程韜 王影超 陳韋佳

【摘 要】 目的：研究并完善藜蘆的質(zhì)量控制。方法：采用薄層色譜法鑒別藜蘆;采用HPLC法同時(shí)測(cè)定藜蘆中虎杖苷和白藜蘆醇的含量，采用Thermo C18色譜柱（4.6mm× 250mm 5μm），以乙腈為流動(dòng)相A，以水為流動(dòng)相B，進(jìn)行梯度洗脫流速1.0mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng)306nm，柱溫30℃。結(jié)果：薄層色譜斑點(diǎn)清晰分離度較好;虎杖苷和白藜蘆醇分別在0.2004～2.004μg、0.4056～4.0563μg范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，加樣回收率分別為99.6%和100.1%，RSD分別為1.1%、1.0%。結(jié)論：該方法操作簡(jiǎn)單，準(zhǔn)確度高，靈敏度高，重現(xiàn)性好，專屬性強(qiáng)，可用于藜蘆的質(zhì)量控制。

【關(guān)鍵詞】 藜蘆;虎杖苷;白藜蘆醇;薄層色譜;HPLC

Abstract：Objective To study and improve the quality of Veratrum.Methods TLC was used to identify Veratrum;The Polydatin and Resveratrol was eluted on Thermo C18（250mm×4.6mm，5μm） with mobile phase of acetonitrile（A）- water（B） for gradient elution at the column temperature of 30℃. The flow rate of 1.0mL/ min and the detection wavelength was 306nm.Results The TLC spots were clear and showed a good separation;Polydatin and Resveratrol showed good linear relationships in the ranges of 0.2004～2.004μg and 0.4056～4.0563μg respectively.The sample recovery rates were 99.6% and 100.1%，the RSDs were 1.1% and 1.0%.Conclusion The method is simple，accurate，high sensitivity，good reproducibility，high specificity，and can be used for quality control of Veratrum.

Keywords：Veratrum; Polydatin; Resveratrol; HPLC

藜蘆在2003年版《貴州省中藥材、民族藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》中系指藜蘆Veratrum nigrum L.、黑紫藜蘆Veratrum japonicum（Baker）Loes.f.、 蒙自藜蘆Veratrum mengtzeanum Loes.f.及狹葉藜蘆Veratrum stenophyllum Diels的干燥根或根莖。 秋季采挖，洗凈，曬干，可催吐、祛痰、殺蟲，用于中風(fēng)痰涌、風(fēng)癇癲疾、疥癬、惡瘡[1]。本次實(shí)驗(yàn)研究的藜蘆為藜蘆Veratrum nigrum L.，由貴州省食品藥品檢驗(yàn)所李楊老師鑒定，藜蘆中含有虎杖苷和白藜蘆醇，虎杖苷具有較強(qiáng)的生物活性，對(duì)心肌細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞、抗血小板聚集、改善微循環(huán)等有顯著作用，此外還能減輕多種因素造成的組織器官損傷，具有保護(hù)肝細(xì)胞，降血脂及抗脂質(zhì)過氧化等作用[2]。白藜蘆醇具有抗癌、抗菌、抗炎、抗心血管疾病、抗衰老和抗神經(jīng)退行性疾病等藥理作用[3]，質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中有顯微鑒別和理化鑒別，故增加TLC鑒別及虎杖苷和白藜蘆醇的含量測(cè)定對(duì)完善藜蘆的質(zhì)量控制提供重要的科學(xué)依據(jù)。

1 儀器材料

1.1 儀器 ThermoFisher UItimate 3000高效液相色譜儀;梅特勒托勒多 MS202TS型電子天平（十萬分之一）;梅特勒托勒多 XP26型電子天平（百萬分之一）;KQ-500DB型超聲儀（昆山市超聲儀器有限公司）;millipore超純水機(jī)。

1.2 材料 虎杖苷對(duì)照品（111575-200502）、白藜蘆醇對(duì)照品（111535-201703）均來自中國(guó)食品藥品檢定研究院;藜蘆（批號(hào)301）采自安順市關(guān)嶺縣、藜蘆（批號(hào)302）采自安順市關(guān)嶺縣、藜蘆（批號(hào)303）采自安順市紫云縣、對(duì)照藥材由貴州省食品藥品檢驗(yàn)所李楊老師鑒定為藜蘆Veratrum nigrum L.。乙腈為色譜純，水為超純水，其余試劑均為分析純，青島海洋化工硅膠G薄層板。

2 方法與結(jié)果

[JP2]

2.1 藜蘆的薄層色譜鑒別方法[4] 取本品粉末1g，加濃氨試液1.5mL使浸潤(rùn)，放置30min，加二氯甲烷30mL加熱回流30min，放冷，濾過，濾液蒸干，殘?jiān)蛹状?mL使溶解，作為供試品溶液。另取藜蘆對(duì)照藥材1g，同法制成對(duì)照藥材溶液。照薄層色譜法（通則0502）試驗(yàn)，吸取上述兩種溶液各5～l0μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上以環(huán)己烷-乙酸乙酯-異丙醇-甲醇-水-三乙胺（5∶[KG-*3/5]3∶[KG-*3/5]1∶[KG-*3/5]1.5∶0.5∶[KG-*3/5]1）為展開劑，展開，取出，晾干，再噴以碘化鉍鉀試液。供試品色譜中，在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)。[JP]

2.2 藜蘆的薄層色譜鑒別結(jié)果 經(jīng)過薄層色譜對(duì)溫度、濕度的方法學(xué)驗(yàn)證，圖1表明此鑒別方法分離度良好，斑點(diǎn)清晰，信息全面，用于藜蘆的薄層鑒別方法可行。

2.3 HPLC同時(shí)測(cè)定虎杖苷和白藜蘆醇的方法[5-7]

2.3.1 波長(zhǎng)選擇 分別取虎杖苷、白藜蘆醇對(duì)照品在200～400nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行紫外波長(zhǎng)掃描，虎杖苷和白藜蘆醇均在306nm處有較大吸收，又結(jié)合HPLC-DAD光譜圖對(duì)比，確定306nm為最佳檢測(cè)波長(zhǎng)。光譜圖如圖2所示。

2.3.2 色譜條件 色譜柱Thermo C18（4.6mm×250mm，5μm），以乙腈為流動(dòng)相A，以水為流動(dòng)相B，按表1進(jìn)行梯度洗脫。檢測(cè)波長(zhǎng)：306nm;流速：1.0mL/min;柱溫：30℃;進(jìn)樣量：10μL。

2.3.3 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取虎杖苷、白藜蘆醇對(duì)照品，加甲醇制成每1mL各含虎杖苷10μg、白藜蘆醇20μg的混合溶液，搖勻，即得。

2.3.4 供試品溶液的制備 取過三號(hào)篩的粉末1g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25mL，稱定重量，超聲處理30min，放冷，再稱定重量，用甲醇補(bǔ)足失去重量，搖勻，0.45μm微孔濾過，即得（實(shí)驗(yàn)全程需避光操作）。

2.3.5 系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn) 取對(duì)照品溶液、供試品溶液注入液相色譜儀，供試品色譜中呈現(xiàn)與虎杖苷對(duì)照品、白藜蘆醇對(duì)照品保留時(shí)間相同的色譜峰。色譜圖如圖3所示。

2.3.6 線性關(guān)系實(shí)驗(yàn) 精密吸取虎杖苷對(duì)照品（0.2004mg/mL）和白藜蘆醇對(duì)照品（0.4056mg/mL）各1mL、2.5mL、5mL、7.5mL、10mL分別置于10mL棕色容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，制得虎杖苷濃度分別為20.04μg/mL、50.10μg/mL、100.2μg/mL、150.3μg/mL、200.4μg/mL;白藜蘆醇濃度分別為40.56μg/mL、101.4μg/mL、202.8μg/mL、304.2μg/mL、405.6μg/mL的對(duì)照品溶液，分別吸取上述對(duì)照品溶液各10μL，按2.3.2色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜峰面積，以對(duì)照品質(zhì)量（μg）為橫坐標(biāo)（X），峰面積為縱坐標(biāo)（Y）繪制工作曲線，進(jìn)行回歸處理，虎杖苷回歸方程為y=462.8668x+2159.6973（r=0.9998），白藜蘆醇回歸方程為y=525.4858x-302.5944（r=0.9999），結(jié)果表明虎杖苷在0.2004～2.004μg范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，白藜蘆醇在0.4056～4.0560μg范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。

2.3.7 精密度實(shí)驗(yàn) 分別精密吸取對(duì)混合照品溶液10μL，在同一色譜條件下，連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)定峰面積，虎杖苷對(duì)照品峰面積RSD%為1.0%，白藜蘆醇對(duì)照品峰面積RSD%為0.9%，表明儀器精密度良好。

2.3.8 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 精密稱取一份樣品，按2.3.4制備供試品溶液，精密吸取供試品溶液10μL，分別于配制后0、3、6、18、24h，按2.3.2項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)定虎杖苷峰面積RSD%為1.7%，白藜蘆醇峰面積RSD%為1.3%，結(jié)果表明供試品溶液中虎杖苷和白藜蘆醇在24h內(nèi)穩(wěn)定。[JP]

2.3.9 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 精密稱取同一批號(hào)樣品6份，按2.3.4方法制備供試品溶液，精密吸取供試品溶液10μL，按2.3.2項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，虎杖苷平均含量為0.3701mg/g，RSD=0.5%，白藜蘆醇平均含量0.8781mg/g，RSD=0.7%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.3.10 回收率實(shí)驗(yàn) 精密稱定已知含有量的樣品（虎杖苷平均含量0.3701mg/g、白藜蘆醇平均含量0.8781mg/g）6份，精密加入對(duì)照品虎杖苷0.240mg，白藜蘆醇0.483mg，按2.3.4方法制備供試品溶液，精密吸取供試品溶液10μL，按2.3.2項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積，結(jié)果虎杖苷和白藜蘆醇的平均回收率分別為99.6%和100.1%，RSD（n=6）分別為1.1%和0.95%，表明實(shí)驗(yàn)方法準(zhǔn)確度較高，結(jié)果見表2。

2.3.11 耐用性試驗(yàn) 分別采用3支不同品牌的C18色譜柱waters xbridge（4.6mm×250mm，5μm）、迪馬（4.6mm×250mm，5μm）、Thermo（4.6mm×250mm，5μm）在戴安U3000高效液相色譜儀上對(duì)同一批藜蘆樣品進(jìn)行測(cè)定，精密吸取供試品溶液10μL，按2.3.2色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積，結(jié)果虎杖苷和白藜蘆醇的RSD%分別為2.2%、2.0%。

2.4 樣品含量測(cè)定結(jié)果 取上述3批藜蘆藥材，按2.3.4項(xiàng)下方法制備供試品溶液并測(cè)定色譜峰面積，計(jì)算藜蘆藥材虎杖苷和白藜蘆醇的含量，結(jié)果見表3。

3 討論

根據(jù)參考文獻(xiàn)，選擇甲醇-水、乙腈-水流動(dòng)相按表1梯度洗脫表進(jìn)行洗脫，結(jié)果乙腈-水在表1梯度洗脫條件下可以使供試品目標(biāo)化合物有效分離，再選擇乙腈-1%磷酸溶液、乙腈-2%磷酸溶液、乙腈-4%磷酸溶液照表1梯度洗脫表進(jìn)行比較，結(jié)果上述各系統(tǒng)均可以使供試品目標(biāo)化合物有效分離，峰型也較理想，但因乙腈-水系統(tǒng)配制方便，成本低，毒性低，故最終選擇乙腈-水為最佳流動(dòng)相系統(tǒng)。

虎杖苷和白藜蘆醇對(duì)光照不穩(wěn)定，在進(jìn)行虎杖苷和白藜蘆醇含量測(cè)定操作時(shí)均要避光操作，如不避光操作，對(duì)照品色譜圖中會(huì)出現(xiàn)雜峰，疑為對(duì)照品在光照條件下被降解轉(zhuǎn)化為其他化合物，后續(xù)會(huì)對(duì)供試品中化合物的光照降解途徑進(jìn)行進(jìn)一步研究。

用甲醇、乙醇超聲提取1h，甲醇效果較好;再用25%甲醇、50%甲醇、75%甲醇提取，結(jié)果用50%甲醇提取溶劑提取所測(cè)得的虎杖苷和白藜蘆醇峰面積最高，含量較高，甲醇提取次之;但是在50%甲醇提取溶劑下反復(fù)進(jìn)行準(zhǔn)確度實(shí)驗(yàn)，虎杖苷的回收率滿足要求，白藜蘆醇的回收率僅為50%～60%，選用甲醇作為提取溶劑進(jìn)行準(zhǔn)確度實(shí)驗(yàn)，虎杖苷和白藜蘆醇的回收率均能達(dá)到藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)分析方法驗(yàn)證指導(dǎo)原則要求。

本實(shí)驗(yàn)對(duì)藜蘆Veratrum nigrum L.的TLC鑒別及HPLC含量測(cè)定的研究，方法可靠穩(wěn)定，簡(jiǎn)便易行，可較全面、可靠地控制藜蘆的質(zhì)量，為其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的提升制定提供可靠依據(jù)。

參考文獻(xiàn)

[1]貴州省藥品監(jiān)督管理局.貴州省中藥材、民族藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)[S].貴陽：貴州科技出版社，2003：416.

[2]高守紅，楊少麟，范國(guó)榮.虎杖苷的研究進(jìn)展[J].藥學(xué)實(shí)踐雜志，2005，23（3）：145-147.

[3]孫治剛，李志娜，李敏.白藜蘆醇研究進(jìn)展[J].淮海工學(xué)院學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2017，2（26）：40-43.

[4]國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典（2015年版一部）[S].北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2015：208.

[5]從悅，王金輝，李銑.HPLC法測(cè)定藜蘆中虎杖苷和白藜蘆醇的含量[J].中藥研究與信息，2005，7（7）：16-19.

[6]鄭可利，鄭小林，李鳳蘭.正交法研究虎杖白藜蘆醇提取工藝[J].三明學(xué)院學(xué)報(bào)，2008，2（2）：21-23.

[7]朱立賢，金征宇，陶冠軍.HPLC測(cè)定虎杖中的白藜蘆醇和白藜蘆醇苷的含量[J].中成藥，2005，27（8）：944 -946.