付 雨，王新新，劉 晗，項(xiàng)舒雅，王雪晶,丁雪冰

1)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科 鄭州 450052 2)河南省高等學(xué)校臨床醫(yī)學(xué)重點(diǎn)學(xué)科開放實(shí)驗(yàn)室 鄭州 450052

單純皰疹病毒腦炎(herpes simplex virus encephalitis，HSE)是由單純皰疹病毒(herpes simplex virus，HSV)感染引起的一種急性中樞神經(jīng)系統(tǒng)(central nervous system，CNS)感染性疾病，是CNS最常見的病毒感染性疾病[1]，全球發(fā)病率為0.02‰～0.04‰[2]。該病病死率及致殘率較高，且后遺癥較多，預(yù)后較差[3]。近年來，腸道炎癥與中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的關(guān)系被廣泛認(rèn)知[4]。有研究[5]證實(shí)腸道炎癥可通過腸-腦軸激活小膠質(zhì)細(xì)胞，促進(jìn)其分泌炎癥因子，進(jìn)而增加血腦屏障(bood-brain barrier，BBB)通透性，加重BBB功能障礙。但目前，HSE患者腸道炎癥改變尚不明確，且評估其預(yù)后的方式有限。本研究通過ELLSA法測定了HSE患者糞便中炎癥相關(guān)指標(biāo)[糞鈣衛(wèi)蛋白(fecal calprotectin,FC)、糞α-1-抗胰蛋白酶(fecal alpha-1-antitrypsin,FAT)、糞連蛋白(fecal zonulin,FZ)、糞乳鐵蛋白(fecal lactoferrin,FLF)]及血清中炎癥相關(guān)指標(biāo)[脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)、脂多糖結(jié)合蛋白(lipopolysaccharide binding protein,LBP)]的水平，并對部分HSE患者進(jìn)行腸黏膜活檢，評估腸道炎癥在HSE中的作用，探索HSE潛在的治療策略。

1 對象與方法

1.1研究對象收集2018年9月至2020年5月鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科收治的65例由兩位神經(jīng)科專家根據(jù)臨床表現(xiàn)及各項(xiàng)輔助檢查確診的HSE患者。研究納入標(biāo)準(zhǔn)：①有典型HSE臨床表現(xiàn)且腦脊液單純皰疹病毒抗體陽性。②同意配合糞便樣本及血液樣本檢測，并簽署知情同意書。③在發(fā)作的急性期采集糞便及血液標(biāo)本。排除標(biāo)準(zhǔn)：①近3個(gè)月內(nèi)曾使用抗病毒、抗菌類藥物、益生菌類藥物、激素類藥物等。②既往有胃腸道疾病史、內(nèi)分泌系統(tǒng)疾病史、肝臟疾病史、心腦血管疾病史、重金屬中毒史等[6]。65例中男33例，女32例，年齡26～49(40.6±15.4)歲。根據(jù)入院時(shí)改良Ranking量表(mRS)評分將HSE患者分為輕度神經(jīng)功能障礙組(A組，mRS評分為1或2分，n=11)、中度神經(jīng)功能障礙組(B組，mRS評分為3或4分，n=15)和嚴(yán)重神經(jīng)功能障礙組(C組，mRS評分為5分，n=39)。選取同期65名健康對照者，均自愿參與本研究，且均為患者直系親屬、配偶或處于共同生活環(huán)境者，其中男32例，女33例，年齡28～52(49.5±11.8)歲。各組在性別、年齡、體重、職業(yè)、既往史等方面均衡，組間比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2分析指標(biāo)

1.2.1 臨床特征 收集研究對象的臨床信息，包括姓名、性別、年齡、體重、職業(yè)、既往史、入院時(shí)mRS評分。

1.2.2 糞便及血液標(biāo)本的收集及檢驗(yàn) 收集HSE患者急性發(fā)作期(治療前)糞便標(biāo)本(1 g)，加入9 g中性磷酸鹽緩沖液(Life Technologies公司)，用勻漿器充分勻漿，3 000 r/min離心10 min后取上清液，分裝并置于-80 ℃冰箱待檢，于2 h內(nèi)送檢。收集HSE患者急性發(fā)作期(治療前)肘部靜脈血10 mL，3 000 r/min離心10 min后取上清液，分裝并置于-80 ℃冰箱待檢，于2 h內(nèi)送檢。健康對照者留取晨起首次糞便標(biāo)本及靜脈血，處理同上。糞便中FC、FAT、FZ、FLF和血清中LPS、LBP水平均采用ELLSA法檢測，試劑盒購自武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司及南京建成生物工程研究所。實(shí)驗(yàn)操作步驟嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.2.3 電子結(jié)腸鏡及腸黏膜組織病理學(xué)分析 A、B、C 3組各有2例及5名健康對照者接受電子結(jié)腸鏡及腸黏膜組織病理學(xué)檢查，并簽署相關(guān)知情同意書。電子結(jié)腸鏡檢查由同一位內(nèi)鏡醫(yī)師完成。檢查前清潔腸道，檢查中取2～3塊黏膜粗糙處組織，首先將組織固定于體積分?jǐn)?shù)4%甲醛溶液中，常規(guī)脫水、石蠟包埋、4 μm厚切片、常規(guī)HE染色，普通顯微鏡下觀察。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 26.0對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。應(yīng)用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)比較HSE組與健康對照組LPS、LBP、FC、FAT、FZ和FLF水平的差異，應(yīng)用單因素方差分析和LSD-t檢驗(yàn)比較3組HSE患者LPS、LBP、FC、FAT、FZ、FLF水平的差異。應(yīng)用Pearson分析HSE患者血清LPS、LBP與糞便FC、FAT、FZ、FLF之間的相關(guān)性。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1HSE組與健康對照組LPS、LBP、FC、FAT、FZ和FLF水平比較見表1。

表1 HSE組與健康對照組LPS、LBP、FC、FAT、FZ和FLF水平比較

2.2A、B、C3組HSE患者LPS、LBP、FC、FAT、FZ、FLF水平比較見表2。

表2 A、B、C 3組HSE患者LPS、LBP、FC、FAT、FZ、FLF水平比較

2.3HSE患者血清LPS、LBP水平與糞便FC、FAT、FZ、FLF水平之間的相關(guān)性分析見表3。

表3 HSE患者血清LPS、LBP水平與糞便FC、FAT、FZ、FLF水平之間的相關(guān)性分析

2.4腸黏膜組織病理學(xué)結(jié)果6例HSE患者腸黏膜均顯示出不同程度的黏膜慢性炎癥，間質(zhì)伴有不同程度的淋巴細(xì)胞、漿細(xì)胞及中性粒細(xì)胞浸潤，腺體輕度反應(yīng)性增生，少許腺體破壞、變形；5例健康對照者腸道黏膜組織病理學(xué)未見明顯異常。見圖1。

A：C組HSE患者；B：健康對照者

3 討論

近年來，隨著腸-腦軸的發(fā)現(xiàn)[7]，腸道炎癥被證實(shí)與多種中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病相關(guān)[8-9]。HSE是全球散發(fā)性壞死性腦炎最常見的疾病之一，其發(fā)病原因與HSV感染相關(guān)[10]。HSV優(yōu)先潛伏在周圍神經(jīng)節(jié)，各種刺激均可誘發(fā)病毒的激活，但病毒進(jìn)入CNS的具體機(jī)制尚不明確，目前普遍被接受的病毒入侵途徑包括神經(jīng)軸突運(yùn)輸和血行播散等[11]，而腸道炎癥反應(yīng)可能是病毒入腦的環(huán)境因素之一。

腸道與神經(jīng)元之間存在復(fù)雜的相互關(guān)系，兩者可通過免疫反應(yīng)、細(xì)胞因子及激素的釋放等方式形成雙向信號傳遞[12-14]。既往研究[15-16]認(rèn)為腸道炎癥反應(yīng)時(shí)腸黏膜通透性的增加可引起腸道菌群移位，間接引起CNS先天性和適應(yīng)性免疫應(yīng)答反應(yīng)，導(dǎo)致腦組織損傷。一些菌群代謝產(chǎn)物如短鏈脂肪酸也可直接穿過BBB影響大腦功能。此外，腸道固有層中存在大量γδ T細(xì)胞，這些細(xì)胞在腸道炎癥反應(yīng)時(shí)可分泌IL-17等炎癥因子，加重腦組織損傷[17]，與此同時(shí)還可能引發(fā)肺炎、敗血癥等感染性疾病。相反，CNS的損傷對腸道亦有一定的影響，比如通過激活腸道免疫反應(yīng)，引起肥大細(xì)胞釋放組胺等炎癥介質(zhì)，促進(jìn)腸黏膜上皮細(xì)胞的凋亡及杯狀細(xì)胞的減少等一系列反應(yīng)，最終使腸黏膜通透性增加，從而形成惡性循環(huán)[18]。

腸道炎癥反應(yīng)可促進(jìn)LPS的分泌及移位，LPS是革蘭陰性菌細(xì)胞壁的主要成分，是一種內(nèi)毒素，在LBP作用下與靶細(xì)胞受體結(jié)合產(chǎn)生一系列反應(yīng)[19]。LPS可激活酪氨酸激酶家族EphrinA1/EphA2信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，降低腸緊密連接蛋白Zoccludin和ZO-1的表達(dá)，導(dǎo)致腸屏障功能受損，進(jìn)而加重腸道炎癥反應(yīng)[20-21]。LPS也具有一定的神經(jīng)毒性，在腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞中存在的LPS跨膜受體——Toll樣受體，可將LPS的刺激信號向細(xì)胞內(nèi)傳遞，導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞損傷，進(jìn)而增加BBB通透性，誘發(fā)腦水腫，加重CNS炎癥反應(yīng)[22]。BBB通透性增加后可促進(jìn)神經(jīng)毒素及病原體微生物入腦，進(jìn)一步推動(dòng)HSE的發(fā)病及病情進(jìn)展。除此之外， LPS可刺激白細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生促炎因子，如白介素、TNF-α、前列腺素等，引發(fā)炎癥級聯(lián)反應(yīng)，加重全身感染，最終導(dǎo)致休克或死亡[23-25]。

目前，大量文獻(xiàn)[9,26-27]報(bào)道腸道炎癥在中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病中起到某種促進(jìn)作用：一方面腸道炎癥反應(yīng)可激活腸-腦軸，最終導(dǎo)致BBB通透性增高和功能障礙，加速病毒及炎性因子入腦；另一方面，腸道炎癥間接促進(jìn)血清LPS和LBP的分泌，進(jìn)一步促進(jìn)全身炎癥反應(yīng)的發(fā)生，甚至形成全身級聯(lián)炎癥反應(yīng)，加快疾病的進(jìn)展。FC、FAT和FZ是反映腸道炎癥及腸黏膜通透性的重要指標(biāo)，且其水平與腸道炎癥嚴(yán)重程度呈正相關(guān)。本研究結(jié)果顯示，6例HSE患者腸黏膜活檢均顯示不同程度的炎癥反應(yīng)，HSE患者糞便中腸道炎癥指標(biāo)水平增高，且嚴(yán)重神經(jīng)功能障礙組>中度神經(jīng)功能障礙組，中度神經(jīng)功能障礙組>輕度神經(jīng)功能障礙組。表明腸道炎癥可能參與了HSE的發(fā)病及病情進(jìn)展，且腸道炎癥嚴(yán)重程度可間接預(yù)警HSE患者的病情嚴(yán)重程度，但具體機(jī)制仍需大量研究證實(shí)。

綜上所述，腸道炎癥與HSE相關(guān)，動(dòng)態(tài)監(jiān)測糞便FC、FAT和FZ及血清LPS、LBP的變化可能對HSE患者病情評估起到一定預(yù)警作用。而減輕腸道炎癥反應(yīng)可能成為改善HSE患者病情的新的切入點(diǎn)。本研究的不足之處在于研究樣本量較小，故腸道炎癥反應(yīng)在HSE發(fā)病及病情進(jìn)展中的作用有待擴(kuò)大樣本量進(jìn)一步研究證實(shí)。