彭霜 陳凌云 李江

【摘 要】 目的：建立甘葛護肝膠囊的薄層鑒別和含量測定方法，用于控制其質(zhì)量。方法：采用薄層色譜法分別對甘葛護肝膠囊中的干姜、木香、砂仁、白豆蔻、陳皮、青皮、澤瀉進行鑒別;并采用高效液相色譜法測定其中葛根素的含量。結(jié)果：7味藥的薄層特征斑點明顯，陰性無干擾，重復(fù)性良好。葛根素在0.106～1.06μg范圍內(nèi)，峰面積與進樣量呈良好的線性關(guān)系（r=1），平均加樣回收率為99.49%，RSD=1.11%。結(jié)論：建立的薄層鑒別方法斑點清晰，專屬性好，含量測定方法陰性無干擾，結(jié)果準確、穩(wěn)定，可用于控制該制劑標準。

【關(guān)鍵詞】 甘葛護肝膠囊;葛根素;薄層鑒別;高效液相色譜法

Abstract：Objective Establish a thin-layer chromatography（TLC） identification and content determination method for Gange Hugan Capsules to control its quality.Methods TLC was used to identify dry Zingiberis rhizoma，Aucklandae radix，Amomum fructus，Amom fructus rotundus，Citri reticulatae pericarpium ，atae pericarpium viride and Alismatis rhizoma respectively in Gange Hugan capsule.Puerarin content was determined by HPLC.Results 7 medicines dispcayed obvious characteristic spots in TLC with non-interfering and good repeatability.In negate samples of puerarin from 0.106 to 1.06μg，the peak area has a good linear relationship with the injection volume （r=1）.The average sample recollectron is 99.49%，and the RSD = 1.11%.Conclusion The established TLC identification method showed clear spots，good specificity，and non-interfemgin negative samples interference.The results were accurate and stable，suggesting that this method be used to control the preparation standards.

Keywords：Gange Hugan Capsules; Puerarin; TLC; HPLC

酒精性肝?。ˋlcoholic Live Disease，ALD）是由于長期大量飲酒或者短時間內(nèi)攝入大量酒精引起的疾病。酒精在代謝過程中的氧化應(yīng)急作用及炎癥反應(yīng)是引起酒精肝的主要因素[1]。肝臟是機體代謝酒精的主要器官，代謝量達到90%以上，酒精對肝臟的損傷在所有器官中最為明顯[1]。有研究表明，酒精性肝病發(fā)病與線粒體損傷、代謝過程中的氧化應(yīng)激、細胞因子的釋放和細胞凋亡等有密切關(guān)系[1-2]。也有研究[3]表明，某些中藥成分對酒精性肝損傷具有保護作用，在改善肝臟功能[4]、調(diào)節(jié)乙醇代謝[5-6]、減輕氧化應(yīng)激損傷[7]、抗炎護肝[8]和細胞凋亡[9]等方面，有明顯的優(yōu)勢。

甘葛護肝膠囊處方來源于云南中醫(yī)藥大學第三附屬醫(yī)院（昆明市中醫(yī)醫(yī)院）的經(jīng)驗方，由青皮、木香、茯苓、人參、三七、橘皮、炒神曲、豬苓、干姜、白術(shù)、澤瀉、葛花、砂仁、白豆蔻、牡蠣、枸杞子、葛根、余甘子共18味藥組成，具有良好的解酒保肝功效[10]。處方中的君藥是葛花，主要含有黃酮類化合物，是處方中解酒的有效成分之一，方中人參、茯苓等藥材也有相應(yīng)的保肝護肝作用[11]。處方以傳統(tǒng)湯劑的形式應(yīng)用于臨床，不便于患者攜帶，服用等，為了促進處方的應(yīng)用與推廣，規(guī)范用藥劑量，保證療效，將其制成甘葛護肝膠囊。

為了更好地控制其質(zhì)量，保證用藥安全，對所制甘葛護肝膠囊中的干姜、木香、砂仁、澤瀉、陳皮、青皮、白豆蔻進行TLC鑒別，并對其主要成分葛根素進行含量測定。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 高效液相色譜儀（AgiLent）;色譜柱C18（4.6mm×250mm，5μm，迪馬科技公司）;超聲儀（上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司）;電子天平（奧豪斯儀器有限公司）;分析天平（上海精密儀器儀表有限公司）;電熱鼓風干燥箱（天津市泰斯特儀器有限公司）;數(shù)顯恒溫水浴鍋（北京永光明醫(yī)療儀器廠）;搖擺式高速中藥粉碎機（溫嶺市林大機械有限公司）;循環(huán)水式真空泵（鞏義市英峪予華儀器廠）;凈水器：超純水系統(tǒng)（上海倍捷Biogen科技有限公司）。

1.2 試藥 甲醇、石油醚、二氯甲烷、甲酸乙酯、乙酸乙酯、乙醇均為分析純（天津市大茂化學試劑廠）;環(huán)己烷、正丁醇、甲酸均為分析純（天津市風船化學試劑科技有限公司）;甲苯（AR，云南楊林工業(yè)開發(fā)區(qū)汕滇藥業(yè)有限公司）;水為哇哈哈純凈水。干姜對照藥材（批號：120942-201510）、木香對照藥材（批號：120921-201309）、砂仁對照藥材（批號：120985-201406）、澤瀉對照藥材（批號：121081-201406）、橙皮對照藥材（批號：121137-201606）、陳皮對照藥材（批號：120969-201510）、青皮對照藥材（批號：121155-201103），白豆蔻對照藥材（批號：120926-201608）（中國食品藥品檢定研究院），甘葛護肝膠囊（批號分別為：20171123，20171124，20171125），均由昆明市中醫(yī)醫(yī)院提供。

2 方法與結(jié)果

2.1 TLC鑒別

2.1.1 干姜TLC鑒別 取本品粉末1g，加乙酸乙酯20mL，超聲處理10min，濾過，濾液作為供試品溶液。另取干姜對照藥材1g，同法制成對照藥材溶液。再取缺干姜的陰性粉末1g，同法制成陰性對照溶液。按薄層色譜法試驗，吸取對照藥材溶液1μL，陰性對照溶液和供試品溶液各6μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以石油醚（60～90℃）-三氯甲烷-乙酸乙酯（3∶[KG-*3/5]2∶[KG-*3/5]1）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以5%香草醛硫酸試液，在105℃下加熱至斑點顯色清晰[12]。供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應(yīng)的位置上顯相同顏色的斑點，陰性供試品無干擾。如圖1所示。

2.1.2 木香TLC鑒別 稱取粉末0.5g，加甲醇10mL，超聲30min，濾過，濾液作為供試品溶液。另取木香對照藥材0.5g，同法制成對照溶液。再取缺木香的陰性粉末0.5g，同法制成陰性對照溶液。按薄層色譜法試驗，吸取藥材對照品溶液4μL，供試品溶液和陰性對照溶液20μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以環(huán)己烷-甲酸乙酯-甲酸（15∶[KG-*3/5]8∶[KG-*3/5]1）的上層溶液為展開劑，展開，取出，晾干，噴以1%香草醛硫酸溶液，加熱至斑點顯色清晰[13]。供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應(yīng)的位置上顯相同顏色的斑點，陰性無干擾。結(jié)果如圖2所示。

2.1.3 砂仁TLC鑒別 取砂仁藥材，去殼，取種子團粉末（通過三號篩）1g，用70%乙醇潤濕粉末，加石油醚（60～90℃）5mL，超聲處理30min，濾過，濾液作為對照藥材溶液。另取本品粉末和缺砂仁的陰性粉末各1g，同法制成供試品溶液和陰性對照溶液。按薄層色譜法試驗，吸取對照藥材溶液3μL，供試品溶液和陰性對照溶液各6μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以環(huán)己烷-醋酸乙酯（11∶[KG-*3/5]1）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以5%香草醛硫酸溶液，加熱至105 ℃斑點顯色清晰[14]。供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應(yīng)的位置上顯相同顏色的斑點，陰性無干擾。結(jié)果如圖3所示。

2.1.4 澤瀉TLC鑒別 取本品粉末2g，加乙酸乙酯20mL，超聲處理30min，濾過，濾液加于氧化招柱（200～300目，5g，內(nèi)徑為1cm，干法裝柱）上，用乙酸乙酯10mL洗脫，收集洗脫液，蒸干，殘渣加乙酸乙酯lmL使溶解，作為供試品溶液。另取本品粉末和缺澤瀉的陰性粉末各2g，同法制成供試品溶液和陰性對照溶液[15]。按薄層色譜法試驗，吸取對照藥材溶液1μL，供試品溶液和陰性對照溶液各3μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以環(huán)己烷-乙酸乙酯（2∶[KG-*3/5]3）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以5%香草醛硫酸溶液 ，在105℃下加熱至斑點顯色清晰。供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應(yīng)的位置上顯相同顏色的斑點，陰性無干擾。結(jié)果如圖4所示。

2.1.5 陳皮、青皮TLC鑒別 甘葛護肝方由葛根、余甘子、人參等十八味藥組成，本品質(zhì)量標準研究對處方中所有藥味的TLC鑒別均進行了研究。且依據(jù)所查文獻，每味藥至少采用了兩種鑒別方法。結(jié)果表明，除了干姜、木香、砂仁、澤瀉、陳皮、青皮、白豆蔻外，其他幾味藥均未找到合適的鑒別方法。試驗發(fā)現(xiàn)，本品中可鑒別出陳皮、青皮的特征斑點，但該斑點存在陰性干擾。最終采用雙陰性的方法去除鑒別過程中的陰性干擾。

取本品粉末0.3g，加甲醇10mL加熱回流20min，濾過，取續(xù)濾液5mL，濃縮至lmL，作為供試品溶液。取缺陳皮和青皮的陰性粉末、陳皮和青皮藥材粉末各0.3g同法制成陰性對照溶液。另取橙皮苷對照品，加甲醇制成飽和溶液，作為對照品溶液。按薄層色譜法試驗，吸取供試品和陰性對照溶液各6μL，對照藥材溶液和對照品溶液各3μL，分別點于同一用硅膠G薄層板上，以乙酸乙酯-甲醇-水（100∶[KG-*3/5]17∶[KG-*3/5]13）為展開劑，展至約3cm，取出，晾干，再以甲苯-乙酸乙酯- 甲酸-水（20∶[KG-*3/5]10∶[KG-*3/5]1∶[KG-*3/5]1） 的上層溶液為展開劑，展至約8cm，取出，晾干，噴以1%三氯化鋁甲醇試液，置紫外光燈（365nm）下檢視[16]。供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應(yīng)的位置上顯相同顏色的斑點，陰性無干擾。結(jié)果如圖5所示。

2.1.6 白豆蔻TLC鑒別 取豆蔻仁粉末約5g，置圓底燒瓶中，加水200mL，連接揮發(fā)油測定器，自測定器上端加水至刻度3mL，再加正已烷2～3mL連接回流冷凝管，加熱至微沸并保持2h，放冷，分取正己烷液，通過鋪有無水硫酸鈉約1g的漏斗濾過，濾液置5mL量瓶中，揮發(fā)油測定器內(nèi)壁用正己烷少量洗滌，洗液加入同一量瓶中，用正己烷稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，濾液作為對照藥材溶液。再取缺白豆蔻的陰性粉末和本品粉末同法制成陰性對照溶液和供試品溶液。按薄層色譜法試驗，吸取供試品溶液和陰性對照溶液各3μL、對照藥材溶液1μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以環(huán)己烷-二氯甲烷-乙酸乙酯（15∶[KG-*3/5]5∶[KG-*3/5]0.5）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以5%香草醛硫酸溶液，在105℃加熱至斑點顯色清晰，立即檢視[17]。供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應(yīng)的位置上顯相同顏色的斑點，陰性無干擾。結(jié)果如圖6所示。

2.2 葛根素含量測定 葛根作為中國傳統(tǒng)醫(yī)學中最具代表性的解酒藥物之一，有解酒防醉、改善心腦血管循環(huán)[18-20]、鎮(zhèn)痛[21]、降低血糖[22]、抗肝臟毒性[23]、防止高血壓及動脈硬化[24]、提高機體免疫力及抗菌、抗病毒等多種藥理作用[25]?，F(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)異黃酮類化合物是葛根的主要成分，其中葛根素是葛根的特有成分，也是中藥葛根中的指標性成分，葛根素可通過抑制β2內(nèi)啡肽的釋放來改善抗自由基和腦功能，降低脂質(zhì)過氧化對細胞的損害，對急性酒精中毒有保護作用[26]。有實驗證實葛根具有解酒作用，能降低乙醇在大鼠體內(nèi)的血藥濃度，酒前服用比酒后服用效果更佳[27-28]。本實驗主要對甘葛護肝膠囊中的葛根素進行含量測定，為提高其質(zhì)量標準提供參考。

2.2.1 對照品溶液制備 取葛根素對照品適量，精密稱定，加30%乙醇制成0.035mg/mL的葛根素對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液制備 取本品甘葛護肝膠囊內(nèi)容物約5g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入30%乙醇50mL，密塞，稱定重量，超聲30min，放冷，再稱定重量，用30%乙醇補足減失的重量搖勻，離心5min，濾過，精密移取25mL濾液揮干，殘渣加30%乙醇5mL溶解，離心5min，取上清液，濾過，取續(xù)濾液，即得[29]。

2.2.3 色譜條件與系統(tǒng)適用性 試驗Diamonsil C18柱（250mm×4.6mm，5μm）;流動相：甲醇-水（23∶[KG-*3/5]77）;檢測波長：250nm;柱溫：30℃;流速：1mL/min;進樣量：10μL;上述色譜條件下，葛根素對照品與其他組分色譜峰分離度良好。色譜圖如圖7所示。

結(jié)果表明：供試品中葛根素的分離度、拖尾因子均能滿足《中國藥典》2015年版四部通則0512高效液相色譜法項下規(guī)定，理論板數(shù)按葛根素峰計算均大于4000。

2.2.4 專屬性試驗 精密稱取處方中除葛根外其他味藥的混合粉末約5g，按供試品溶液制備方法制成陰性對照溶液。精密吸取陰性對照溶液10μL注入液相色譜儀，進行測定，即得。結(jié)果顯示：陰性樣品的色譜圖中在與對照品相同保留時間位置上沒有吸收峰，說明用本法測定其含量專屬性較強、靈敏度高。

2.2.5 線性關(guān)系考察 精密吸取葛根素對照品溶液（0.106mg/mL） 1、2、3、4、5、10μL，注入液相色譜儀照上述色譜條件測定峰面積，以峰面積為縱坐標Y，進樣量為橫坐標X，繪制標準曲線，葛根素的回歸方程Y=398.64X-1.0279，r=1，結(jié)果表明，葛根素在0.106～1.06μg之間，峰面積與進樣量呈良好線性關(guān)系。

2.2.6 精密度試驗 精密吸取同一葛根素對照品溶液進行測定，進樣量10μL，連續(xù)進樣6次，測得葛根素峰面積RSD值為0.21%（n=6）。結(jié)果表明儀器精密度良好。

2.2.7 對照品溶液穩(wěn)定性試驗 精密稱取葛根素對照品，加30%乙醇制成0.035mg/mL葛根素對照品溶液。精密吸取葛根素對照品溶液，分別在0、4、8、12、16、24h進樣檢測，進樣量10μL，測得葛根素峰面積RSD值為0.25%（n=6），結(jié)果表明葛根素對照品溶液在24h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.8 供試品溶液穩(wěn)定性試驗 精密稱取甘葛護肝膠囊粉末約5g，按“2.2.2”項下供試品制備方法，制成供試品溶液，分別在0、4、8、12、16、24h進樣檢測，進樣量10 μL，測得甘葛護肝膠囊供試品RSD值為1.54%（n=6），結(jié)果表明甘葛護肝膠囊供試品溶液在24h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.9 重復(fù)性試驗精密 稱取20171123批次的甘葛護肝膠囊粉末6份，每份約5g，按“2.2.2”項下供試品溶液制備方法制備6份甘葛護肝膠囊供試品溶液，進行測定，進樣量10μL，6份供試品溶液葛根素含量RSD為0.63%（n=6），結(jié)果表明本方法重現(xiàn)性較好。

2.2.10 準確度試驗取 20171123批次的肝葛護肝膠囊粉末6份，每份約2.0g，精密稱定，置錐形瓶中，按供試品制備方法制供試品溶液，精密加入葛根素對照品，制成供試品，取10μL注入液相色譜儀測定含量，用公式：加樣回收率（%）=（實際測得量-樣品含量）/加入量×100%。計算加樣回收率，結(jié)果見表7。結(jié)果平均加樣回收率為99.92%，RSD 為1.76% 。見表2。

2.2.11 樣品含量測定 分別稱取3個批次的甘葛護肝膠囊粉末，每個樣品取3份，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，分別進樣，進樣量為10μL，測得甘葛護肝膠囊中葛根素的平均含量為0.0766mg/g，每粒以0.5g計，每粒含葛根素0.0383mg。測定結(jié)果見表3。

3 討論

甘葛護肝方由葛根、余甘子、人參等十八味藥組成，本研究采用醇水雙提分組方案進行提取。其中，葛花、木香等四味藥采用醇提，醇提的藥渣與葛根、茯苓、枸杞子等10味藥材合并后再進行水提，合并提取液制成稠浸膏。由于處方含有效成分在高溫下不穩(wěn)定的藥味，本試驗將方中人參、三七、白豆蔻、炒神曲以生藥粉的形式加入稠浸膏中混勻、干燥、粉碎，制成膠囊。因所用生藥粉為極細粉，再進行顯微鑒別時生藥粉中的特征性結(jié)構(gòu)已被破壞，故本試驗并未進行相關(guān)研究。

本研究對處方中所有藥味的TLC鑒別均進行了研究。其中三七和人參所含有效成分相近，在鑒別中干擾較多，分離較難，所以未能建立此二藥的薄層鑒別方法。經(jīng)查閱文獻，對剩余藥味至少采用了兩種方法進行鑒別，結(jié)果表明，除干姜、木香、砂仁、澤瀉、陳皮、青皮、白豆蔻外，其余味藥均未找到合適的鑒別方法。本品中可鑒別出陳皮、青皮的特征斑點，但該斑點在二藥鑒別中均存在陰性干擾，分析可能是此二味藥均含橙皮苷引起，后采用雙陰性的方法去除干擾，結(jié)果表明，此法可行。此法陽性結(jié)果僅可表明本品中含陳皮或青皮或者同時含陳皮和青皮，但亦可使處方的鑒別藥物數(shù)量達到處方藥量的1/3。

葛根素含量測定實驗中，筆者首先對色譜條件進行了優(yōu)化，在甲醇-水（25∶[KG-*3/5]75）的基礎(chǔ)上，對流動相比例進行了考察，結(jié)果顯示以甲醇-水（23∶[KG-*3/5]77）為流動相時所得供試品色譜圖峰形良好。筆者也對供試品溶液的制備方法進行了優(yōu)化，考察了供試品溶液制備中甘葛護肝膠囊內(nèi)容物的取樣量，分別取樣2.5g，5.0g，7.5g，結(jié)果顯示，當取樣量為5.0g時，所得色譜圖中峰形較好。在此基礎(chǔ)上，也分別考察了當超聲時間為20min，30min，40min時對供試品溶液的影響，結(jié)果顯示，超聲時間30min，所測得的含量與超聲40min所測含量相近，確定超聲時間為30min。本實驗結(jié)果顯示所建立含量測定方法重現(xiàn)性、準確度、精密度等均符合藥典規(guī)定，故將此方法用于甘葛護肝膠囊中葛根素的含量測定。

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