于 卓 良，李 德 陽(yáng)，陰 法 文,2，周 大 勇,2

(1.大連工業(yè)大學(xué) 食品學(xué)院,遼寧 大連 116034；2.大連工業(yè)大學(xué) 國(guó)家海洋食品工程技術(shù)研究中心,遼寧 大連 116034)

0 引 言

口蝦蛄(Oratosquillaoratoria)作為甲殼綱、口足目動(dòng)物的代表物種，在我國(guó)沿海水域廣泛分布[1]?？谖r蛄風(fēng)味獨(dú)特，并富含蛋白質(zhì)、磷、微量元素以及人體必需氨基酸，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高[2]。在蝦類(lèi)的加工過(guò)程中，占整蝦質(zhì)量45%～60%的副產(chǎn)物被浪費(fèi)或者低效利用[3]。為了減少環(huán)境污染，提高加工產(chǎn)業(yè)的經(jīng)濟(jì)效益，近幾年來(lái)關(guān)于各種甲殼類(lèi)動(dòng)物副產(chǎn)物中蛋白質(zhì)(肽)、殼聚糖及蝦青素的開(kāi)發(fā)利用研究常被報(bào)道[4-7]。

海洋蝦類(lèi)脂質(zhì)中富含n-3 PUFA[8]，尤其是二十碳五烯酸(EPA，20：5n-3)和二十二碳六烯酸(DHA，22：6n-3)，在人類(lèi)營(yíng)養(yǎng)、疾病預(yù)防和保健中起著至關(guān)重要的作用[9-10]。食品中的n-3 PUFA主要以甘油三酯(TAG)和磷脂(PL)形式存在。與TAG型n-3 PUFA相比，PL型的n-3 PUFA因具有更高的生物利用度、組織輸送能力和生物活性而受到越來(lái)越多的關(guān)注[11-12]。研究表明，口蝦蛄脂質(zhì)中富含n-3 PUFA[13]，然而對(duì)于其可食部位以及副產(chǎn)物中磷脂分子種類(lèi)的詳細(xì)描述尚未見(jiàn)報(bào)道。

本研究主要表征口蝦蛄肌肉和副產(chǎn)物的脂質(zhì)特征，包括脂質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)、蝦青素質(zhì)量分?jǐn)?shù)、脂質(zhì)組成、磷脂組成、脂肪酸組成以及磷脂分子種等脂質(zhì)信息，為深入揭示口蝦蛄的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值以及口蝦蛄加工副產(chǎn)物的開(kāi)發(fā)利用前景提供參考。

1 材料和方法

1.1 材 料

新鮮口蝦蛄(Oratosquillaoratoria)，30～35只/kg，雌雄各半，無(wú)子，大小均一，大連新長(zhǎng)興水產(chǎn)品市場(chǎng)；甘油磷脂標(biāo)準(zhǔn)品，美國(guó)Avanti Polar Lipids公司；甲醇、氯仿、乙腈、正己烷、二氯甲烷等，色譜級(jí)，美國(guó)Spectrum Chemical公司；氘代氯仿、氘代甲醇、磷酸三乙酯、碳酸銫、重水，上海阿拉丁試劑有限公司；其他分析級(jí)試劑，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

2KBTES-55冷凍干燥機(jī)，美國(guó)VirTis公司；Iatroscan MK-6S棒狀薄層色譜-氫火焰離子化檢測(cè)器，日本Iatron公司；Avance Ⅲ 400MHz Bruker核磁共振波譜儀，德國(guó)Bruker公司；Agilent 7890A氣相色譜串聯(lián)5977A質(zhì)譜檢測(cè)器，美國(guó)Agilent公司；Shimadzu LC-20AD高效液相色譜串聯(lián)SPD-M20A DAD檢測(cè)器，日本Shimadzu公司；API 4000 Qtrap三重四極桿線性離子阱(QqLIT)質(zhì)譜儀，美國(guó)AB Sciex公司。

1.3 方 法

1.3.1 樣品處理

將3 kg口蝦蛄手工分為肌肉與副產(chǎn)物(頭部、甲殼和尾部)兩部分后冷凍干燥72 h，經(jīng)高速粉碎機(jī)粉碎后得到口蝦蛄肌肉和副產(chǎn)物干粉，真空密封后在-30 ℃冰箱中冷藏備用。

1.3.2 總脂提取

根據(jù)Blight等[14]的方法，分別提取口蝦蛄副產(chǎn)物與肌肉干粉的總脂，在-80 ℃下貯藏，并在兩周內(nèi)用以分析檢測(cè)。

1.3.3 脂質(zhì)組成分析

采用MK-6S棒狀薄層色譜-氫火焰離子化檢測(cè)器(TLC-FID)對(duì)脂質(zhì)組成進(jìn)行測(cè)定[15]。檢測(cè)參數(shù)：氫氣體積流量160 mL/min，空氣體積流量2 L/min，掃描速度每根色譜棒30 s，利用分析軟件采用歸一化方法計(jì)算各組分相對(duì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

1.3.4 脂肪酸分析

采用GC-MS聯(lián)用儀，配置HP-5-MS石英毛細(xì)管柱(30 m×0.25 mm，0.25 μm)對(duì)脂肪酸組成和相對(duì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)進(jìn)行測(cè)定[15]。載氣為氦氣，壓力保持在48.95 kPa。進(jìn)樣量1 μL，分流比50∶1。MS條件為EI源(70 eV)，溶劑延遲4 min。脂肪酸甲酯通過(guò)比較保留時(shí)間，標(biāo)準(zhǔn)品和NIST08質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫(kù)來(lái)鑒定，并通過(guò)峰面積歸一化計(jì)算脂肪酸相對(duì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

1.3.5 磷脂組成分析

采用核磁共振波譜儀(31P-NMR)檢測(cè)磷脂類(lèi)組成[16]，使用MestReNova 6.1.1軟件對(duì)各磷脂成分的峰進(jìn)行積分。利用積分后峰面積與標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)比，通過(guò)歸一化對(duì)磷脂組成進(jìn)行量化得到摩爾分?jǐn)?shù)。

1.3.6 蝦青素質(zhì)量分?jǐn)?shù)的測(cè)定

采用LC-SPD對(duì)蝦青素質(zhì)量分?jǐn)?shù)進(jìn)行測(cè)定[17-18]，配置C18反相色譜柱(4.6 mm×250 mm)。梯度洗脫分兩相進(jìn)行：體積比85.0∶5.0∶4.5∶5.5的甲醇、二氯甲烷、水、乙腈溶液A；體積比28.0∶22.0∶4.5∶45.5的甲醇、二氯甲烷、水、乙腈溶液B。洗脫程序：0～8 min，不加溶液B；8～32 min，0～100%溶液B；進(jìn)樣量10 μL；總體積流量1 mL/min；柱溫25 ℃；在220～650 nm范圍內(nèi)進(jìn)行三維色譜分析；測(cè)定蝦青素所用波長(zhǎng)為484 nm，蝦青素保留時(shí)間由蝦青素標(biāo)準(zhǔn)品光譜決定。蝦青素峰面積計(jì)算公式：

A=A1+1.1A2+1.3A3

式中：A1、A2、A3分別為樣品溶液中反式蝦青素、9-順式-蝦青素和13-順式-蝦青素的峰面積響應(yīng)值，1.1和1.3為9-順式-蝦青素和13-順式-蝦青素對(duì)反式蝦青素的相對(duì)響應(yīng)系數(shù)。

1.3.7 甘油磷脂分子種分析

根據(jù)文獻(xiàn)[19-21]的方法，采用裝配了Turbo V電噴霧電離源(ESI)質(zhì)譜儀進(jìn)行甘油磷脂分子種的定性和定量分析，使用HPLC-MS分析軟件1.6.1進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。

1.3.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，數(shù)據(jù)采用SPSS 16.0軟件進(jìn)行分析。結(jié)果用(平均值±標(biāo)準(zhǔn)差)(SD)表示，采用單因素方差分析評(píng)價(jià)平均值之間的差異，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性意義。

2 結(jié)果與討論

2.1 脂質(zhì)特征的分析

2.1.1 脂質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)、蝦青素質(zhì)量分?jǐn)?shù)及脂質(zhì)組成

由表1可見(jiàn)，凍干口蝦蛄肌肉中的脂質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)明顯高于副產(chǎn)物，脂質(zhì)中蝦青素(AST)質(zhì)量分?jǐn)?shù)明顯低于副產(chǎn)物。在其他品種蝦中也發(fā)現(xiàn)這種特征[8，22]。從肌肉和副產(chǎn)物中提取的脂質(zhì)由磷脂(PL)、甘油三酯(TAG)、甘油二酯(DAG)、單甘油酯(MAG)、膽固醇(CHO)、游離脂肪酸(FFA)組成。其中PL質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高，TAG和CHO次之。與肌肉脂質(zhì)相比，副產(chǎn)物脂質(zhì)中的PL和CHO質(zhì)量分?jǐn)?shù)略高，而TAG質(zhì)量分?jǐn)?shù)略低。前期研究結(jié)果表明，PL在斑結(jié)竹對(duì)蝦(Penaeusmonodon)和凡納濱對(duì)蝦(Litopenaeusvanname)的脂質(zhì)組成中質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高[23-25]，而在Penaeusmonodon和雄性北極甜蝦(Pandalusmontagui)脂質(zhì)中有與口蝦蛄相似的CHO質(zhì)量分?jǐn)?shù)[24，26]。

表1 口蝦蛄肌肉和副產(chǎn)物干基的脂質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)、蝦青素質(zhì)量分?jǐn)?shù)及脂質(zhì)組成Tab.1 Lipid content,astaxanthin content and lipid class compositions from two parts of Oratosquilla oratoria %

2.1.2 磷脂組成

由表2可見(jiàn)，口蝦蛄肌肉和副產(chǎn)物中均檢測(cè)到磷脂酰膽堿(PC)、磷脂酰乙醇胺(PE)、磷脂酰絲氨酸(PS)、磷脂酰肌醇(PI)、溶血磷脂酰膽堿(LPC)。其中，PC和PE是肌肉及副產(chǎn)物PL的主要成分。之前的研究結(jié)果也顯示，海洋蝦類(lèi)磷脂包含PC、PE、PS、PI、LPC[27-28]。其中，Penaeuskerathurus肌肉和頭部的磷脂中PC與PE的質(zhì)量分?jǐn)?shù)與本研究結(jié)果相近。不同種類(lèi)的PL其極性頭部不同，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值也不同。

表2 口蝦蛄肌肉和副產(chǎn)物的磷脂類(lèi)組成的摩爾分?jǐn)?shù)Tab.2 Molecular fractions of phospholipids (mole fraction) in muscle and by-products recovered from different parts of Oratosquilla oratoria %

2.1.3 脂肪酸組成

由表3可見(jiàn)，口蝦蛄脂質(zhì)中多不飽和脂肪酸(PUFA)質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高，尤其是EPA和DHA。其中，口蝦蛄副產(chǎn)物脂質(zhì)的多不飽和脂肪酸所占總脂肪酸比例顯著高于肌肉?？谖r蛄脂質(zhì)中單不飽和脂肪酸(MUFA)質(zhì)量分?jǐn)?shù)皆高于飽和脂肪酸(SFA)。Balzano等研究了蝦蛄可食部的脂肪酸組成，結(jié)果表明，PUFA占總脂肪酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)為(40.19±3.37)%，是蝦蛄可食部的主要脂肪酸，與本研究結(jié)果相似[13]?？梢?jiàn)，口蝦蛄副產(chǎn)物是一種容易被忽視的n-3 PUFA來(lái)源，具有潛在的開(kāi)發(fā)價(jià)值。

表3 口蝦蛄肌肉和副產(chǎn)物脂質(zhì)中的脂肪酸組成Tab.3 Fatty acid compositions of the lipids recovered from different parts of shrimps Oratosquilla oratoria %

2.2 口蝦蛄副產(chǎn)物和肌肉的甘油磷脂分子種特征

使用三重四極桿質(zhì)譜基于正離子模式下選擇離子掃描鑒定口蝦蛄兩部分脂質(zhì)的甘油磷脂(GPL)分子種，如圖1所示。通過(guò)m/z=184的母離子掃描(PIS)選擇性檢測(cè)甘油磷脂酰膽堿(GPCho)和溶血甘油磷脂酰膽堿(LGPCho)的甘油磷脂分子種(圖1(a))，而甘油磷脂酰乙醇胺(GPEtn)/溶血甘油磷脂酰乙醇胺(LGPEtn)以及甘油磷脂酰絲氨酸(GPSer)/溶血磷脂酰絲氨酸(LGPSer)則分別通過(guò)選擇m/z=141和185的中性丟失掃描選擇性鑒定其分子種(圖1(b)、(c))。甘油磷脂分子種通過(guò)特征性掃描得到一階質(zhì)譜信息。根據(jù)之前推導(dǎo)的公式，可以推導(dǎo)出GPL中酯化FA的碳原子和雙鍵的總數(shù)，并通過(guò)二級(jí)質(zhì)譜掃描，推測(cè)sn-1和sn-2位置上FA的具體結(jié)構(gòu)信息，同時(shí)對(duì)縮醛甘油磷脂(磷脂酰醚酯和磷脂酰烯醇酯)進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定[19-21]。此外，以正離子模式下的甘油磷脂的一階質(zhì)譜信號(hào)強(qiáng)度與相應(yīng)內(nèi)標(biāo)的信號(hào)強(qiáng)度之比來(lái)表示其相對(duì)的比較量。

(a) 一級(jí)質(zhì)譜m/z=184

口蝦蛄肌肉和副產(chǎn)物的主要甘油磷脂分子種測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表4。在肌肉和副產(chǎn)物脂質(zhì)中分別檢測(cè)到97和102種分子種，其中包括GPCho、GPEtn、GPSer、LGPCho、LGPEtn和LGPSer。在口蝦蛄肌肉和副產(chǎn)物脂質(zhì)的GPCho、GPEtn、GPSer中，16：0/20：5、18：0/20：5、16：0/22：6、18：0/22：6、20：4/20：5、14：0/20：4等是磷脂酰酯的主要分子種，18：4/18：0、20：1/18：0等可能是磷脂酰醚酯的主要分子種，16：0/16：0、18：3/18：0、20：0/18：0等可能是磷脂酰烯醇酯的主要分子種。Balzano等[13]報(bào)道Penaeuskerathuru的PC富含PUFA，尤其是EPA。本研究也發(fā)現(xiàn)口蝦蛄肌肉和副產(chǎn)物中也含有豐富的縮醛磷脂。以往的研究也表明，魚(yú)類(lèi)、貝類(lèi)、甲殼類(lèi)等海產(chǎn)品中脂質(zhì)的縮醛磷脂質(zhì)量分?jǐn)?shù)豐富[29]。

表4 口蝦蛄肌肉和副產(chǎn)物脂質(zhì)中的主要甘油磷脂分子種Tab.4 Major glycerophospholipids in muscle and by-product lipids of Oratosquilla oratoria

續(xù)表

3 結(jié) 論

口蝦蛄肌肉干基的脂質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)明顯高于副產(chǎn)物，而蝦青素質(zhì)量分?jǐn)?shù)在口蝦蛄副產(chǎn)物脂質(zhì)中比肌肉中更高，分別為(2.09±0.08)和(0.9±0.01)μg/g?？傊|(zhì)由TAG、DAG、MAG、PL、FFA、CHO組成，其中PL最高，占總脂質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)61.57%～73.60%；TAG和CHO次之，與肌肉相比副產(chǎn)物脂質(zhì)中的PL和CHO占比更高，TAG占比較低?？谖r蛄磷脂以PC和PE為主，摩爾分?jǐn)?shù)分別為55.54%～61.11%和30.79%～24.86%，并且含有少量的PI、PS、LPC。PUFA是口蝦蛄脂質(zhì)的主要脂肪酸，以EPA和DHA為主，分別占總脂肪酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)12.37%～15.06%和13.89%～13.99%。檢測(cè)到口蝦蛄副產(chǎn)物和肌肉中大約200個(gè)甘油磷脂分子種，其中主要分子種富含EPA和DHA?？梢?jiàn)，口蝦蛄脂質(zhì)的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值較高，而口蝦蛄副產(chǎn)物作為磷脂型n-3 PUFA的來(lái)源，具有潛在的開(kāi)發(fā)價(jià)值。