趙展展，柳夢(mèng)圓，陳雷，雷明剛

1.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)動(dòng)物遺傳育種與繁殖教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，武漢 430070； 2.湖北金旭種公豬站有限公司，襄陽 441100

人工授精(AI)是現(xiàn)代豬繁殖育種中不可或缺的重要一環(huán)，而精液質(zhì)量直接決定AI的效果和豬場的效益[1]；但由于豬精子膜結(jié)構(gòu)的特殊性，使其抗冷應(yīng)激的能力較差，因此生產(chǎn)中99%以上AI使用常溫保存的豬精液，而稀釋粉在精液的常溫保存中扮演著非常重要的角色[2-3]。

稀釋粉決定著精液稀釋后的pH值、滲透壓、營養(yǎng)物質(zhì)等多種關(guān)乎精液質(zhì)量的關(guān)鍵指標(biāo)，是影響精液質(zhì)量的一個(gè)重要外在因素[1，4]。而中效稀釋粉以價(jià)格實(shí)惠、3～5 d適宜的保存時(shí)長，已然成為稀釋粉中的主力，但我國稀釋粉市場品牌紛雜，質(zhì)量參差不齊，給養(yǎng)豬企業(yè)造成了很大的困擾[2]。因此，本研究從市場上選擇了業(yè)內(nèi)知名度較高的9種中效稀釋粉進(jìn)行常溫保存對(duì)比試驗(yàn)，以期為養(yǎng)豬企業(yè)在選擇稀釋粉時(shí)提供參考，為我國制定稀釋粉相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)以及稀釋粉進(jìn)一步研發(fā)提供試驗(yàn)與理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)精液和稀釋粉

試驗(yàn)公豬精液來自湖北某公豬站，選擇12頭體型健壯、無生殖疾病史的杜洛克公豬，年齡在1～1.5歲，固定采精頻率為每周1次。精液的采集和初檢遵照GB/T 25172—2010和GB 23238—2009執(zhí)行[5-6]。本試驗(yàn)所用的9種稀釋粉由業(yè)內(nèi)知名度較高的8個(gè)品牌組成，產(chǎn)品說明的有效保存時(shí)長均≥5 d，分別將其編號(hào)為稀釋粉A、B、C、D、E、F、G、H、I。

1.2 溶液的配制

稀釋粉的溶解按照各產(chǎn)品外包裝的標(biāo)識(shí)進(jìn)行；低滲液由3.675 g的二水檸檬酸鈉和6.750 g的果糖溶解至500 mL超純水中配合而成(現(xiàn)配現(xiàn)用)。

1.3 精液的稀釋和保存

首先依據(jù)國標(biāo)《豬常溫精液生產(chǎn)》[5]中的要求推算稀釋密度，結(jié)合原精量和測定密度確定稀釋比。同時(shí)根據(jù)GB/T 25172—2010《豬常溫精液生產(chǎn)與保存技術(shù)規(guī)范》[6]和NY/T 636—2002《豬人工授精技術(shù)規(guī)程》[7]的操作要求以精液與稀釋液溫差不超過1 ℃為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行稀釋。稀釋后待精液穩(wěn)定0.5 h進(jìn)行初檢。最后，將稀釋分裝后的精液用毛巾包裹好，待其溫度降至接近室溫，再放入17 ℃恒溫箱中，每隔12 h搖勻1次。

1.4 測定指標(biāo)及方法

1) 酸堿度。每隔24 h取1.5 mL精液至10 mL離心管中，用pH計(jì)測定酸堿度的變化，每個(gè)樣重復(fù)測定3次。

2)活力和有效保存時(shí)長。用HT CASAⅡ系統(tǒng)每24 h對(duì)精液進(jìn)行1次活力檢測，每個(gè)樣品重復(fù)測定3次。

活力有效保存時(shí)長指稀釋后的精液直線運(yùn)動(dòng)精子數(shù)占總精子的比例不低于60%的保存時(shí)長[2]。當(dāng)活力連續(xù)2次檢測均低于60%，即停止該稀釋粉稀釋精液所有指標(biāo)的檢測。

3)畸形率。根據(jù)前人研究結(jié)果和預(yù)試驗(yàn)的分析，發(fā)現(xiàn)精子畸形率等指標(biāo)的變化慢于精子活力的變化，故本試驗(yàn)每隔48 h檢測1次精子畸形率、頂體和質(zhì)膜完整率的變化。

涂片后參照南京建成《精子快速染色液說明書》進(jìn)行染色，用油鏡放大1 000倍進(jìn)行觀察。每個(gè)樣品制3張涂片，每張涂片至少計(jì)3個(gè)視野和200個(gè)以上的總精子，每張涂片的精子畸形率差異不超過20%，計(jì)算均值。

4)頂體完整率。由于頂體觀察的前處理和畸形的處理相同，故頂體的觀察和畸形同步進(jìn)行，測定要求相同。

精子頂體完整率=所觀察頂體完整的精子數(shù)/所觀察的總精子數(shù)×100%

5)質(zhì)膜完整率。質(zhì)膜完整率采用低滲腫脹法(HOST)檢測，先取適量低滲液和精液于37 ℃水浴10 min，然后按精液比低滲液為1∶10的比例混勻，于37 ℃孵育15 min，期間不時(shí)上下?lián)u晃混勻。取10 μL在顯微鏡下放大300倍，計(jì)視野下的精子總數(shù)和彎尾數(shù)，每個(gè)樣每次計(jì)200個(gè)以上總精子，根據(jù)以下公式計(jì)算彎尾率，即質(zhì)膜完整率。每個(gè)樣重復(fù)測定3次，3次間差異不超過20%，求均值。

精子質(zhì)膜完整率=彎尾精子數(shù)/精子總數(shù)×100%

1.5 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 不同稀釋粉對(duì)精液pH值的影響

不同稀釋粉稀釋后，精液pH值隨時(shí)間的變化情況見表1(由于試驗(yàn)各公豬原精的pH差異較大，且稀釋后的變化規(guī)律相似，故此處僅列其中1頭公豬精液的pH值變化情況，此公豬原精pH為7.29)。

表1 不同中效稀釋粉稀釋精液后pH值的變化Table 1 Changes of pH value of semen diluted with different medium dilution powders

各中效稀釋粉所配稀釋液的初始pH值中僅稀釋粉D呈酸性，其余8種的初始pH值均在7.00～7.40。精液稀釋后隨著保存時(shí)間的延長，pH值整體呈先小幅上升后下降的趨勢，其中稀釋粉B和I的pH最大值與最小值相差最大，變化幅度最大，稀釋粉D和G的變化幅度最小。

2.2 不同稀釋粉對(duì)精子活力的影響

由表2不同稀釋粉稀釋的精液精子活力變化情況可知，保存的第1天各稀釋粉組活力差異不顯著(P>0.05)，稀釋粉E、H、I稀釋的精液精子活力一直較高，其中稀釋粉E的活力在保存3 d后顯著高于稀釋粉C、D、F、G(P<0.05)；而稀釋粉A、B、C間差異不顯著(P>0.05)，活力僅次于稀釋粉E、H、I。稀釋粉E和I的有效保存時(shí)長最長，達(dá)10.91 d和10.33 d，顯著高于另外6種(P<0.05)，其次為稀釋粉H、C、B、A。稀釋粉D、F的有效保存時(shí)長最短，僅5.10 d和5.55 d。

表2 不同中效稀釋粉稀釋的精液精子活力的比較Table 2 Comparative analysis of the sperm motility in different medium term dilution powders %

2.3 不同稀釋粉對(duì)精子畸形率的影響

本試驗(yàn)稀釋粉對(duì)精子畸形率的評(píng)定參照國標(biāo)GB 23238—2009《豬常溫精液生產(chǎn)》中的要求執(zhí)行。根據(jù)表3中精子在不同中效稀釋粉中的畸形表現(xiàn)可發(fā)現(xiàn)，在活力有效期內(nèi)，畸形率整體呈先上升后下降的趨勢。稀釋粉C和I稀釋的精液在活力有效期內(nèi)畸形率超過20%，其中稀釋粉C除第3天低于I外，其余時(shí)間一直顯著高于另外8種(P<0.05)；稀釋粉B的畸形率僅次于C。而稀釋粉D、E、G、H稀釋的精液畸形率較低，其中稀釋粉D、E顯著低于另外4種(P<0.05)。圖1所示為經(jīng)巴氏染色后在油鏡下觀察到的正常形態(tài)精子和畸形精子。

表3 不同中效稀釋粉稀釋的精液精子畸形率Table 3 Deformity rate of sperm in different medium term dilution powders %

2.4 不同稀釋粉對(duì)精子頂體完整率的影響

由表4可看出，頂體的完整率在某個(gè)時(shí)點(diǎn)呈迅速下降，如稀釋粉B、D、G、I在保存4～6 d時(shí)頂體完整率出現(xiàn)近10%的降幅。在活力有效期內(nèi)，稀釋粉C、F、G的頂體完整率差異不顯著(P>0.05)。稀釋粉A除第2天外，頂體完整率一直最高，顯著高于稀釋粉C、D、F(P<0.05)。

表4 不同中效稀釋粉稀釋的精液精子頂體完整率Table 4 Acrosome integrity rate of sperm in different medium term dilution powders %

圖2所示為挑選的經(jīng)巴氏染色后在油鏡下觀察到的頂體完整和異常情況。

a:正常； b:梨形頭； c:尾部折斷； d:尾部卷曲； e:斷頭； f:頸部彎曲。 a:Normal； b:Pear-shaped head； c:Broken tail； d:Curled tail； e:Curled head； f:Neck bend.

a：正常； b：頂體破損； c：頂體膨脹； d：頂體全脫。 a:Normal； b:Acrosome damage； c:Acrosome expansion； d:Acrosome abscission.

2.5 不同稀釋粉對(duì)精子質(zhì)膜完整率的影響

質(zhì)膜完整率在活力有效期內(nèi)的變化見表5。其中6種稀釋粉稀釋的精液在保存4～6 d時(shí)，精子質(zhì)膜完整率出現(xiàn)集中快速下降，下降幅度超10%。在試驗(yàn)2～12 d時(shí)，稀釋粉E、H的質(zhì)膜完整率較高，其中稀釋粉H顯著高于稀釋粉D、F(P<0.05)；稀釋粉B、D、F、G的質(zhì)膜完整率較低，其中稀釋粉D的質(zhì)膜完整率顯著低于其余8種(P<0.05)。圖3所示為經(jīng)低滲液處理后的精子彎尾情況，其中尾部發(fā)生彎曲即代表質(zhì)膜正常，否則為質(zhì)膜破損。

表5 不同中效稀釋粉稀釋的精液精子質(zhì)膜完整率Table 5 Comparative analysis of the integrity rate of sperm in different medium term dilution powders %

a：發(fā)生彎尾，質(zhì)膜正常； b：尾部筆直，質(zhì)膜破損。 a：The sperm plasma membrane is normal and the tail is curved； b:The sperm plasma membrane is damaged,the tail is straight.

3 討 論

3.1 9種稀釋粉的合格率及影響因素

根據(jù)國標(biāo)GB 23238—2009《豬常溫精液生產(chǎn)》中對(duì)精液型式檢驗(yàn)合格的要求[5]，本試驗(yàn)所用的9種稀釋粉稀釋的精液在72 h內(nèi)，外觀均呈乳白色，無雜質(zhì)、精子活力和每劑量直線運(yùn)動(dòng)精子數(shù)均達(dá)國家相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)，而畸形率中除稀釋粉C稀釋的精液超20%外，其余8種均符合要求，故9種中效稀釋粉達(dá)國標(biāo)要求率為88.89%。9種稀釋粉產(chǎn)品說明中標(biāo)注的有效保存時(shí)長均≥5 d，本試驗(yàn)結(jié)果表明除稀釋粉C外，其余稀釋粉在5 d內(nèi)精液外觀、活力、每劑量直線運(yùn)動(dòng)精子數(shù)和畸形率均符合國家標(biāo)準(zhǔn)，達(dá)產(chǎn)品說明的合格率為88.89%。

3.2 不同稀釋粉對(duì)各指標(biāo)測定結(jié)果的影響

戈新等[10]認(rèn)為，精液代謝過程中產(chǎn)生的乳酸等物質(zhì)會(huì)使精液的pH值降低，對(duì)精子的長期保存不利，所以應(yīng)使用堿性稀釋液。但有研究表明精液在附睪中位于酸性環(huán)境，使其處于休眠狀態(tài)；當(dāng)射精排出體外和副性腺分泌的堿性物質(zhì)混合而復(fù)蘇變得活躍[22-24]。何蘭花等[25]研究認(rèn)為精液儲(chǔ)存的最適pH值應(yīng)為6.40；邢月超等[26]研究發(fā)現(xiàn)精液保存的最佳pH為6.40～6.50?？梢?，研究者們對(duì)豬精液稀釋液的適宜pH值并沒有統(tǒng)一的看法。雖然本試驗(yàn)用的9種稀釋粉中有88.89%呈堿性，但酸堿性稀釋粉的綜合表現(xiàn)卻各有優(yōu)劣，未能證明偏酸或偏堿綜合測定效果更好；綜合前人研究結(jié)論和本研究結(jié)果可得出，豬精液對(duì)稀釋液的pH值可能是有一定耐受性的，只要在適合的相對(duì)較大的耐受區(qū)間內(nèi)即可，而非固定的某一個(gè)值或一個(gè)較小的pH范圍。

本試驗(yàn)各稀釋粉稀釋精液后pH值變動(dòng)幅度有一定差異，可能是由于稀釋粉D、F、G、H中的緩沖物質(zhì)對(duì)穩(wěn)定pH的效果較好，而稀釋粉A、B、I略差造成的。對(duì)于稀釋保存期間pH值的波動(dòng)范圍，本試驗(yàn)結(jié)果表明效果較好的稀釋粉C、D、G，pH值的波動(dòng)范圍均較小。與邢月超等[26]發(fā)現(xiàn)精液在稀釋后pH值保持穩(wěn)定有利于精液的長期保存的研究結(jié)論相吻合。同時(shí)，本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)9種稀釋粉稀釋精液后pH值整體呈先緩慢上升后下降，這和侯麗鵬等[27]測定的3種稀釋液對(duì)精液pH值的變化結(jié)果相近。推測可能是由于精液被稀釋后，代謝產(chǎn)生的酸性物質(zhì)被稀釋液中的緩沖物質(zhì)中和，但由于緩沖物質(zhì)被激活后無法立刻失活而導(dǎo)致pH值緩慢上升，隨著保存時(shí)間的延長，緩沖物質(zhì)被完全中和，pH值隨即下降。而當(dāng)使用的緩沖物緩沖效果較好或足量時(shí)，其pH值的下降和波動(dòng)會(huì)相應(yīng)減小。

頂體和質(zhì)膜的完整率在我國現(xiàn)有相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)中均未提及，但其在評(píng)判精液質(zhì)量中的作用卻極為重要。頂體內(nèi)包含多種受精所需的酶類，包括對(duì)頂體反應(yīng)、透明帶反應(yīng)等起關(guān)鍵作用的酶類，是判斷精子是否具有受精能力的重要指標(biāo)[28]。質(zhì)膜是保護(hù)精子的重要屏障，若受損則精子內(nèi)物質(zhì)發(fā)生外流，會(huì)致精子死亡，故其與精子代謝、獲能、存活時(shí)長等直接相關(guān)[29]，二者對(duì)評(píng)定精液質(zhì)量均具有重要意義。

本試驗(yàn)結(jié)果表明，9種稀釋粉稀釋的精液頂體和質(zhì)膜完整率均存在較大差異，對(duì)應(yīng)活力和畸形率的變化可發(fā)現(xiàn)，頂體和質(zhì)膜完整率較高的稀釋粉稀釋的精液精子活力和畸形率指標(biāo)也較好；同時(shí)頂體的變化晚于活力的變化，而質(zhì)膜的變化早于活力的變化，這與耿果霞等[30]對(duì)精液質(zhì)膜完整率和活力變化的測定結(jié)果相同，與洪潔赟等[8]采用4種不同稀釋粉對(duì)稀釋精液的頂體完整率和活力變化研究結(jié)果相近。頂體位于精子頭部，較易受損；質(zhì)膜覆蓋于精子體表，是精子的“盾”，被認(rèn)為是精子儲(chǔ)存過程中最易受損的部分[24]。侯麗鵬[29]研究發(fā)現(xiàn)精子代謝產(chǎn)生的酸性物質(zhì)會(huì)對(duì)精子的頂體和質(zhì)膜造成損傷，若稀釋液不能及時(shí)中和酸性物質(zhì)，就會(huì)對(duì)精液質(zhì)量造成極大破壞。而相關(guān)研究證實(shí)添加β-環(huán)糊精[31]、路易波士的提取物[32]、曲酸和雙乙酸鈉[33]等均可以起到保護(hù)頂體和膜結(jié)構(gòu)完整性的效果。所以精子頂體和質(zhì)膜保存效果較好的稀釋粉中可能添加了起到特殊保護(hù)作用的物質(zhì)，保存效果較差的稀釋粉可能因?yàn)橹泻痛x酸的物質(zhì)不足或效果較差。而精子的頂體和質(zhì)膜在保存期的某個(gè)時(shí)段快速下降，推測可能由于部分保護(hù)劑含量和效果有限，或ROS積累到一定濃度，從而對(duì)精子質(zhì)膜和頂體產(chǎn)生了集中性破壞造成的。

3.3 各稀釋粉的綜合選擇建議

在許多豬場技術(shù)員和配種員觀念中，常溫保存的豬精液有效期只有3～5 d。而本試驗(yàn)中的中效稀釋粉E、H有效保存時(shí)長均超過10 d，且各測定指標(biāo)表現(xiàn)均較好。通過對(duì)一種稀釋粉稀釋精液質(zhì)量的長期測定，其最適輸精時(shí)段可以得到準(zhǔn)確把握，配種員應(yīng)摒棄對(duì)豬常溫精液的傳統(tǒng)認(rèn)識(shí)，這將有利于豬場效益的穩(wěn)定和提升。

本試驗(yàn)的結(jié)果表明，所選9種中效稀釋粉的綜合合格率達(dá)88.89%，但企業(yè)在選擇稀釋粉時(shí)仍應(yīng)持謹(jǐn)慎態(tài)度。本試驗(yàn)通過測定9種中效稀釋粉對(duì)豬精液常溫保存期間pH值、活力、畸形率以及頂體和質(zhì)膜完整率的變化，發(fā)現(xiàn)部分稀釋粉的效果不容樂觀。若有條件，企業(yè)可定期對(duì)稀釋粉稀釋精液后的多項(xiàng)指標(biāo)變化情況進(jìn)行綜合測定，特別是精子畸形率和質(zhì)膜完整率。通過對(duì)稀釋粉稀釋精液常溫保存整體效果的評(píng)測，選擇最適稀釋粉，避免單一指標(biāo)評(píng)估降低準(zhǔn)確性，可以有效提升豬常溫精液質(zhì)量，從而更好地提升豬場的效率和效益。