周文燕 ，黃琪琳，翁武銀

1.華中農(nóng)業(yè)大學食品科學技術(shù)學院，武漢 430070； 2.集美大學食品與生物工程學院，廈門 361013

魚糜制品因其富含優(yōu)質(zhì)蛋白和氨基酸，具有極高的營養(yǎng)價值和細嫩的口感，在世界范圍內(nèi)廣受歡迎，其需求量逐年在不斷增加[1-4]。到2019年，我國水產(chǎn)加工品總量2 171.41萬t，在海水加工產(chǎn)品中，魚糜制品產(chǎn)量約139.40萬t[5]。鰱(Hypophthalmichthysmolitrix)產(chǎn)量高，價格低廉，肉質(zhì)鮮嫩，是用于生產(chǎn)魚糜的主要淡水魚[6]。然而，在魚糜生產(chǎn)過程中，需用大量水多次漂洗魚肉以去除殘留的血液、脂質(zhì)、水溶性蛋白和肌膜等雜質(zhì)[7]，一方面會使占魚肉蛋白20%～40%的水溶性肌漿蛋白在漂洗過程中流失，造成資源的嚴重浪費[8-10]；另一方面產(chǎn)生了大量富含蛋白的漂洗廢水需要進行處理，否則會造成水體的富營養(yǎng)化。因此，若能將魚糜漂洗液中的肌漿蛋白充分回收，既能提升肌漿蛋白利用率和魚制品的附加值，又能降低漂洗廢水中的有機污染物，降低處理成本，從而產(chǎn)生良好的經(jīng)濟價值和環(huán)境效益。

殼聚糖是一種直鏈型天然高分子聚合物，其主鏈含有豐富的氨基，在酸性介質(zhì)中會質(zhì)子化，表現(xiàn)為典型的陽離子聚電解質(zhì)特征，賦予殼聚糖良好的絮凝性能[11-13]。此外，殼聚糖還兼具良好的生物相容性和可降解性，使其在廢水處理中得到廣泛的使用[14]。然而，殼聚糖在中性或堿性水溶液中的溶解性差，阻礙了其使用[15-16]，因此，單獨采用殼聚糖絮凝魚糜漂洗液中的肌漿蛋白，其回收率較低，僅在40%～50%[17-19]。近期熱度較高的殼聚糖-海藻酸鈉混合絮凝法[20-21]和等電點-絮凝劑復合法[22]用于絮凝魚糜漂洗液蛋白，回收率有所提高，但過程相對復雜，工業(yè)化難度較高[23]。因此，如何提升殼聚糖對肌漿蛋白的絮凝效果，提高蛋白質(zhì)回收率成為亟待解決的問題。本研究以提高肌漿蛋白回收率為目標，先調(diào)節(jié)pH再結(jié)合殼聚糖絮凝法回收鰱魚糜漂洗液中肌漿蛋白，并通過單因素試驗及Box-Bechnken中心組合設計優(yōu)化肌漿蛋白的回收工藝，以期為肌漿蛋白的綜合利用奠定基礎，并為魚糜生產(chǎn)中廢水的凈化處理提供指導。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鰱，購于華中農(nóng)業(yè)大學農(nóng)貿(mào)市場；殼聚糖，北京酷來搏科技有限公司；牛血清蛋白標品，Sigma aldrich 公司；硫酸銅、酒石酸鉀鈉、碳酸鈉、氫氧化鈉、鹽酸、福林酚試劑等均為國產(chǎn)分析純，國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

3205型食品調(diào)理機，德國博朗公司；HH-6型數(shù)顯恒溫水浴鍋，國華電器有限公司；FJ-200型高速分散均質(zhì)機，上海標本模型廠；Avanti J-26xp型高速冷凍離心機，貝克曼庫爾特有限公司；臺面式pH測試儀，美國奧利龍公司；UV-1750型紫外可見分光光度計，日本島津公司。

1.3 魚糜漂洗液的制備

新鮮鰱敲暈，去頭去尾去魚皮去內(nèi)臟，手工采肉，用調(diào)理機絞碎，稱取魚肉質(zhì)量。取魚肉以1∶3質(zhì)量比加蒸餾水混合，經(jīng)均質(zhì)后在8 000 r/min、4 ℃條件下離心15 min，取上清液作為模擬魚糜漂洗水，于4 ℃條件下儲藏備用[24]。

1.4 單一殼聚糖絮凝法回收肌漿蛋白

取3支離心管，量取40 mL魚糜漂洗液，依次與1.2 mL脫乙酰度為85%、90%、95%的1% 殼聚糖溶液混合。隨后用3 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié) pH值至7.0。20 ℃水浴90 min后，4 000 r/min離心10 min，取上清液測蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度。

1.5 鹽酸-殼聚糖絮凝耦合處理回收肌漿蛋白

取3支離心管，量取40 mL魚糜漂洗液，依次與1.2 mL脫乙酰度為85%、90%、95%的1%殼聚糖溶液混合。事先采用3 mol/L HCl溶液調(diào)節(jié)pH值至3.0，隨后用3 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值至7.0。20 ℃水浴90 min后，4 000 r/min離心10 min，取上清液測蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度。

1.6 單因素試驗

量取40 mL魚糜漂洗液，與一定體積(0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6 mL)殼聚糖溶液混合，事先采用3 mol/L HCl溶液調(diào)節(jié)pH值至3.0，隨后用3 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值至一定值(4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0)。放入一定溫度(10、20、30、40、50、60、70 ℃)的水浴鍋中靜置一定時間(30、60、90、120、150、180、210 min)后，4 000 r/min離心10 min，取上清液測蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度。

1.7 響應面優(yōu)化試驗

在單因素試驗的基礎上，固定時間90 min，根據(jù)中心組合設計原理選擇pH、殼聚糖用量、溫度共3個因素進行響應面優(yōu)化試驗，確定回收肌漿蛋白的最佳工藝。

1.8 蛋白質(zhì)回收率

蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度按照福林酚法測定，回收率計算方法如下：

(1)

式(1)中，C0為原始漂洗液蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度，mg/mL；C1為上清液蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度，mg/mL。

1.9 化學需氧量(COD)的去除率

化學需氧量(COD)根據(jù)國家標準GB/T 15456-2019《工業(yè)循環(huán)冷卻水中化學需氧量(COD)的測定 高錳酸鹽指數(shù)法》[25]測定。COD去除率計算公式如下：

(2)

式(2)中，X0為原始漂洗液COD值，mg/L；X1為上清液COD值，mg/L。

1.10 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

運用Origin和Design-expert 8.0.6軟件對數(shù)據(jù)進行分析和處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 單一殼聚糖絮凝法回收肌漿蛋白

由圖1可見，3種脫乙酰度殼聚糖回收肌漿蛋白的回收率依次為：95%脫乙酰度>90%脫乙酰度>85%脫乙酰度。脫乙酰度的增加會導致氨基增多，從而質(zhì)子化后正電荷密度增加，提高了電荷中和效果，使得殼聚糖具有更佳的絮凝效果。因此，后續(xù)試驗選擇脫乙酰度為95%的殼聚糖。同時，通過單一的95%脫乙酰度殼聚糖絮凝法所得的肌漿蛋白質(zhì)回收率為35%左右。

不同字母標注數(shù)值間差異顯著(P<0.05),下同。There is significant difference between the groups marked with different letters (P<0.05),the same as below.

2.2 鹽酸-殼聚糖絮凝耦合處理回收肌漿蛋白

鹽酸-殼聚糖絮凝耦合處理回收肌漿蛋白結(jié)果如圖2所示。鹽酸處理能夠顯著提高殼聚糖作為單一絮凝劑時的絮凝效果，肌漿蛋白回收率高達81.54%。相較于單一殼聚糖絮凝法，蛋白質(zhì)回收率提高了46.02%。由此可見，鹽酸處理(pH3.0)在殼聚糖絮凝回收魚糜漂洗液中蛋白時起著至關重要的作用，原因是經(jīng)鹽酸處理后殼聚糖質(zhì)子化帶正電荷，具有良好的水溶性，并與肌漿蛋白充分互溶；隨后pH值升高，蛋白質(zhì)分子逐漸解離成電負態(tài)，迅速與帶正電的殼聚糖發(fā)生靜電吸引而絮凝，共同沉降下來。

圖2 鹽酸-殼聚糖絮凝耦合處理對蛋白質(zhì)回收率的影響Fig.2 Effect of hydrochloric acid-chitosan flocculation coupling treatment on protein recovery

2.3 不同pH值處理的肌漿蛋白回收率變化

pH值對蛋白質(zhì)回收率的影響如圖3所示。pH值對殼聚糖絮凝過程具有較為顯著的影響。當pH值較低時，蛋白質(zhì)回收率隨pH值升高有明顯上升趨勢，并在pH 7.0處達到最大值。而隨著pH值的進一步增加，肌漿蛋白回收率開始逐漸下降，這可能是由于蛋白質(zhì)在堿性條件下溶解度提高所導致。

圖3 pH值對蛋白質(zhì)回收率的影響Fig.3 Effects of pH value on protein recovery

2.4 不同殼聚糖用量處理的肌漿蛋白回收率變化

殼聚糖用量對蛋白質(zhì)回收率的影響如圖4所示。當殼聚糖用量較低時，蛋白質(zhì)回收率隨絮凝劑用量的增加而逐漸上升，在殼聚糖用量為300 mg/L時，蛋白質(zhì)回收率達到最大值，但殼聚糖用量過多會阻礙其余蛋白質(zhì)的絮凝，從而導致蛋白絮凝回收率有逐漸下降趨勢。

圖4 殼聚糖用量對蛋白質(zhì)回收率的影響Fig.4 Effects of chitosan dosage on protein recovery

2.5 不同溫度處理的肌漿蛋白回收率變化

溫度對蛋白質(zhì)回收率的影響如圖5所示。當溫度在10～30 ℃時，回收率隨溫度先升高后下降，并在20 ℃時有一個相對較高的回收率。當溫度超過30 ℃時，蛋白質(zhì)回收率呈上升趨勢?？傮w而言，溫度高意味著較多的能耗，而換取的回收率增加幅度不大，因此，絮凝過程的最佳溫度應選擇20 ℃。

圖5 溫度對蛋白質(zhì)回收率的影響Fig.5 Effects of temperature on protein recovery

2.6 不同時間處理的肌漿蛋白回收率變化

時間對蛋白質(zhì)回收率的影響如圖6所示。隨著絮凝時間的延長，蛋白質(zhì)回收率先呈增加的趨勢，在90 min處達到最大值，之后回收率降低?？赡艿脑蚴窃谛跄跗?，殼聚糖與蛋白質(zhì)未充分螯合并絮凝形成沉淀；而絮凝時間過長，蛋白質(zhì)回收率有下降趨勢，原因可能是絮凝聚集體出現(xiàn)解聚現(xiàn)象。

圖6 時間對蛋白質(zhì)回收率的影響Fig.6 Effects of time on protein recovery

2.7 響應面試驗結(jié)果與分析

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，絮凝時間設定為90 min。分別設pH值(A)、溫度(B)、殼聚糖用量(C)共3個考察因素，以蛋白質(zhì)總回收率(Y)為響應值，進行響應面優(yōu)化試驗，結(jié)果見表1。對響應面試驗結(jié)果進行擬合分析，得回歸方程：Y=84.08-1.13A-0.12B+0.24C-0.17AB+1.08AC-0.082BC-0.072B2-0.39C2。

表1 Box-Bechnken 試驗設計及結(jié)果Table 1 Box-Bechnken design and results

表2 回歸方程的方差分析結(jié)果Table 2 Analysis of variance of regression model

通過回歸方程可知，二次項系數(shù)為負值，表明方程具有最大值。根據(jù)響應面Design-Expert軟件分析得出預測最優(yōu)條件為：pH 6.5、溫度29.45 ℃、殼聚糖用量250 mg/L，預測蛋白質(zhì)回收率85.72%。

2.8 驗證試驗結(jié)果

根據(jù)模型優(yōu)化結(jié)果及實際條件，設置初始pH 6.5、溫度30 ℃、殼聚糖用量250 mg/L，時間90 min為絮凝條件，對優(yōu)化結(jié)果進一步進行驗證，重復3次試驗，取平均值。采用預測的最優(yōu)試驗條件進行試驗，得到的實際蛋白質(zhì)回收率為85.23%，與預測值85.72%吻合較好，表明優(yōu)化模型可靠。

2.9 COD測定結(jié)果

經(jīng)最優(yōu)絮凝條件處理后，魚糜漂洗液COD值為179.98 mg/L，COD去除率達73.32%，剩余26.68%未去除的化學需氧量可能源于殘留蛋白、漂洗液中的脂肪、色素和其他有機物。由此可見，酸處理在提高殼聚糖絮凝蛋白效果的同時，也可加大其對魚糜漂洗液中化學需氧量的去除。

3 討 論

魚糜漂洗液中肌漿蛋白等電點集中于5.5左右[23-24]，溶液pH值接近蛋白質(zhì)等電點時會發(fā)生蛋白質(zhì)等電點沉淀現(xiàn)象，這在一定程度上也提高了蛋白質(zhì)的回收率。而當溶液pH值較低時，蛋白質(zhì)帶正電，而殼聚糖的氨基在酸性溶液中質(zhì)子化使殼聚糖帶正電，兩者的靜電排斥效應賦予系統(tǒng)的相對動態(tài)穩(wěn)定性[26]，從而導致回收率較低；一旦超過最適pH時，蛋白質(zhì)在堿性環(huán)境下增溶[27-28]，使其回收率下降。殼聚糖用量也是影響蛋白質(zhì)回收率的一個重要因素，在絮凝過程中，隨著殼聚糖含量增加，殼聚糖與蛋白質(zhì)能夠有效地進行電荷中和、橋連作用和靜電相互作用而聚集沉降，并在zeta電位為零時達到最佳的絮凝效果[12]。但殼聚糖用量過多，蛋白質(zhì)絮凝回收率有下降趨勢，據(jù)文獻報道，殼聚糖在溶液總體呈電中性時出現(xiàn)較高的絮凝度，但溶液偏離電中性導致蛋白質(zhì)回收率下降[29]。此外，肌漿蛋白的變性溫度為40 ℃左右[24]，因此，溫度較高會使蛋白質(zhì)發(fā)生熱變性，空間結(jié)構(gòu)被破壞而失穩(wěn)沉淀[30-31]。

為回收魚糜漂洗廢水中的肌漿蛋白從而達到凈化水體、提高環(huán)境效益的目的，本研究采用鹽酸-殼聚糖絮凝耦合處理回收魚糜漂洗液中肌漿蛋白，以提高殼聚糖的絮凝效率。結(jié)果顯示：相對于傳統(tǒng)殼聚糖絮凝法，鹽酸處理可以很好地提高殼聚糖對肌漿蛋白的回收率，其作用原理源于在酸性溶液中殼聚糖質(zhì)子化帶正電荷，具有良好的溶解性，可以與肌漿蛋白充分相容；當pH值升高時，蛋白質(zhì)分子逐漸解離成電負態(tài)，容易迅速與帶正電的殼聚糖發(fā)生靜電吸引而絮凝、沉降下來。與此同時，伴隨著蛋白質(zhì)的等電點沉淀在一定程度上提高了蛋白質(zhì)的回收率。

陳慶全等[18]選用殼聚糖作為絮凝劑回收羅非魚魚糜漂洗液蛋白，在pH 7.0、殼聚糖2.13 mg/mL、溫度30 ℃的條件下絮凝90 min，蛋白質(zhì)回收率47.28%。薛超軼等[19]采用殼聚糖作為絮凝劑回收魚糜漂洗液蛋白，通過工藝優(yōu)化所得蛋白質(zhì)回收率為50.79%。靳挺等[17]采用單一殼聚糖絮凝法獲得的蛋白質(zhì)回收率在40%左右，COD去除率僅為22.73%。齊祥明等[23]采用殼聚糖絮凝回收分級等電沉淀后魚糜漂洗液中蛋白時，COD總?cè)コ蕿?6.1%。本研究通過單因素試驗及Box-Bechnken中心組合設計試驗優(yōu)化蛋白回收工藝，確定魚糜漂洗液中肌漿蛋白的最佳回收工藝為：pH 6.5、溫度30 ℃、殼聚糖用量250 mg/L、時間90 min，此條件下得到的蛋白質(zhì)回收率為85.23%，同時COD去除率高達73.32%。且此方法引入魚糜漂洗液中的NaCl質(zhì)量分數(shù)為0.006%，不會增加后續(xù)廢水處理成本，具有一定的可行性。