄視野內(nèi)細菌總數(shù)、革蘭氏陰性桿菌/球菌數(shù)、革蘭氏陽性桿菌/球菌數(shù)；計算每500細菌中革蘭氏球菌/桿菌數(shù)量及球桿菌比值。

1.5 腸道組織甲醛固定48小時后，依次酒精梯度脫水、二甲苯透明、石蠟包埋、切片（6μm）、脫蠟HE染色、再次脫水透明，后封片，光鏡下觀察（4×10、10×10）腸道黏膜、腸腺細胞、杯狀細胞、炎性細胞及平滑肌細胞形態(tài)、數(shù)量變化。

1.6 計量資料采用均數(shù)±標準差表示，組間采用單因素方差分析，組內(nèi)采用t檢驗，計數(shù)資料采用卡方檢驗。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 大鼠大便外觀形狀

黃色條形軟便，C組大鼠糞便少許脂肪球，其余各組光鏡下無明顯異常。

2.2 大鼠大便球菌桿菌比值

見表1 、圖1。

大鼠腸道HE染色：各組在4×10、10×10視野下腸道黏膜完整、腸腺細胞未見明顯增生或化生、杯狀細胞無明顯增加或減少、炎性細胞無明顯浸潤、平滑肌細胞形態(tài)亦無明顯改變（C組1例出現(xiàn)少許炎性細胞浸潤）（見表2）。

表1 各組大鼠糞便總細菌數(shù)、球菌、桿菌數(shù)量及球桿比

圖1 各組大鼠糞便總細菌數(shù)、球菌、桿菌數(shù)量及球桿比柱狀圖

圖2 A組腸道HE染色（4×10）

圖3 A組腸道HE染色（10×10）

圖4 B組腸道HE染色（4×10）

圖5 B組腸道HE染色（10×10）

圖6 C組腸道HE染色（4×10）

圖7 C組腸道HE染色（10×10）

圖8 D組腸道HE染色（4×10）

圖9 D組腸道HE染色（10×10）

表2 各組HE染色形態(tài)學改變

3 討論

人們對臭氧的關注起初始于大氣污染及溫室效應[2,3]。隨著上世紀80年代末期，其逐漸應用于臨床，尤其是其在頸、腰椎間盤突出癥中應用的杰出表現(xiàn)[4]，人們逐漸開始在各個領域?qū)︶t(yī)用臭氧開展廣泛研究，如除菌[5]、神經(jīng)修復再生[6,7]、腎臟機械損傷[8]、腸道缺血再灌注損傷[9]、惡性腫瘤[10]等領域。因臭氧的強氧化性，其本質(zhì)上有較強毒性[11]，故其在臨床應用安全性值得高度注意[12]，但目前其安全性實驗開展較少，其臨床循證證據(jù)亦不充分。

本實驗基于醫(yī)用臭氧灌腸在腸道疾病中的有效性，開展其安全性實驗，觀察臭氧灌腸對腸道組織的影響，并判斷其對糞便球桿比影響。實驗結果證實15天的臭氧灌腸對大鼠的腸道組織并無明顯影響，未發(fā)現(xiàn)因強氧化導致的各層組織水腫、炎癥、壞死，甚至腸道絨毛在普通光鏡下亦未發(fā)現(xiàn)明顯損害表現(xiàn)，考慮可能與腸上皮排列緊密及腸道表面分泌物保護有關。細菌總數(shù)有統(tǒng)計學差異，可能與臭氧的抗菌作用有關。但大便球桿比亦未發(fā)生明顯改變，大便球桿比與腸道內(nèi)菌群構成、腸道免疫功能密切相關[13]，大便球桿比無顯著差異，可在初步認為臭氧灌腸對腸道內(nèi)微生物群影響不大。

臭氧灌腸后分解生成活性氧，隨即會發(fā)生一系列氧化應激級聯(lián)反應并引起多個信號軸“交談”（crosstalk），這些信號分子如SOD、Nrf2/ARE、IP3/PKB等本實驗尚未涉及，將在后續(xù)試驗中進一步深入研究。